改良羊水細胞培養(yǎng)方法在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

杜升燁，黃憲霞，王紅梅

濟南市人民醫(yī)院重癥產(chǎn)科，山東濟南 271100

在目前臨床醫(yī)學中檢測產(chǎn)前染色體疾病的主要方式是羊水細胞培養(yǎng)方式[1]。由于羊水細胞培養(yǎng)的方式難度比較大、操作技術(shù)要求比較高、羊水細胞培養(yǎng)的時間長和培養(yǎng)成功率不高等問題，因此很多醫(yī)療機構(gòu)均未實施羊水細胞檢測的工作[2-4]。隨著科學的發(fā)展，醫(yī)療水平也隨之提高，近年來，許多研究團隊研究和改良了羊水細胞培養(yǎng)技術(shù)[5]。該文為探討分析改良羊水細胞培養(yǎng)方法在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用效果，便利選擇2019 年1—11 月來該院婦產(chǎn)科臨床資料上顯示有遺傳性染色體不良妊產(chǎn)或高危的200 例孕婦作為研究對象，實施羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水，然后使用改良的傳統(tǒng)羊水培養(yǎng)方式和改良的原位細胞培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，研究結(jié)果取得了較高的成果，具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

便利選擇來該院婦產(chǎn)科臨床資料上顯示有遺傳性染色體不良妊產(chǎn)或高危者等200 例孕婦作為研究對象。研究對象的年齡 22～45 歲，平均年齡（39.32±2.35）歲；孕周為 18～32 周，平均孕周為（28.75±1.45）周。

1.2 納入標準

①臨床診斷顯示遺傳性染色體不良妊產(chǎn)、高危者、高年齡或B 超顯示異常的孕婦； ②均無嚴重并發(fā)疾病和嚴重感染性疾??； ③該次研究經(jīng)過了醫(yī)院倫理委員會的批準和同意；④患者無行為、組織和認知障礙；⑤患者和家屬同意后對患者實施羊膜腔穿刺術(shù)。

1.3 方法

使用 B 超（B-scan ultrasonography）進行定位，然后在無菌的情況下進行穿刺操作[6]。按照改良的傳統(tǒng)羊水培養(yǎng)和改良的原位細胞培養(yǎng)的操作方法，分別對患者實施羊水采集。

改良的傳統(tǒng)羊水培養(yǎng)： 對采取的羊水細胞進行離心操作并將上清液丟棄，保存5 mL 羊水細胞層，使用滴管接種在的培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，4 d 后進行采集，一般5 d 換1 次培養(yǎng)液。在收集前2 h 使用秋水仙素滴入培養(yǎng)皿中，然后靜止放置2 h，將羊水細胞停止分裂。

①針對胎質(zhì)羊水的處理方式： 羊水的沉淀中含有大量的胎質(zhì)羊水，細胞培養(yǎng)96 h 后，觀察羊水細胞是否出現(xiàn)貼壁的現(xiàn)象，出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象后搖動培養(yǎng)皿對培養(yǎng)皿進行換液處理。

②針對嚴重血性羊水的處理方式： 在羊水細胞培養(yǎng)過程中如果出現(xiàn)血性羊水，則往羊水中加入無菌肝素，觀察羊水細胞是否出現(xiàn)貼壁的現(xiàn)象，出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象后搖動培養(yǎng)皿對培養(yǎng)皿進行換液處理。

③針對羊水細胞克隆老化的處理方式： 采用原瓶消化法的方式來處理羊水細胞克隆老化。將培養(yǎng)液中的上清液倒出，使用無菌生理鹽水對細胞面進去清理，然后使用生理鹽水胰酶進行消化，直至細胞脫落后加入新的培養(yǎng)液，然后放入培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，48 h 后收取培養(yǎng)皿細胞。

④針對羊水細胞的收獲方式： 沿著培養(yǎng)皿輕刮細胞，并使用吸管對克隆細胞進行收取[7]。然后使用生理鹽水對細胞進行沖洗，將收取的細胞進行離心實驗，將上清液丟棄并保留沉淀0.5 mL。

低滲：將5 mL 的氯化鉀加入懸液管中，混勻后放入37℃的水浴箱中低滲10 min，之后進行離心實驗，將上清液丟棄并保留沉淀0.5 mL，加入固定液搖勻，然后進行離心實驗，將上清液丟棄并保留沉淀0.5 mL，再進行固定，1 h 后放入冰箱中。

滴片： 進行離心實驗，將上清液丟棄并保留沉淀0.5 mL，然后加入固定液，然后將1 滴懸液滴入玻璃片上，風干后，使用顯微鏡對觀察細胞中染色體的情況。

改良后的原位細胞培養(yǎng)： 首先進行離心實驗并丟棄上清液保留沉淀0.5 mL，加入一定量的羊水細胞培養(yǎng)液，搖勻后放入培養(yǎng)箱中實施培養(yǎng)。2 d 后進行采集，一般5 d 換1 次培養(yǎng)液。

低滲： 丟棄上清液并使用生理鹽水對細胞面進行清洗，連續(xù)清洗2 次后，將氯化鉀（0.075 mol）加入低滲30 min；預(yù)備固定，將培養(yǎng)液中加入定量的固定液，搖勻后靜置5 min。固定：倒出低滲的液體和預(yù)備固定的液體，然后加入固定液，搖勻后靜置30 min 后，倒出固定液，連續(xù)固定2 次即可。

