破壁方式對(duì)微藻油脂提取物中脂肪酸的影響

付 懿，羅 琴，李 萌，陳亞蘭，劉秋艷，羅 敏，丁青芝

江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院 (鎮(zhèn)江 212013)

微藻中油脂含量十分豐富，其中的脂肪酸與植物油中的脂肪酸組成很相似是寶貴的油脂來(lái)源[1-2]。微藻中油脂的合成是在細(xì)胞內(nèi)部完成并貯存在細(xì)胞中，并且微藻細(xì)胞核內(nèi)也存在由微藻油脂形成的功能性組織，那么必須能讓有機(jī)溶劑穿過(guò)微藻緊致的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使有機(jī)溶劑與微藻油脂充分接觸，才能提取較多油脂。但是由于海藻細(xì)胞壁致密性和細(xì)胞膜的選擇透過(guò)性，所以弱極性的有機(jī)溶劑很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。因此，在提取微藻油脂之前，必須使用一定的機(jī)械或化學(xué)手段使微藻細(xì)胞壁破裂，例如擠壓膨化、超聲破碎、高壓均質(zhì)、酸熱法等[3-4]。章瑩穎等[5]將溶藻菌和其他細(xì)胞壁破碎技術(shù)相結(jié)合運(yùn)用于到微藻油脂提取，并與其他物理和化學(xué)破壁方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明:生物法和超聲法的油脂提取率相對(duì)較高，因而更適合用于對(duì)微藻細(xì)胞壁破碎預(yù)處理。研究表明:微藻油脂提取技術(shù)只有與一定的細(xì)胞壁破碎技術(shù)相結(jié)合，才能達(dá)到較好的提取效果。機(jī)械法和化學(xué)法是常用的微藻破壁方法，也可以?xún)煞N方法結(jié)合使用[6]。我們將對(duì)比研究不同破壁方法對(duì)藻油提取的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，無(wú)錫市上佳生物科技有限公司；HH6型恒溫水浴，金壇醫(yī)療儀器廠(chǎng)；超聲波清洗器，無(wú)錫市上佳生物科技有限公司；TGL-16型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)；SK-1型快速混勻器，江蘇醫(yī)療儀器廠(chǎng)；BS224S型分析天平(精密度為0.000 1 g)，賽多利斯公司；BCD-639WKPZM型冰箱，美的集團(tuán)；FJ200-S型實(shí)驗(yàn)室高速分散均質(zhì)機(jī)均質(zhì)機(jī)，韜越(上海)機(jī)械科技有限公司；SHJ-30型擠壓膨化機(jī)，南京杰亞擠出設(shè)備有限公司；GC-2010型氣相色譜，日本島津集團(tuán)。

1.2 試劑和材料

原料微擬球藻、膨化破壁的微擬球藻，山東煙臺(tái)。

試劑：正己烷、乙醇均為分析純；色譜純甲醇；無(wú)水硫酸鈉、氫氧化鉀、硫酸，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1微藻油脂的提取

將膨化破壁后的微擬球藻干燥至恒重后放入粉碎機(jī)中粉碎80目過(guò)篩，精確稱(chēng)取4 g(精確到0.000 1 g)于250 mL的錐形瓶中加入轉(zhuǎn)子，按料液比(w/v)為1∶25加入正己烷∶乙醇=10∶3混合溶劑100 mL封上保鮮膜后放入60 ℃恒溫水浴鍋，并設(shè)置轉(zhuǎn)速800 r/min的磁力攪拌器上攪拌提取6 h，轉(zhuǎn)移至離心杯中，配平后放入轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心機(jī)中離心分層15 min，再將含油脂的上清液轉(zhuǎn)移至已稱(chēng)重的離心管中，底部殘?jiān)D(zhuǎn)移至已稱(chēng)重的培養(yǎng)皿中，在70 ℃的鼓風(fēng)干燥烘箱中烘干至恒重，稱(chēng)重，計(jì)算油脂得率。

1.3.2微藻破壁方式

(1)反復(fù)凍融破壁

精確稱(chēng)取50 g(精度為0.000 1 g)未破壁的微擬球藻于大培養(yǎng)皿中，按照料液比(w/v)為1∶3加入150 mL蒸餾水后攪拌均勻，放入溫度為-20 ℃的冰箱冷凍8 h，取出后放入60 ℃的水浴鍋中融化，再放入-20 ℃的冰箱冷凍8 h，如此反復(fù)進(jìn)行5次，最終溶化后將反復(fù)凍融破壁的藻液移入大培養(yǎng)皿中后，放入溫度為70 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，干燥后轉(zhuǎn)移至粉碎機(jī)中粉碎后80目過(guò)篩，得到反復(fù)凍融破壁微藻備用。

