豬瘟病毒與宿主蛋白相互作用的研究進(jìn)展

董望，井匯源，王?；?，曹素芳，包文奇，呂慧芳*

(1. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院， 河南 鄭州 450046；2. 鄭州市獸醫(yī)生物制品技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450046)

豬瘟是由豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一種豬的傳染病，具有高度的接觸傳染性、流行廣泛、發(fā)病頻繁、死亡率高等特點(diǎn)，長(zhǎng)期阻礙養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。在中國(guó)，主要采用接種疫苗的方式來控制豬群中的CSFV感染，雖能有效控制豬瘟的大規(guī)模流行，但很多地方仍有豬瘟散發(fā)或地方流行[1]，仍是威脅我國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)的一大疾病[2]。

CSFV是一種具有囊膜的球形單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科瘟病毒屬。CSFV基因組長(zhǎng)約12.3 kb，5′非編碼區(qū)(含有IRES)、開放閱讀框(ORF)和缺少poly A的3′非編碼區(qū)共同組成了CSFV的基因組。ORF編碼一個(gè)多聚蛋白前體，該前體在細(xì)胞蛋白酶和病毒特異的蛋白酶作用下逐步加工成成熟的4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1、E2)和8種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[3]。CSFV感染過程中，宿主細(xì)胞蛋白與病毒蛋白的相互作用有利于病毒的吸附、穿入、復(fù)制、組裝和釋放過程。本文歸納了近年來CSFV蛋白與宿主蛋白相互作用的研究進(jìn)展，并總結(jié)了宿主蛋白對(duì)病毒復(fù)制、宿主天然免疫應(yīng)答及細(xì)胞凋亡方面的作用，以期能進(jìn)一步理解CSFV的致病機(jī)制。

1 CSFV結(jié)構(gòu)蛋白與宿主的相互作用

1.1 C蛋白

研究表明，CSFV通過C蛋白與血紅蛋白β亞基(HB)的C端相互作用，抑制HB的表達(dá)，進(jìn)而阻斷HB介導(dǎo)的視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I(RIG-I)受體通路，導(dǎo)致RIG-I受體介導(dǎo)的β干擾素(IFN-β)的表達(dá)減少，從而有利于CSFV自身的復(fù)制[4]。另外，C蛋白泛素化位點(diǎn)的突變將阻斷C蛋白與小類泛素化修飾蛋白1(SUMO-1)結(jié)合，致使C蛋白突變的病毒毒力減弱[5]。與C蛋白發(fā)生相互作用的還有細(xì)胞骨架的主要調(diào)控因子支架蛋白(IQGAP1)，破壞兩者的結(jié)合將導(dǎo)致CSFV復(fù)制能力的減弱和毒力的降低[6]。此外，骨肉瘤擴(kuò)增蛋白9(OS9)與C蛋白也存在相互作用，且CSFV C蛋白中與OS9互作位點(diǎn)的突變，導(dǎo)致CSFV復(fù)制能力的降低[7]。最新研究發(fā)現(xiàn)，小鼠的Mx1蛋白(一種干擾素刺激基因)R614E突變體與CSFV C相互作用，抑制CSFV復(fù)制，發(fā)揮其抗病毒活性，表明物種間Mx1的相對(duì)保守是其廣譜抗病毒特性的基礎(chǔ)[8]。因此，與CSFV C蛋白相互作用的宿主蛋白主要涉及抗病毒應(yīng)答、蛋白泛素化及細(xì)胞骨架的調(diào)控等，主要參與天然免疫信號(hào)通路及泛素化蛋白的降解途徑。C蛋白通過與宿主蛋白相互作用，維持CSFV的毒力，且?guī)椭《咎颖芩拗鞯拿庖邞?yīng)答，從而利于自身的復(fù)制。

1.2 糖蛋白Erns

Erns與雙鏈RNA(dsRNA)結(jié)合，能拮抗Ⅰ型干擾素(IFN)信號(hào)的誘導(dǎo)[9]。另外，CSFV通過Erns與細(xì)胞膜表面的硫酸乙酰肝素(HS)相互作用吸附在細(xì)胞表面，去除細(xì)胞表面的HS將導(dǎo)致CSFV無法感染豬腎細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，層黏連蛋白受體(Lam R)是一種細(xì)胞表面的跨膜蛋白，與Erns存在相互作用，介導(dǎo)著CSFV的吸附與侵入[10]。因此，目前發(fā)現(xiàn)與Erns蛋白相互作用的宿主蛋白主要是細(xì)胞膜表面的蛋白，參與病毒的吸附與入侵。