顯帶：在76℃下對研究對象進行烤片，然后使用生理鹽水胰酶進行消化，將G 顯帶實施染色，根據(jù)相關(guān)標準對核型進行分析。

1.4 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比（%）表示。

2 結(jié)果

①對200 例進行培養(yǎng)，一次性羊水穿刺培養(yǎng)成功了180 例，成功率為90.00%，二次羊水穿刺成功培養(yǎng)了10 例，成功率為5.00%，總培養(yǎng)成功了190 例，總成功率為95.00%，其中培養(yǎng)的時間為4～6 d，收獲最短的時間為4 d，最長的時間為6 d。其中培養(yǎng)失敗的6 例因為細胞不貼壁現(xiàn)象。

②在衛(wèi)生部門相關(guān)規(guī)定的基礎(chǔ)上，使用改良的傳統(tǒng)羊水培養(yǎng)方式和改良的原位細胞培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，延長了羊水細胞檢查的孕周時間，而且有效減少了胎兒和孕婦實施染色體檢查的危險，胎兒和孕婦的生命安全也得到了有效的提高，見表1。

③對可行染色體核型190 例分析發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)染色體異常核型現(xiàn)象的有18 例，且染色體異常檢出率為9.47%，其中，平衡易位有 5 例，占染色體異常的27.80%；三體綜合征有7 例，占染色體異常的38.89%；其他結(jié)構(gòu)異常的6 例，占染色體異常的33.33%。

表1 不同培養(yǎng)方式下羊水細胞培養(yǎng)的效果

3 討論

羊水細胞培養(yǎng)是在產(chǎn)前診斷的一種綜合性的技術(shù)手段[8]。羊水細胞是否可以高質(zhì)量的培養(yǎng)和收獲是實施羊水染色體核型分析最重要的部分。在傳統(tǒng)培養(yǎng)過程中，將沉淀的細胞都接種在培養(yǎng)皿中，并使用秋水仙素培養(yǎng)后對細胞實施收獲[9]。然后將細胞實施離心等操作。在這些實驗操作的環(huán)節(jié)中，由于培養(yǎng)的時間比較長，因此極容易造成污染，一旦發(fā)生污染現(xiàn)象，就無法進行補救。而且在傳統(tǒng)羊水細胞培養(yǎng)過程中，大大小小的操作非常多，有可能因為一個微小的操作失誤就會導(dǎo)致實驗不成功，從而無法得出正確的結(jié)論。

由于導(dǎo)致羊水細胞培養(yǎng)失敗的因素有很多。近年來有研究對象提出，在培養(yǎng)過程中將培養(yǎng)液分為兩部分，并加入新鮮的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)[10]。還有研究提出[11]，將培養(yǎng)皿放入冰箱中然后實施分離細胞進行培養(yǎng)等。提出的方法均存在者不同程度的局限性。該次研究為了進一步分析改良羊水細胞培養(yǎng)方法在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用效果，選擇來該院婦產(chǎn)科臨床資料上顯示有遺傳性染色體不良妊產(chǎn)或高危者等孕婦作為研究對象，實施羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水，然后使用改良的傳統(tǒng)羊水培養(yǎng)方式和改良的原位細胞培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，研究結(jié)果顯示，對200 例進行培養(yǎng)，培養(yǎng)成功了190 例，成功率為95.00%，其中培養(yǎng)的時間為4～6 d。對可行染色體核型190 例分析發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)染色體異常核型現(xiàn)象有18 例，且染色體異常檢出率為9.50%。其中，平衡易位有5 例，占染色體異常的27.80%；三體綜合征有7 例，占染色體異常的38.89%；其他結(jié)構(gòu)異常的6 例，占染色體異常的33.33%。充分證明了改良的傳統(tǒng)羊水培養(yǎng)方式和改良的原位細胞培養(yǎng)方式能夠有效預(yù)防染色體異常患兒的出生，從而響應(yīng)了我國優(yōu)生的政策，改善了因染色體異?；純涸斐傻牟槐匾呢摀?。

該次改良羊水細胞培養(yǎng)方式比傳統(tǒng)羊水細胞培養(yǎng)方式不同的是針對不同孕周實施相應(yīng)的檢測和培養(yǎng)，優(yōu)點：①操作前對樣本實施留存操作，避免出現(xiàn)原材料的浪費現(xiàn)象[12]。②對處理脫落細胞的中優(yōu)化了操作流程。③優(yōu)化了對染色體的收獲操作，大大降低了交叉污染的概率也提高了試驗的效率。④比傳統(tǒng)羊水細胞培養(yǎng)方式操作步驟少，在操作重對脫落的細胞直接實施低滲，從而減少了離心操作，縮短了實驗時間，而且改良后羊水細胞培養(yǎng)方式成功率比傳統(tǒng)的羊水細胞培養(yǎng)方式高。

該次研究數(shù)據(jù)與李付廣等人[3]研究結(jié)論相符，對羊水細胞培養(yǎng)135 例，全部一次性羊水穿刺培養(yǎng)成功,成功率為100%。對可行染色體核型135 例分析發(fā)現(xiàn)，9 例異常染色體核型（6.6%）、12 例多態(tài)性（8.9%）。對 80 例實施臍帶血細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)成功的有78 例，成功率為97.5%,對可行染色體核型78 例分析發(fā)現(xiàn)，檢出異常核型 8 例（10.3%）、多態(tài)性 8 例（10.0%）。充分證明了改良羊水細胞培養(yǎng)技術(shù)對于產(chǎn)前診斷中有著積極的作用。

綜上所述，改良的傳統(tǒng)羊水培養(yǎng)方式和改良的原位細胞培養(yǎng)方式均提高了收獲的成功率，減少了細胞培養(yǎng)的時間，且檢測分析的染色體核型比較多。因此改良的傳統(tǒng)羊水培養(yǎng)方式和改良的原位細胞培養(yǎng)方式能夠提高培養(yǎng)率，提高對胎兒染色體疾病臨床診斷的準確率，因此改良羊水細胞培養(yǎng)方法值得在臨床產(chǎn)前診斷中應(yīng)用。