(2)高壓均質(zhì)破壁

精確稱(chēng)取50 g(精度為0.000 1 g)未破壁的微擬球藻于500 mL燒杯中，按照料液比(w/v)為1∶4加200 mL蒸餾水后攪拌均勻，使用高速分散機(jī)進(jìn)行破壁，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，溫度為25 ℃，均質(zhì)5 min，間歇5 min，反復(fù)4次，均質(zhì)總時(shí)間為20 min，將均質(zhì)破壁后的藻液移入大培養(yǎng)皿中后，放入溫度為70 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，干燥后轉(zhuǎn)移至粉碎機(jī)中粉碎后80目過(guò)篩，得到均質(zhì)破壁微藻備用。

(3)超聲破壁

精確稱(chēng)取37.5 g(精度為0.000 1 g)未破壁的微擬球藻與250 mL燒杯中，按照料液比(w/v)為1∶4加150 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，設(shè)置超聲2 s，間隙2 s，總時(shí)間60 min，超聲功率800 W，40 ℃恒溫水浴，進(jìn)行超聲破壁，超聲破壁后的藻液移入大培養(yǎng)皿中后，放入溫度為70 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，干燥后轉(zhuǎn)移至粉碎機(jī)中粉碎后80目過(guò)篩，得到超聲破壁微藻備用。

(4)膨化破壁

擠壓膨化，溫度為110 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，在粉碎機(jī)中粉碎后80目過(guò)篩，得到超聲破壁微藻。

1.3.3微藻油脂的甲酯化

試劑的配制：10 mol/L的氫氧化鉀溶液；12 mol/L的硫酸溶液。甲酯化(測(cè)定反式脂肪酸TFA，游離脂肪總量)操作步驟如下。

(1)分別精確稱(chēng)取20 mg(精確至0.1 mg)4種破壁方式提取的油脂樣品放在4個(gè)帶蓋的玻璃瓶中。

(2)再分別用移液管移入1 mL的內(nèi)標(biāo)液(1 mg內(nèi)標(biāo)Methyi pentadecanoate溶于5 mL色譜純正己烷)于四個(gè)玻璃瓶中。

(3)接著再各自移入0.7 mL 10 mol/L KOH溶液和5.3 mL的CH4O，混勻。

(4)在水浴鍋中反應(yīng)90 min，水浴溫度為55 ℃(每10 min混勻)。

(5)冷卻至室溫，移入0.58 mL 12 mol/L H2SO4溶液，翻轉(zhuǎn)搖勻。

(6)再重復(fù)(4)中操作。

(7)冷卻至室溫，分別移入3 mL正己烷，漩渦混合器混合5 min。

(8)轉(zhuǎn)速為4 000 r/min 離心15 min。

(9)將上清液分別移入4個(gè)放有1 mm無(wú)水硫酸鈉的中號(hào)玻璃瓶中，靜置10 min后用0.22 μm微孔過(guò)濾到脂肪酸小樣品瓶中備用。

1.3.4微藻油脂脂肪酸含量的測(cè)定

脂肪酸檢測(cè)時(shí)氣相色譜條件為：SPL1溫度250 ℃；SPL1壓力40 kPa；總流量22.2 mL/min；吹掃流量3.0 mL/min；初始?jí)毫?52 kPa；色譜柱初始溫度140.0 ℃；FID1溫度250.0 ℃；FID1尾吹N2流量30.0 mL/min，F(xiàn)ID1氫氣流量40.0 mL/min，F(xiàn)ID1空氣流量399.8 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。梯度升溫程序：0～2 min，140 ℃；2～45 min，220 ℃。

將已經(jīng)甲酯化的四種不同破壁方式破壁的微藻油脂脂肪酸樣品在氣相色譜儀上一一進(jìn)樣檢測(cè)，得到不同脂肪酸的氣相色譜圖，整理各自的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算不同脂肪酸相對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 破壁方式對(duì)微藻油脂得率的影響

將之前處理的微藻樣品進(jìn)行混合溶劑(正己烷∶乙醇=10∶3, v/v)提取油脂試驗(yàn)，對(duì)比了反復(fù)凍融破壁、均質(zhì)破壁、膨化破壁、超聲破壁四種破壁方式對(duì)油脂得率的影響， 并且與未破壁微藻在相同條件下提取油脂的油脂得率進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 破壁方式對(duì)油脂得率的影響

由圖1可知，對(duì)比未破壁微藻與破壁微藻，微藻破壁后對(duì)油脂得率有著顯著的影響。未破壁微藻的油脂得率僅為18.31%±0.29%，而反復(fù)凍融破壁微藻的油脂得率為24.89%±0.25%，均質(zhì)破壁微藻的油脂得率為22.46%±0.17%，膨化破壁微藻的油脂得率為25.56%±0.12%，超聲破壁微藻的油脂得率為26.19%±0.25%。

