大棚玉米誘導(dǎo)小麥單倍體育種關(guān)鍵技術(shù)研究

劉瑩 張小娟 凌冬 左珍喜 譚靖 王立峰

摘要 為提高大棚玉米誘導(dǎo)小麥單倍體技術(shù)在襄陽(yáng)地區(qū)小麥育種中的應(yīng)用，研究了小麥去雄授粉技術(shù)、小麥雜交穗離體培養(yǎng)技術(shù)、大棚玉米栽培技術(shù)等關(guān)鍵技術(shù)。結(jié)果表明， “整穗+嫩齡剪藥”得胚率可達(dá)31.3%，比常規(guī)去雄法增加8.2%，前者可作為一種高效去雄技術(shù)在小麥單倍體育種中進(jìn)行推廣應(yīng)用;利用人工氣候箱進(jìn)行離體穗培養(yǎng)，2個(gè)批次的得胚率分別為24.3%和23.9%，比在大棚自然條件下的得胚率分別增加4.9%和8.2%，因此前者更適于進(jìn)行雜交穗的離體培養(yǎng);2020年暖冬氣候條件下大棚玉米異常健壯，得胚率較以往年份顯著提高，說(shuō)明充足的光照和較高的積溫可有效提高現(xiàn)有大棚玉米的生長(zhǎng)健壯程度，進(jìn)而影響玉米花粉對(duì)小麥單倍體胚的誘導(dǎo)頻率。

關(guān)鍵詞 大棚玉米;小麥單倍體;剪藥;人工氣候箱;健壯玉米

中圖分類號(hào) S512.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）05-0053-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.014

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Key Techniques of Wheat Haploid Breeding by Greenhouse Maize Induction

LIU Ying， ZHANG Xiao-juan， LING Dong et al

（Xiangyang Academy of Agricultural Sciences， Xiangyang， Hubei 441057）

Abstract In order to improve the application of wheat haploid technology induced by greenhouse maize in wheat breeding in Xiangyang region， we researched on the wheat emasculation method， wheat hybrid panicle in vitro culture technology and greenhouse maize cultivation technology.The results showed that the rate of embryos obtained by ‘cutting anther at young age could reach 31.3%， an increase of 8.2% compared with the conventional emasculation method.The former method could be promoted as a high-efficiency emasculation technique in wheat haploid breeding application.By using artificial climate box for in vitro spike culture， the embryo yields of the two batches were 24.3% and 23.9%， respectively， increased by 4.9% and 8.2% respectively compared with those in the greenhouse.The results revealed that artificial climate box was more suitable for in vitro culture of hybrid ears.Maize in greenhouses was exceptionally strong under warm winter in 2020， and embryo yield was significantly higher than that in previous years， indicating that sufficient light and higher accumulated temperature could effectively improve the growth of maize in existing greenhouses.The degree of maize robustness， in turn， affected the frequency of maize pollen induction of wheat haploid embryos.

Key words Greenhouse maize;Wheat haploid;Cutting anther;Artificial climate box;Robust maize

1986年Laurie等[1]首次報(bào)道利用玉米花粉誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生了單倍體植株;陳新民等[2]自1992年進(jìn)行小麥×玉米產(chǎn)生小麥單倍體和雙單倍體的技術(shù)研究，在國(guó)內(nèi)率先建立了利用小麥與玉米雜交產(chǎn)生小麥雙單倍體技術(shù)體系，并利用該技術(shù)首先培育了小麥新品種[3-4];顧堅(jiān)等[5]自2000年開(kāi)始對(duì)小麥玉米遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生小麥單倍體進(jìn)行了深入研究，利用云南昆明全年有近180 d可開(kāi)展小麥玉米雜交的有利條件，通過(guò)8年的研究與實(shí)踐，主要技術(shù)指標(biāo)達(dá)到國(guó)內(nèi)外同類研究的較好水平，建立了一套產(chǎn)生小麥單倍體的技術(shù)體系，并且已在小麥品種的選育中應(yīng)用，使云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院成為國(guó)內(nèi)外極少數(shù)能大量產(chǎn)生小麥單倍體的單位之一，為開(kāi)展小麥單倍體育種奠定了基礎(chǔ)。襄陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院于2008年開(kāi)始進(jìn)行小麥玉米遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)小麥單倍體技術(shù)研究，分別嘗試了夏播小麥、秋播小麥與同季玉米的遠(yuǎn)緣雜交，形成了一套秋播小麥與溫室反季節(jié)玉米雜交誘導(dǎo)小麥單倍體的技術(shù)體系，并于2011年首次提出建立矮敗小麥結(jié)合單倍體育種的矮敗小麥高效育種生物技術(shù)新體系[6]。鑒于此，筆者結(jié)合襄陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院近10年來(lái)的研究結(jié)果與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)一些瓶頸技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行了探索與總結(jié)，主要包括簡(jiǎn)易去雄方法、雜交穗離體授粉與培養(yǎng)技術(shù)以及冬季大棚玉米栽培要點(diǎn)等關(guān)鍵性技術(shù)，為小麥×玉米單倍體誘導(dǎo)技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)閱伪扼w育種技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料為半春性小麥雜交世代材料，包括小麥F 1、F 2代和矮敗小麥可育株。玉米材料為甜糯玉米品種“廣甜糯1號(hào)”。

