水稻早衰快腐突變體ad1衰老特性的研究

何 丹 姜鴻瑞 葉亞峰 楊 陽 任 艷 陶亮之 吳躍進 劉斌美

(1中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院，安徽 合肥 230031；2安徽大學物質(zhì)科學與信息技術研究院，安徽 合肥 230031)

水稻早衰是制約水稻產(chǎn)量提高的主要因素。我國水稻種植面積約占糧食作物種植面積的30%，總產(chǎn)量約占全國糧食產(chǎn)量的38%，排名世界第一[1]。田間實踐表明，灌漿期水稻葉片衰老每推遲1 d，可使稻谷增產(chǎn)1%左右[2]。因此，研究水稻衰老相關生理生化及分子機理具有重要的現(xiàn)實意義。水稻衰老的機制復雜，受到多個基因調(diào)控并經(jīng)歷一系列的生理生化變化。目前已經(jīng)提出多個早衰假設，如基因調(diào)控假說、自由基損失學說、光碳失衡假說、營養(yǎng)虧損學說、糖誘導假說、和激素平衡假說等[1]，但是單一假說無法對水稻的衰老機制進行全面深入的闡述。因此，對水稻衰老突變體的發(fā)掘和生物學特性研究有助于了解水稻衰老的機制，而且對培養(yǎng)高產(chǎn)水稻、發(fā)掘水稻高產(chǎn)新品種具有重要意義。水稻衰老突變體分為早衰和遲衰兩大類，衰老突變體分為葉片早衰、葉鞘早衰、穗早衰等類型[3]。截至目前，葉片衰老數(shù)據(jù)庫(http:/ /eplantsenescence.org)中已經(jīng)鑒定出與水稻衰老相關的基因188 個。通過對現(xiàn)有水稻種質(zhì)資源進行定向誘變，篩選出衰老相關突變體，有望在基因水平上改良水稻早衰的現(xiàn)象，如將限速酶異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(isopentenyl transferase，IPT) 導入水稻可以使葉片衰老得到有效改善，提高結實率和穗數(shù)[4]。

衰老特性在一定程度上受到環(huán)境影響，如一些早衰突變體lmes3[5]、lmes4[5]、OsLMs[6]等在營養(yǎng)生長時期發(fā)生自然早衰現(xiàn)象的同時葉片也出現(xiàn)類病斑。但目前大多數(shù)突變體的早衰是受到基因調(diào)控生長到一定階段而發(fā)生的自然早衰，受環(huán)境調(diào)控的早衰突變體報道較少。水稻作為單子葉植物，極易受環(huán)境影響。水稻對環(huán)境溫度、光照的感知和耐受性涉及諸多基因和耐高溫機制協(xié)調(diào)作用的生理過程。植物細胞膜將高溫脅迫信號傳遞到細胞內(nèi)，細胞核通過調(diào)控相關基因的表達產(chǎn)生短期的適應機制，例如活性氧(reactive oxygen species，ROS)的清除、膜脂不飽和現(xiàn)象及熱休克蛋白的保護等均與植物的耐熱性有關[7]。全年溫度每提升1℃，估測水稻會減產(chǎn)3.2%[8]。目前水稻環(huán)境響應突變體的研究主要集中在篩選耐高溫、耐低溫水稻品種以及選育溫敏、光敏不育系等方面，如水稻耐低溫基因COLD1 功能標記的開發(fā)及應用[9]，水稻溫度超敏突變體ths1 的鑒定[10]，水稻階段性溫敏白化轉(zhuǎn)綠突變體stgra254 的鑒定[11]，水稻溫敏感失綠突變體tcd51 的鑒定[12]等。

本研究通過重離子輻射脆稈水稻品種科輻粳7號，在M2群體中篩選到一個早衰突變體ad1，遺傳穩(wěn)定。與其他早衰突變體相比，ad1 的衰老特性受環(huán)境誘導。在海南三亞南繁生長時早衰特征表現(xiàn)較弱，未出現(xiàn)植株腐解現(xiàn)象，僅少量葉片枯黃；在合肥試驗田播種時植株早衰現(xiàn)象嚴重，最終幾乎完全腐解，僅能收獲極少量種子。目前鮮見相關突變體的報道。因此，探究該突變體衰老的發(fā)生及產(chǎn)生不同衰老程度的原因，有助于更加全面地解釋環(huán)境影響水稻衰老以及植物感受外界環(huán)境變化的分子生理機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

重離子輻射脆稈水稻品種科輻粳7 號，在25 000株M2群體中篩選到與衰老特性相關的突變體并命名為早衰自腐突變體ad1。早衰自腐突變體ad1 以及野生型科輻粳7 號(WT)均由中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院技術生物與農(nóng)業(yè)工程研究所保留。