1.3 糖蛋白E1

E1蛋白是豬瘟病毒的囊膜蛋白，通過半胱氨酸殘基之間的二硫鍵與E2糖蛋白形成同源二聚體和異源二聚體，共同介導(dǎo)病毒的侵入過程。在CSFV感染性顆粒中，E1蛋白被包埋于C蛋白和E2蛋白內(nèi)，因此其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)導(dǎo)致其無法刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，但是E1蛋白的突變能影響病毒的毒力[11]。目前為止，尚未見到與E1蛋白相互作用的宿主蛋白的報(bào)道。

1.4 糖蛋白E2

E2蛋白一般以同源二聚體的形式存在于CSFV的囊膜上，是病毒入侵細(xì)胞的重要蛋白，同時(shí)E2蛋白也是CSFV的主要保護(hù)性抗原蛋白，以多種形式存在于受體細(xì)胞表面及病毒體內(nèi)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，其糖基化位點(diǎn)決定CSFV的免疫原性[12]。E2在疫苗研制和抵抗病毒感染方面具有潛在的研究?jī)r(jià)值[13]。研究報(bào)道，在豬瘟病毒感染的早期階段，細(xì)胞內(nèi)的蛋白β-actin(細(xì)胞中的一種重要骨架蛋白)通過與E2相互作用，有益于病毒早期的復(fù)制[14]。細(xì)胞膜聯(lián)蛋白(Anx2)是一種脂筏相關(guān)的支架蛋白，其與E2相互作用促進(jìn)CSFV增殖，Anx2還可能參與病毒的吸附或者侵入[15]。硫氧還蛋白2(Trx2)是一種線粒體相關(guān)蛋白，參與多種細(xì)胞活動(dòng)。Trx2通過與E2相互作用抑制CSFV的增殖，但是CSFV感染能抑制由Trx2介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而利于病毒的復(fù)制[16]。絲裂原活化蛋白激酶激酶2(MEK2)與CSFV E2蛋白相互作用，促進(jìn)CSFV復(fù)制[17]。蛋白磷酸酶1催化亞單位β(PPP1CB)是蛋白磷酸酶1(PP1)復(fù)合物的一部分，研究發(fā)現(xiàn)，在CSFV感染的細(xì)胞中E2能與PPP1CB蛋白相互作用，且PP1通路的激活能降低CSFV的復(fù)制[18]。研究發(fā)現(xiàn)，CSFV E2與豬蛋白激酶C1受體(RACK1)也存在相互作用[19]。此外，E2與SERTAD1相互作用，且在CSFV體內(nèi)感染過程中，E2與SERTAD1的結(jié)合對(duì)病毒的毒力起關(guān)鍵作用[20]。CSFV E2與宿主蛋白CCDC115相互作用，該相互作用對(duì)CSFV在豬巨噬細(xì)胞中的復(fù)制及在家豬感染過程中的毒力發(fā)揮重要作用[21]。肌動(dòng)蛋白亞基6(DCTN6)與CSFV E2的有效結(jié)合影響著病毒的毒力[22]。MERTK與CSFV E2蛋白相互作用，促進(jìn)病毒的入侵，待病毒進(jìn)入細(xì)胞后，MERTK又會(huì)下調(diào)IFN-β的mRNA表達(dá)，促進(jìn)CSFV感染[23]。因此，與E2蛋白相互作用的宿主蛋白中，Anx2和MERTK為細(xì)胞膜上的蛋白，參與病毒的入侵。β-actin和DCTN6為細(xì)胞骨架蛋白，可能參與病毒蛋白的運(yùn)輸。Trx2和MEK2分別介導(dǎo)NF-κB和MEK2/ERK信號(hào)通路，參與病毒的復(fù)制。SERTAD1、CCDC115和DCTN6蛋白與CSFV的毒力有關(guān)。