1.2 小麥材料去雄

筆者于2020年春對(duì)F2-6號(hào)材料的25個(gè)麥穗采用了常規(guī)整穗+去雄法;對(duì)48個(gè)麥穗采用整穗+嫩齡剪藥法替代了常規(guī)去雄法，選擇開(kāi)花前7 d的麥穗先整穗，去掉中間小花，僅保留基部2朵小花，剪藥時(shí)從小花最膨大處入手，斜向上45°角剪去穎殼，3個(gè)花粉囊同時(shí)被剪破，此時(shí)可見(jiàn)柱頭羽狀體不明顯，毛刷尚未大幅展開(kāi)。

1.3 雜交穗的離體授粉及穗培養(yǎng)

去雄麥穗授粉前即從基部剪斷，從大田轉(zhuǎn)移至玉米大棚等待授粉。授粉前將所有麥穗的葉片輕輕捋下，防止沾染花粉。用30 cm×50 cm的羊皮紙袋盛裝新鮮玉米花粉，將100～150個(gè)麥穗捆成1捆，一起放入裝有花粉的羊皮紙袋，扎緊袋口使勁搖晃，使玉米花粉在封閉空間內(nèi)劇烈振蕩給小麥均勻授粉。

完成雜交授粉的麥穗置入含有營(yíng)養(yǎng)液的桶中，其中21個(gè)麥穗放在大棚通風(fēng)處進(jìn)行穗培養(yǎng)（中午棚內(nèi)溫度太高采用半遮陰降溫），其余25個(gè)麥穗放在人工氣候箱中培養(yǎng)（溫度23 ℃，濕度RH 75%）。14 d后將麥穗取出，剝?nèi)∽蚜?，消毒后在超凈工作臺(tái)無(wú)菌條件下剝出幼胚，統(tǒng)計(jì)得胚數(shù)。

1.4 冬季大棚玉米的栽培

玻璃溫室內(nèi)設(shè)塑料大棚，長(zhǎng)17.0 m，寬3.8 m，拱形棚頂高2.3～2.7 m。

采用2個(gè)大功率暖風(fēng)機(jī)滿足棚內(nèi)溫度條件的需要，在棚頂每隔1 m安裝1盞36 W的植物生長(zhǎng)燈用于補(bǔ)給棚內(nèi)的光照，共計(jì)12盞。

玉米采用覆膜點(diǎn)播，施足底肥，大喇叭口期追施尿素，揚(yáng)花期為防倒伏，用竹竿固定玉米植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同去雄方法的比較 試驗(yàn)采用了2種不同的去雄方法，常規(guī)法為先整穗后人工去雄，剪藥法為先整穗后剪破花藥，比較不同去雄處理?xiàng)l件下得胚率的差異，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，不同時(shí)期處理麥穗對(duì)得胚率影響較大。3月23日整穗的2個(gè)方法中，剪藥法的得胚率高達(dá)31.3%，比常規(guī)去雄法的得胚率高出8.2百分點(diǎn)。但隨著整穗日期的推遲，3月31日剪藥法的得胚率顯著下降，僅為16.7%，而常規(guī)法的得胚率為33.6%，說(shuō)明剪藥法應(yīng)比常規(guī)法的去雄時(shí)機(jī)適當(dāng)提前，否則容易損傷柱頭而影響得胚率。因此，推薦在嫩齡剪藥去雄，并在剪藥之前進(jìn)行整穗，每小穗僅留基部2朵小花，以確保去雄后2朵小花的柱頭更好地自我修復(fù)。