可以看出均質(zhì)破壁微藻的油脂得率低于其他三種破壁微藻的油脂得率，這是因?yàn)榫|(zhì)的溫度為室溫25 ℃左右，對(duì)細(xì)胞壁的破碎程度不夠。反復(fù)凍融主要是靠緩慢凍結(jié)形成較大的冰晶體而使微藻細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂，并且凍結(jié)時(shí)間越長(zhǎng)，形成冰晶體的體積會(huì)越大，對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞程度越大，從而油脂得率相對(duì)高點(diǎn)。超聲波是近年來(lái)備受青睞的破壁方式，可以看出除了與膨化破壁微藻的油脂得率相近以外，其油脂得率高出其他兩種破壁方式的油脂得率。在此次試驗(yàn)中膨化破壁微藻的油脂得率也較高，這是因?yàn)榕蚧臈l件占了很大的優(yōu)勢(shì)，膨化的溫度為110 ℃，較高的溫度會(huì)使得微藻細(xì)胞壁和細(xì)胞膜充分破裂，因而油脂得率相對(duì)較高。

2.2 脂肪酸組成分析

利用氣相色譜儀分析脂肪酸，破壁方式對(duì)微藻油脂脂肪酸相對(duì)含量的影響見(jiàn)表1，不同類(lèi)脂肪酸所占百分比見(jiàn)圖2。

表1 不同破壁方式的微藻油脂脂肪酸相對(duì)含量

從表1中可以看出，使用混合溶劑正己烷∶乙醇=10∶3提取微藻中的油脂，經(jīng)過(guò)脂肪酸成分的分析，主要成分為棕櫚酸、棕櫚油酸、十七酸和亞麻酸等，其含量較為豐富。對(duì)比不同破壁方式提油后脂肪酸分析得出，除了高壓均質(zhì)破壁微藻油脂中亞麻酸含量相對(duì)其他破壁方式提取油脂的亞麻酸含量相對(duì)高點(diǎn)，其他脂肪酸相對(duì)含量相差較小。微藻油脂中含有10%左右的亞麻酸，作為必需脂肪酸，對(duì)人體有很大的益處，皮膚病、腎臟肝臟功能的多種疾病是由于攝入的必需脂肪酸不足引起的。

注：橫坐標(biāo)1表示超聲破壁微藻油脂；2表示反復(fù)凍融破壁微藻油脂；3表示高壓均質(zhì)破壁微藻油脂；4表示膨化破壁微藻油脂。 圖2 不同破壁微藻油脂的不同類(lèi)脂肪酸所占百分比

從圖2可以看出，膨化破壁微藻油脂中飽和脂肪酸百分含量占到了54%，其他3種破壁方式的微藻油脂占到40%左右，說(shuō)明膨化破壁更易于飽和脂肪酸的提取。橄欖油、菜籽油、花生油和堅(jiān)果中的MUFA含量也很豐富，能夠清除體內(nèi)血液中的低密度脂蛋白，很受營(yíng)養(yǎng)學(xué)方面的重視，微藻中單不飽和脂肪酸含量為40%，而花生油中含量為32%，橄欖油中含量為74%，大豆油中含量為27%，可見(jiàn)，微藻中MUFA的含量?jī)H次于橄欖油。又因?yàn)槲⒃逡子谂囵B(yǎng)，產(chǎn)量高于橄欖，所以微藻具有很大的優(yōu)勢(shì)。

3 總結(jié)

(1)對(duì)比四種不同破壁方式的微藻通過(guò)混合溶劑正己烷∶乙醇(v/v)=10∶3提取油脂的得率大小，超聲破壁和膨化破壁油脂得率相對(duì)較高，超聲破壁微藻油脂得率為26.19%±0.25%，而微擬球藻中總脂含量大約30%，提取率達(dá)到了80%以上，因而提油效果最好。

(2)通過(guò)氣相色譜儀檢測(cè)微藻油脂中脂肪酸成分及含量，4種破壁方式對(duì)脂肪酸成分的影響較小，得到藻油脂中棕櫚酸、棕櫚油酸、十七酸和亞麻酸含量較為豐富。

(3)通過(guò)分析微藻油脂脂肪酸含量，除了膨化破壁微藻油脂中飽和脂肪酸含量為53%之外，其它破壁方式微藻油脂中SFA含量為40%以上，MUFA含量為40%左右，PUFA為10%左右。

(4)通過(guò)比較微藻油脂脂肪酸碳數(shù)，分析得到微藻油脂中脂肪酸偶數(shù)碳達(dá)到80%以上，因而可以得出微藻油脂中脂肪酸以偶數(shù)碳為主。