2 CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白

2.1 Npro蛋白

Npro蛋白利用其蛋白水解酶活性將自身從新翻譯的多聚蛋白中切割出來。Npro蛋白C端的鋅結(jié)合域與干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)發(fā)生相互作用，該相互作用能夠誘導(dǎo)IRF-3蛋白的降解，從而減少了由IRF-3介導(dǎo)的Ⅰ型IFN(IFN Ⅰ)的表達(dá)[24]。Npro還可以與IRF-7相互作用，阻礙干擾素的誘導(dǎo)，從而幫助病毒逃逸先天免疫防御[25]。另外，Npro與IκBα(NF-κB的抑制劑)存在相互作用，提示Npro可能參與NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，下調(diào)天然免疫因子的轉(zhuǎn)錄[26]。CSFV Npro通過與宿主Poly(C)結(jié)合蛋白1(PCBP1)相互作用，抑制IFN Ⅰ信號(hào)通路，利于病毒的復(fù)制[27]。核糖體蛋白20(uS10)與CSFV Npro相互作用，且uS10通過正向調(diào)控Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)3的表達(dá)，發(fā)揮抗病毒的作用。但是，Npro蛋白和CSFV感染均能減少細(xì)胞中uS10的表達(dá)，從而削弱uS10的抗病毒作用，進(jìn)而利于CSFV自身的復(fù)制[28]。TRIM56蛋白與CSFV Npro相互作用，并且下調(diào)TRIM56蛋白的表達(dá)能夠促進(jìn)CSFV的復(fù)制[29]。此外，抗凋亡蛋白HAX-1與Npro相互作用，使其從線粒體重新分布到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，增加了細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗力[30]。Npro蛋白還可以拮抗由雙鏈RNA或線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(MAVS)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[31]。研究表明，β-actin也與Npro蛋白存在相互作用[32]。因此，與Npro相互作用的宿主蛋白主要為天然免疫相關(guān)蛋白，參與宿主的天然免疫應(yīng)答，Npro通過與這些蛋白相互作用，抑制宿主的天然免疫應(yīng)答，從而有利于自身的復(fù)制。此外，Npro還可以與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相互作用，從而抑制病毒對(duì)細(xì)胞的凋亡作用。

2.2 p7蛋白

p7蛋白能促進(jìn)IL-1β在巨噬細(xì)胞內(nèi)的分泌[33]。p7屬于II類病毒孔蛋白，可在細(xì)胞膜上誘導(dǎo)兩種類型的孔隙[34]，這可能與病毒蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)及病毒粒子釋放有關(guān)。鈣調(diào)節(jié)配體(CAMLG)是一種完整的ER跨膜蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放和信號(hào)反應(yīng)的產(chǎn)生。p7蛋白能與CAMLG相互作用，有效調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的通透性，破壞p7蛋白與CAMLG的結(jié)合，會(huì)影響CSFV的增殖[35]。

2.3 NS2蛋白

Kang等[36]通過酵母雙雜交(Y2H)篩選與CSFV NS2相互作用的宿主蛋白，發(fā)現(xiàn)11種相互作用蛋白，主要參與細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、氧化還原或代謝等生物進(jìn)程。

2.4 NS3蛋白

NS3與NS5B相互作用，增強(qiáng)NS5B RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)活性[37]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)6屬于天然免疫相關(guān)蛋白，具有抵抗病毒感染的功能。然而，CSFV NS3能與TRAF6結(jié)合，并降解TRAF6，從而減弱TRAF6介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答，利于自身的復(fù)制[38]。TRAF5也能與NS3相互作用，通過激活p38 MAPK通路促進(jìn)CSFV的復(fù)制[39]。蛋白酶體亞基10(PSMB10)與NS3相互作用，且PSMB10通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解NS3，CSFV抑制MHC I類抗原呈遞相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，而PSMB10可以恢復(fù)MHC I類抗原呈遞的功能，抑制CSFV增殖[40]。因此，與NS3相互作用的蛋白主要涉及抗病毒免疫、蛋白泛素化及抗原的遞呈等，參與NF-κB、p38 MAPK等信號(hào)通路，NS3通過影響這些蛋白，促進(jìn)病毒的復(fù)制。