2.2 雜交穗離體培養(yǎng)條件的比較

試驗(yàn)中分別將離體麥穗放在大棚自然條件和人工氣候箱可控條件下進(jìn)行培養(yǎng)，14 d后剝?nèi)∽蚜２兂鲇着?，比較不通過(guò)培養(yǎng)條件下的得胚率，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，利用人工氣候箱進(jìn)行離體穗培養(yǎng)，2個(gè)批次的得胚率分別為24.3%和23.9%，比在大棚自然條件下的得胚率分別增加4.9%、8.2%。因此，穩(wěn)定適宜的環(huán)境條件對(duì)小麥×玉米雜交誘導(dǎo)單倍體胚頻率影響顯著，人工氣候箱控制溫度、濕度、光照是提高得胚率的有效途徑。

2.3 大棚玉米生長(zhǎng)情況對(duì)得胚率的影響 為使大棚玉米與大田小麥花期同步，每年冬季應(yīng)提前在簡(jiǎn)易溫室大棚內(nèi)點(diǎn)播玉米。

由于簡(jiǎn)易溫室大棚設(shè)施較簡(jiǎn)陋，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)溫度和光照的精確控制，外界天氣條件對(duì)棚內(nèi)溫度和光照的影響較大。外界溫度較低時(shí)，棚內(nèi)平均溫度也較低;晴好天氣下，棚內(nèi)光照條件比陰雨天要好得多。2017、2018、2019、2020年襄陽(yáng)地區(qū)的冬季氣候條件差異較大，大棚玉米的生長(zhǎng)狀態(tài)呈現(xiàn)不同特點(diǎn)，小麥與玉米雜交后的單倍體胚誘導(dǎo)率也有較大差異（表3）。

從表3可以看出，2018和2019年1—2月玉米苗期溫度偏低、光照偏弱，導(dǎo)致玉米生長(zhǎng)較弱，平均得胚率較低;而2017和2020年同期生長(zhǎng)積溫較高、光照條件較好，玉米生長(zhǎng)基本健壯，較前者得胚率顯著增高。由此可知，冬季自然溫光條件對(duì)大棚玉米的生長(zhǎng)發(fā)育影響較大，進(jìn)而造成得胚率差異顯著。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同去雄方法的選擇與比較

該試驗(yàn)結(jié)果顯示，掌握適當(dāng)?shù)娜バ蹠r(shí)機(jī)，采用剪藥法不僅不會(huì)降低得胚率，還可使去雄效率提高至少5倍，有效解決了雜交季節(jié)大量用工的難題，并在現(xiàn)有人力物力的基礎(chǔ)上滿足大規(guī)模雜交需要，從而為實(shí)現(xiàn)育種生產(chǎn)提供了保障。

常規(guī)去雄法是最安全、最易推廣的方法，但是效率太低，平均完成1個(gè)麥穗的整穗去雄至少需要3～5 min。李月華等[7]將簡(jiǎn)單去雄法的垂直穗軸剪切改為45°角剪穎，提高了雜交工效，保證了雜交種子的質(zhì)量。陳新民等[8]比較了常規(guī)去雄技術(shù)、改良垂直剪穎剪藥技術(shù)、不去雄授粉技術(shù)共3種雜交授粉方法對(duì)單倍體胚產(chǎn)生頻率的影響，推薦采用改良垂直剪穎剪藥技術(shù);劉琨等[9]比較了不同去雄方法的得胚率，推薦首選剪穎不去雄法。在實(shí)際操作中，采用剪穎不去雄法對(duì)授粉時(shí)機(jī)要求很高，必須在小麥自身開(kāi)花前1～2 d授以玉米花粉，因此每天授粉前都要先取下雜交袋確認(rèn)小花發(fā)育進(jìn)程，因而增加了一道工序。

筆者通過(guò)多年的實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，常規(guī)去雄后5～7 d授粉仍能誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，這與顧堅(jiān)等[5]的結(jié)論一致。他們認(rèn)為授粉時(shí)，小花柱頭發(fā)育越成熟，單倍體胚的誘導(dǎo)頻率越高，因此在確保去雄成功的前提下，盡量推遲授粉有益于得胚率的提高。