1.2 試驗設計及方法

1.2.1 試驗設計 2018年11月20日在海南三亞南繁播種WT 以及突變體ad1，12月10日移栽；2019年5月9日在合肥科學島試驗田播種WT 以及突變體ad1，5月30日移栽；株行距20 cm×20 cm，采用隨機區(qū)組設計，田間種植，3 次重復，每個小區(qū)5 行，每行20株，按正常田間肥水管理，及時防治水稻病蟲害。

1.2.2 遮光試驗 2019年7月20日，在合肥試驗田對WT 及突變體ad1 中部分材料用遮光網(wǎng)進行遮光處理，遮光處理40 d 后選取WT 與突變體ad1 各5 株。采用SPAD-502Plus 葉綠素測定儀[Konica Minolta，柯尼卡美能達(中國)投資有限公司]測定水稻倒2 葉上部、中部和基部的SPAD 值，求得每個單株倒2 葉的SPAD 平均值，再對WT 與突變體ad1 的5 個單株結果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理，檢測突變體和WT 在葉綠素相對含量上的變化。

1.2.3 葉綠素含量測定 在合肥試驗田分別選分蘗期、拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期、開花期5 個時期的WT 和突變體ad1 材料，每個時期選擇3 個單株的倒2 葉去掉中脈，剪碎，混勻。稱取剪碎的樣品0.1 g，采用乙醇提取比色法[13]測定葉綠素和類胡蘿卜素的含量，每個樣品設3 個重復。

1.2.4 光合速率測定 選取合肥試驗田抽穗期WT和突變體ad1 植株，田間測量各項光合作用指標。田間條件下，在抽穗期晴天上午9:00～11:00，取長勢相對一致的WT 和突變體ad1 各3 株，利用Yaxin-1102型便攜式光合作用測定儀(北京雅欣理儀科技有限公司)分別測定WT 和突變體ad1 倒2 葉的各項光合作用指標。每株測定5 片劍葉，每葉重復測定3 次；測量時為開路測量，溫度30℃，CO2濃度、濕度與大氣保持一致[14-15]。

1.2.5 石蠟切片觀察 切取合肥試驗田抽穗期WT和突變體ad1 倒2 葉中間部位1 cm 組織，抽穗期WT和突變體ad1 莖稈倒2 節(jié)中間部位1 cm 組織；先固定樣品，經(jīng)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、拷片[16]，葉片使用番紅-固綠染色，莖稈使用甲苯胺藍染色，用切片數(shù)字掃描(Pannoramic DESK，P-MIDI，P250，P1000，匈牙利3D HISTECH 公司)進行普通白光切片掃描。

1.2.6 透射電鏡觀察 取合肥試驗田抽穗期WT 和突變體ad1 倒2 葉，沿葉脈切成1 mm 的小塊。在2.5%戊二醛固定液中抽真空，室溫固定12 h，用蒸餾水沖洗后，1%鋨酸溶液再固定4 h，經(jīng)不同濃度梯度的乙醇脫水，用環(huán)氧樹脂包埋、聚合、修塊、切片、醋酸鈾染色，經(jīng)透射電鏡(Hitachi HT7700，日本日立高新技術公司)觀察、拍照[17]。

1.2.7 染色試驗 取合肥試驗田抽穗期WT 倒2 葉，突變體ad1 劍葉、倒2 葉、倒3 葉、倒4 葉進行染色試驗。參考Mahalingam 等[18]的方法，利用二氨基聯(lián)苯胺(diamino benzidine，DAB)染色，直接觀察水稻葉片組織中H2O2的積累；參照Kong 等[19]的方法，使用伊文思藍(evans blue，EB) 染色死細胞；氯化硝基四氮唑藍(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)染色組織中超氧陰離子[20]。

1.2.8 酶活性和衰老相關參數(shù)測定 在2019年8月9日分別剪取合肥試驗田抽穗期WT 和突變體ad1 的劍葉、倒2 葉、倒3 葉。參考李合生[21]的方法，每份葉片稱取0.5 g，放入液氮研磨成粉，加入磷酸緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)4.5 mL，配制成10%的組織勻漿。在4℃下3 500 r·min-1離心15 min，取上清液。用南京建成試劑盒測定上清液總超氧化物岐化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT) 和總抗氧化力(total antioxidant capacity，T-AOC) 活性，以及可溶性蛋白(soluble protein，SP)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量。每個樣品3 個重復，取平均值。

1.2.9 遺傳分析 突變體ad1 與WT、武運粳7 號(粳稻)、日本晴(粳稻)、9311(秈稻)、華粳秈74(秈稻)、明恢63(秈稻)6 個親本分別自交或雜交收獲F1，F(xiàn)1自花授粉收獲F2。對F1和F2進行表型和遺傳分析。統(tǒng)計F2群體中早衰植株與正常植株的分離情況，用卡方適應性檢測。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS 13.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析及卡方檢驗。