2.5 NS4A蛋白

NS4A通過與NS2-3或NS3相互結(jié)合，參與病毒顆粒的形成。另外，CSFV NS4A通過增強(qiáng)MAVS信號(hào)通路誘導(dǎo)IL-8的表達(dá)[41]。目前為止，尚未見到與NS4A相互作用的宿主蛋白的報(bào)道。

2.6 NS4B蛋白

NS4B蛋白C端具有假定的Toll/白細(xì)胞介素-1受體(TIR)樣結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的突變將導(dǎo)致CSFV表型減弱，并減少強(qiáng)毒株Brescia株的復(fù)制[42]。研究表明，Rab5與NS4B相互作用并促進(jìn)NS4B相關(guān)復(fù)合物的形成，利于CSFV增殖[43]。重鏈鐵蛋白(FHC)與NS4B蛋白之間存在相互作用，且CSFV感染通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)FHC表達(dá)水平而維持細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的穩(wěn)定，從而抑制細(xì)胞凋亡[44]。NS4B與TANK結(jié)合激酶1(TBK1)相互作用，可能參與CSFV的天然免疫調(diào)節(jié)[45]。豬環(huán)指蛋白114(pRNF114)是E3泛素連接酶，通過其C端結(jié)構(gòu)域與CSFV NS4B蛋白相互作用，導(dǎo)致了K27連接的多泛素化，并通過蛋白酶體依賴途徑降解NS4B，進(jìn)而抑制CSFV的復(fù)制[46]。因此，與NS4B相互作用的蛋白主要涉及囊泡的運(yùn)輸、ROS的穩(wěn)定、天然免疫和蛋白的泛素化降解等，主要參與病毒的組裝、復(fù)制及細(xì)胞凋亡。

2.7 NS5A蛋白

NS5A蛋白可通過與病毒或宿主蛋白相互作用調(diào)控病毒基因組復(fù)制、蛋白翻譯和組裝。NS5A蛋白通過與病毒基因組的3′-NCR結(jié)合或通過與NS5B相互作用調(diào)節(jié)NS5B RdRp活性來調(diào)控病毒RNA復(fù)制[47]。宿主內(nèi)的熱休克蛋白70(HSP70)和FKBP8均能與NS5A蛋白發(fā)生相互作用并促進(jìn)CSFV RNA復(fù)制[48]。真核翻譯起始因子3亞基E(eIF3E)與NS5A相結(jié)合，且eIF3E通過增強(qiáng)CSFV內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的翻譯活性而利于病毒的復(fù)制[49]。真核翻譯延伸因子1亞基A(eEF1A)與NS5A相互作用，且能結(jié)合于CSFV IRES，降低IRES的翻譯活性，從而抑制病毒的增殖[50]。另外，Anx2和Rab1A已被證明與NS5A相互作用以增強(qiáng)CSFV粒子的組裝[51]。此外，細(xì)胞內(nèi)的HSP27與NS5A相互作用，并通過NF-κB信號(hào)通路對(duì)病毒的增殖負(fù)性調(diào)控[52]。HSP90AB1/HSPCB與NS5A也存在相互作用[53]。鳥苷酸結(jié)合蛋白1(GBP1)與NS5A相互作用，其自身的GTPase活性將被NS5A蛋白所抑制，導(dǎo)致減弱了GBP1的抗病毒作用，有利于病毒的復(fù)制[54]。新的研究發(fā)現(xiàn)，Rab18，一個(gè)小Rab GTPase，與NS5A相互作用，是CSFV RNA復(fù)制和病毒粒子組裝所必需的一種新的宿主因子[55]。NS5A與GRP78相互作用，在CSFV激活細(xì)胞未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且該相互作用對(duì)CSFV的復(fù)制起積極促進(jìn)作用[56]。蝰蛇毒素(viperin)蛋白通過其自由基SAM結(jié)構(gòu)域和N端結(jié)構(gòu)域與NS5A相互作用，抑制CSFV復(fù)制[57]。與NS5A相互作用的蛋白較多，說明NS5A是一種多功能的蛋白。其中，HSP70、HSP27、HSP90AB1、HSPCB和GRP78為熱休克蛋白，介導(dǎo)蛋白的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，參與病毒的復(fù)制。eIF3E和eEF1A為真核翻譯因子，介導(dǎo)蛋白的翻譯過程，影響病毒的增殖。Anx2為脂筏支架蛋白，Rab1A和Rab18為GTP結(jié)合蛋白，介導(dǎo)膜轉(zhuǎn)運(yùn)和囊泡的運(yùn)輸，參與病毒的組裝。GBP1和Viperin為干擾素刺激基因，影響病毒的復(fù)制。

