流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD161對(duì)結(jié)核病的診斷效能*

陳 騎，楊倩婷，張明霞，康 紅

深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所，廣東深圳 518112

結(jié)核病仍然是當(dāng)前危害人類健康最嚴(yán)重的傳染病之一。造成結(jié)核病流行的現(xiàn)狀有多個(gè)方面的原因，其中缺乏快速、有效的早期結(jié)核感染診斷技術(shù)是重要原因之一。因此，結(jié)核分枝桿菌(TB)早期診斷對(duì)結(jié)核病防治具有重要意義。本文利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)全血細(xì)胞中CD161的表達(dá)，并與現(xiàn)有結(jié)核病診斷的實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行對(duì)比，評(píng)價(jià)其在臨床應(yīng)用的效能。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院收治的活動(dòng)性肺結(jié)核患者178例作為結(jié)核病組。其中男126例，女52例，年齡(52.32±1.34)歲。根據(jù)臨床癥狀、胸部X線、抗酸桿菌痰涂片、痰結(jié)核菌培養(yǎng)及對(duì)抗結(jié)核治療反應(yīng)等診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核，均接受抗結(jié)核治療。另選取本院體檢健康者138例作為健康對(duì)照組。男97例，女41例，年齡(52.61±1.27)歲，均經(jīng)胸部X線拍片或者CT檢查，排除肺部結(jié)核及肺外其他部位結(jié)核，既往無(wú)結(jié)核病史，無(wú)服用過(guò)抗結(jié)核藥物。

1.2儀器與試劑 7500型PCR儀購(gòu)自ABI公司，全自動(dòng)熒光定量PCR儀Cepheid 工作站購(gòu)自美國(guó)賽沛公司，斑點(diǎn)Elispot讀板儀購(gòu)自美國(guó)CTL公司，Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。TB-DNA核酸檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20191001)購(gòu)自達(dá)安基因股份有限公司，GeneXpert檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：1000166969)購(gòu)自深圳市同春和生物科技有限公司，IGRAs試劑盒(批號(hào)：20190800905)購(gòu)自北京同生時(shí)代生物科技有限公司，流式細(xì)胞術(shù)CD161試劑盒(批號(hào)：20190901)購(gòu)自深圳市聯(lián)合醫(yī)學(xué)科技有限公司；全血用紅細(xì)胞裂解液及抗 CD3(SY7)、抗CD4(SY3)、抗 CD45(2D1)購(gòu)自美國(guó)BD公司，抗CD161(191B8)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 采集兩組研究對(duì)象肝素鋰抗凝外周血，采用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD161。收集活動(dòng)性肺結(jié)核組患者清晨痰液標(biāo)本，并進(jìn)行痰涂片、TB-DNA等檢測(cè)。

1.3.2全血細(xì)胞染色及流式細(xì)胞術(shù)分析 取100 μL全血用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞，采用抗 CD3、抗CD4、抗 CD45和抗CD161等抗體進(jìn)行表面染色，室溫避光孵育 15 min后，以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍并進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。分析單核細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞CD161百分比，計(jì)算各標(biāo)本的RF值。RF值=淋巴細(xì)胞百分比/單核細(xì)胞百分比×淋巴細(xì)胞CD161百分比。

2 結(jié) 果

2.1CD161對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷效能 結(jié)核病組患者RF值(127.9±8.6)低于健康對(duì)照組(224.2±8.3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。為進(jìn)一步明確CD161分辨結(jié)核患者和健康對(duì)照者的效能，繪制ROC曲線，結(jié)果顯示其曲線下面積(AUC)為0.80。當(dāng)RF值<150時(shí)，靈敏度為72.47%，特異度為71.01%。

2.2CD161檢測(cè)方法與其他結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法比較 現(xiàn)有的結(jié)核病常規(guī)檢查方法主要包括CD161檢測(cè)技術(shù)、痰涂片、GeneXpert、TB-DNA、γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRAs)，其檢測(cè)陽(yáng)性率分別為72.47%(129/178)、33.33%(53/159)、50.34%(74/147)、40.62%(52/128)、67.46%(85/126)。

2.3不同方法學(xué)在菌陽(yáng)、菌陰性肺結(jié)核患者中檢測(cè)效率比較 根據(jù)痰涂片結(jié)果將結(jié)核患者分為菌陰性肺結(jié)核患者(77例)和菌陽(yáng)性肺結(jié)核患者(53例)，進(jìn)一步比較GeneXpert、TB-DNA、IGRAs、CD161檢測(cè)方法的陽(yáng)性率，結(jié)果顯示在菌陽(yáng)性肺結(jié)核結(jié)合患者中，GeneXpert檢測(cè)陽(yáng)性率最高，在菌陰性肺結(jié)核患者中，CD161檢測(cè)技術(shù)陽(yáng)性率最高。見(jiàn)表1。