該研究采用了“整穗+嫩齡剪藥”法，不僅提高了去雄的效率，保留了去雄的徹底性，也得到了較高的得胚率，是一種理想的、可操作性強(qiáng)的、易推廣的、簡(jiǎn)單高效的去雄方法，為實(shí)現(xiàn)小麥單倍體育種提供了有效的途徑。

3.2 人工氣候箱離體穗培養(yǎng)可有效提高單倍體胚頻率和穩(wěn)定性

小麥×玉米單倍體誘導(dǎo)技術(shù)中，在田間用玉米花粉逐個(gè)給麥穗授粉是一道耗時(shí)耗力的復(fù)雜工序。筆者從2016年起即采用雜交穗離體授粉與培養(yǎng)技術(shù)[2，10]，極大提高了授粉效率，節(jié)約了人力物力。2016—2018年離體麥穗主要在溫室大棚里進(jìn)行離體培養(yǎng)，無(wú)法精確控制溫度和濕度，得胚率不穩(wěn)定，平均得胚率偏低;2019—2020年利用新購(gòu)置的人工氣候箱進(jìn)行離體培養(yǎng)，得到了較好的試驗(yàn)效果。

陳新民等[2]認(rèn)為，小麥生長(zhǎng)環(huán)境條件和生長(zhǎng)狀態(tài)是小麥與玉米雜交穩(wěn)定獲得高頻率單倍體胚的重要因素。該研究采用離體授粉技術(shù)，極大提高了授粉效率，同時(shí)配套離體培養(yǎng)技術(shù)，使小麥生長(zhǎng)環(huán)境達(dá)到人工可控條件，為提高小麥單倍體胚頻率和穩(wěn)定性提供了基礎(chǔ)。

3.3 疫情下特殊氣候帶來(lái)的啟示 該研究種植玉米品種為廣甜糯1號(hào)，由于該品種生育期短、適應(yīng)力強(qiáng)、耐低溫、生長(zhǎng)快、粉量大、誘導(dǎo)成功率高，因此可作為小麥?zhǔn)诜鄣闹饕衩灼贩N。

為了與大田正季播種的小麥植株實(shí)現(xiàn)花期同步，一般同年12月就要在大棚內(nèi)播種玉米，次年4月初開(kāi)花[11]。近10年來(lái)的試驗(yàn)實(shí)踐中，冬季大棚的玉米一直生長(zhǎng)較弱，莖稈很細(xì)，而且經(jīng)不起風(fēng)雨，很容易倒伏。筆者采用改良土壤、提高大棚溫度、噴施矮壯素，均未能實(shí)現(xiàn)大棚玉米的健壯生長(zhǎng)，每年大棚玉米的生長(zhǎng)僅能維持小麥×玉米雜交所需要的花粉用量。

襄陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院地處鄂北崗地（32°N，112°E），冬季日照時(shí)間短，陰天和雨雪天較多，日照強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于玉米種植正季的夏秋季節(jié)。而在2020年疫情下，特殊的暖冬氣候卻帶來(lái)意外的收獲，冬行春令，晴好天氣伴隨較高溫度，大棚中的玉米植株生長(zhǎng)異常健壯，甚至出現(xiàn)了以前在冬季大棚中未曾見(jiàn)過(guò)的粗壯的支持根，株高顯著降低，莖稈直徑是往年的2倍，平均胚誘導(dǎo)率較往年大幅提高，達(dá)到25.8%。在其他試驗(yàn)條件不變的前提下，可以斷定作為花粉供體的玉米植株生長(zhǎng)狀態(tài)和健壯程度是影響小麥單倍體胚誘導(dǎo)率的重要因素，而除了要達(dá)到一定的積溫要求，充足的光照條件也是培育健壯玉米植株的必要條件。

為了減少冬季自然溫光條件對(duì)大棚玉米花粉誘導(dǎo)效率的不利影響，在冬季大棚內(nèi)種植玉米時(shí)，要保證棚內(nèi)足夠充足的光照強(qiáng)度，專用的LED植物生長(zhǎng)燈下50 cm處至少要達(dá)到50 000 lx。在玉米生長(zhǎng)正季時(shí)在大田種植玉米，獲得的玉米植株最健壯，花粉活力也較高，對(duì)小麥植株單倍體胚的誘導(dǎo)效果更好，這種方法值得進(jìn)一步研究探索。

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