2.8 NS5B蛋白

NS5B蛋白與NS3蛋白相互作用，分別增強(qiáng)了NS5B的RdRp活性和NS3的RNA解旋酶活性[58]。另外，在CSFV感染豬宿主細(xì)胞的過程中，細(xì)胞抗病毒蛋白Mx1結(jié)合于CSFV NS5B蛋白，抑制CSFV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制[59]。

3 展望

病毒的生命周期主要包括吸附、侵入、脫殼、生物合成、組裝和釋放。細(xì)胞蛋白HS、Lam R與Erns蛋白相互作用，介導(dǎo)病毒的吸附。Anx2、MERTK與E2蛋白相互作用，介導(dǎo)病毒的侵入。eIF3E和eEF1A與NS5A蛋白相互作用，介導(dǎo)蛋白的翻譯，影響病毒的增殖。HSP70、HSP27、HSP90AB1、HSPCB和GRP78與NS5A蛋白相互作用，介導(dǎo)蛋白的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，參與病毒的復(fù)制。Rab5與NS4B蛋白相互作用以及Anx2、Rab1A和Rab18與NS5A蛋白相互作用，參與病毒的組裝。細(xì)胞內(nèi)β-actin與E2蛋白相互作用可以影響CSFV復(fù)制的早期階段。另外，破壞SUMO-1、IQGAP1與C蛋白的相互作用，或SERTAD1、CCDC115、DCTN6與E2蛋白的相互作用，將導(dǎo)致病毒毒力減弱。此外，與Npro相互作用的HAX-1及與NS4B相互作用的FHC蛋白，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。宿主細(xì)胞的天然免疫應(yīng)答對(duì)抵抗病毒的感染至關(guān)重要，CSFV蛋白通過與多種天然免疫相關(guān)蛋白相互作用，從而有利于自身的復(fù)制，例如MX1、HB與C蛋白相互作用，Trx2與E2蛋白相互作用，IRF-3、IRF-7、IκBα、PCBP1、uS10、TRIM56與Npro蛋白相互作用，TRAF6、TRAF5與NS3蛋白相互作用，TBK1與NS4B蛋白相互作用，GBP1、Viperin與NS5A蛋白相互作用。綜上所述，未來的研究應(yīng)該集中于與p7、NS2、NS4A和NS5B相互作用蛋白的探索及病毒釋放機(jī)制的研究。

豬瘟病毒蛋白與宿主蛋白相互作用的研究為了解CSFV的發(fā)病機(jī)制提供了重要的依據(jù)。盡管取得了這些進(jìn)展，但是CSFV與宿主之間的許多分子作用機(jī)制仍不清楚。因此，還需要大量的研究來探索CSFV和宿主蛋白的相互作用。目前，常使用酵母雙雜交(Y2H)技術(shù)篩選與病毒蛋白相互作用的宿主蛋白。此外，隨著技術(shù)的快速發(fā)展，串聯(lián)親和純化技術(shù)也被應(yīng)用于篩選互作的宿主蛋白，加快了CSFV蛋白與宿主蛋白的研究。因此，結(jié)合新技術(shù)對(duì)CSFV蛋白與宿主蛋白互作的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及CSFV的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的研究是今后的研究方向之一，以期發(fā)現(xiàn)新的抗病毒因子或靶點(diǎn)，從而開發(fā)新的抗病毒藥物或更高效的疫苗，促進(jìn)豬瘟的控制和清除。綜上所述，本文總結(jié)了目前為止CSFV與宿主的相互作用進(jìn)展，進(jìn)一步揭示了CSFV的致病機(jī)制，有助于豬瘟的防控。