表1 不同方法學(xué)檢測(cè)在菌陽(yáng)、菌陰性肺結(jié)核患者中的檢測(cè)效率比較

3 討 論

結(jié)核病在傳染性疾病中病死率排名第一，也是世界第九大死因疾病。自2018年以來(lái)，結(jié)核病病死率進(jìn)一步增加，其中以人類免疫缺陷病毒(HIV)合并TB感染為主，耐多藥結(jié)核其次。結(jié)核病控制最有效的方法是早期診斷和干預(yù)，但缺乏簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效的診斷工具會(huì)妨礙結(jié)核病的準(zhǔn)確檢測(cè)。據(jù)報(bào)道，近1/3 HIV感染者合并TB感染，合并感染攜帶者更易發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核[1]。早期發(fā)現(xiàn)和診斷對(duì)防控結(jié)核病傳播尤為關(guān)鍵。目前結(jié)核病的診斷實(shí)驗(yàn)室方法主要有 GeneXpert、痰涂片、TB-DNA及IGRAs等，但這些方法在診斷目前還不能完全滿足臨床的需要。GeneXpert可快速診斷結(jié)核病并且可以檢測(cè)利福平耐藥性，并且在菌陽(yáng)性肺結(jié)核患者中的陽(yáng)性率比較高，在本研究中，53例菌陽(yáng)性肺結(jié)核患者中GeneXpert檢測(cè)的陽(yáng)性率為97.96%。然而，該方法無(wú)法區(qū)分死細(xì)菌和活細(xì)菌中的DNA[2]?？顾釛U菌痰涂片方法無(wú)法區(qū)分TB與其他抗酸桿菌，并且當(dāng)每毫升痰液的細(xì)菌載量少于10 000個(gè)細(xì)菌時(shí)，靈敏度大大降低[3]；TB-DNA、IGRAs方法則無(wú)法區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核患者和潛伏感染者[4]。另外，在本研究的138例健康人群中，同時(shí)用IGRAs和CD161方法檢測(cè)的效能相當(dāng)，IGRAs目前是健康人群是否結(jié)核病潛伏感染的常用方法，但受其細(xì)胞免疫影響，手工操作繁瑣等，使得檢測(cè)結(jié)果時(shí)間較長(zhǎng)。

CD161是C型凝集素樣受體，可由多種細(xì)胞表達(dá)，這些細(xì)胞包括CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、γδ+T細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、與黏膜相關(guān)T(MAIT)細(xì)胞[5]。表達(dá)CD161分子的細(xì)胞在抗EB病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)以及流感病毒等微生物免疫方面有重要作用[6]。但是其參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、克羅恩病及原發(fā)性干燥綜合征等自身免疫性疾病的病理過(guò)程[7-10]。CD161分子被認(rèn)為是輔助性T細(xì)胞17(Th17細(xì)胞)的標(biāo)志物[11-12]，Th17細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素17A(IL-17A)和IL-17F兩種前炎癥因子在結(jié)核菌清除起到重要作用[13]。因此，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD161方法在結(jié)核病的診斷中具有重要意義。本研究中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD161方法可有效鑒別活動(dòng)性肺結(jié)核患者與健康對(duì)照者，與已發(fā)表的研究一致[5]。在判斷結(jié)核病患者和健康對(duì)照者的靈敏度和特異度均為72%左右。在菌陽(yáng)、菌陰性肺結(jié)核患者中流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD161方法檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于GeneXpert、TB-DNA及IGRAs方法，且CD161方法更適用于對(duì)菌陰性肺結(jié)核患者的診斷。

另外，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD161的方法有其顯著的優(yōu)勢(shì)：(1)該技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本是外周血，與GeneXpert、TB-DNA等檢測(cè)標(biāo)本痰液相比，CD161方法檢測(cè)不受標(biāo)本限制；(2)檢測(cè)用血量少(1 mL)，有利于在老年人或兒童等特殊場(chǎng)景的中應(yīng)用；(3)檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、操作步驟容易掌握，有利于臨床推廣；(4)檢測(cè)時(shí)間短，1 h即可出結(jié)果。

綜上所述，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD161對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核有很高的診斷價(jià)值，可用于健康人群的體檢篩查。