2 結果與分析

2.1 突變體ad1 的表型

海南試驗田中，WT 未出現(xiàn)衰老特性；突變體ad1前期未出現(xiàn)衰老特性，成熟期葉片出現(xiàn)少量麻黃色斑點，早衰現(xiàn)象不明顯(圖1-A、B)。合肥試驗田中，WT未出現(xiàn)衰老特性；突變體ad1 抽穗期出現(xiàn)衰老特性，從老葉的葉尖開始出現(xiàn)麻黃色，再從葉尖逐步向葉片基部擴展直至整片葉完全枯死，衰老現(xiàn)象從老葉向新葉擴展，最終完全死亡(圖1-C)。

通過采集不同時期突變體ad1 倒2 葉進行比較發(fā)現(xiàn)，突變體在孕穗期出現(xiàn)衰老現(xiàn)象后，灌漿期完全枯死。突變體ad1 在灌漿期完全枯死后，莖稈仍不斷變薄，最終呈薄紙狀態(tài)，葉片自然分裂破碎(圖1-D)。最終，突變體ad1 整個植株坍塌，莖稈和葉片逐漸腐解(圖1-E)，基本與秸稈在土壤中的腐解特征類似。

2.2 突變體ad1 的農(nóng)藝性狀

由表1可知，海南生長的突變體ad1 有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)分別較WT 高5.71%、23.46%，株高、千粒重分別較WT 降低3.97%、4.60%，結實率降低10.67 個百分點，每穗粒數(shù)差異顯著增高，株高及結實率顯著降低。合肥生長的突變體ad1 成熟期整個植株坍塌腐解無法進行考種，因此從分蘗期開始對突變體進行農(nóng)藝性狀考察，結果表明，分蘗期突變體株高、地上部干物質(zhì)重、分蘗數(shù)分別較WT 提高0.47%、69.71%、117.28%，成熟期突變體株高、地上部干物質(zhì)重分蘗數(shù)分別較WT 降低8.05%、50.00%、64.66%(圖2)。

表1 野生型(WT)和突變體ad1 的農(nóng)藝性狀鑒定(海南)Table 1 Identification of agronomic characteristics of the wild type and mutant ad1 (Hainan)

2.3 光照對突變體ad1 的影響

對突變體ad1 和WT 大田材料進行遮光處理40 d后發(fā)現(xiàn)，遮光條件下WT 植株表型并未產(chǎn)生差異，而突變體ad1 的衰老仍然發(fā)生，但衰老情況明顯減弱。通過測定葉綠素含量發(fā)現(xiàn)，未遮光條件下WT 的SPAD值為42.6，突變體ad1 的SPAD 值為8.6(表2，圖3-A)；遮光條件下WT 的SPAD 值為41.8，突變體ad1 的SPAD 值為28.9(表2，圖3-B)。證明強光會使突變體ad1 中葉綠素含量大幅減少，從而使突變體ad1 衰老更為嚴重。

表2 遮光條件下野生型(WT)和突變體ad1 的SPAD 值Table 2 SPAD values of wild type (WT) and mutant ad1 under shading conditions

2.4 光合特性相關指標與光合色素含量的測定

光合特性指標測量結果顯示抽穗期突變體ad1 的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率極顯著低于WT，胞間CO2濃度顯著高于WT。表明突變體ad1 的光合作用相對于WT 減弱(表3)。光合色素含量分析發(fā)現(xiàn)，突變體ad1 總葉綠素含量從分蘗期到開花期分別是WT 的66.10%、30.68%、23.27%、17.34%、14.67%。突變體ad1 類胡蘿卜素含量從分蘗期到開花期分別為WT 的87.86%、57.82%、61.89%、52.43%、58.80%(圖4)。

2.5 組織細胞切片觀察

對突變體ad1 和WT 的倒2 葉中間部位橫切面石蠟切片觀察，發(fā)現(xiàn)WT 葉肉細胞結構清晰、排列致密，氣孔及孔下室結構完整，泡狀細胞結構完整，表皮毛多(圖5-A)；而突變體ad1 葉肉細胞結構模糊，排列松散，氣孔及孔下室結構受損且氣孔附近葉肉細胞受損嚴重，泡狀細胞結構受損，表皮毛少且模糊(圖5-B)。

對突變體ad1 和WT 的莖桿倒2 節(jié)中間部位橫切面進行組織觀察發(fā)現(xiàn)，WT 莖桿表皮厚，厚壁組織細胞排列致密、細胞層數(shù)多、細胞形狀無規(guī)則、細胞大小從外層到內(nèi)層逐漸變大(圖6-A)；而突變體ad1 表皮薄，厚壁組織細胞排列松散、細胞層數(shù)減少、細胞形狀為橢圓型、細胞大小一致且排列均勻(圖6-B)。WT薄壁細胞結構清晰，細胞間隙明顯；而突變體ad1 薄壁細胞結構模糊且細胞間隙減小，排列松散，部分細胞的細胞結構受損。

表3 野生型(WT)和突變體ad1 光合特性Table 3 Photosynthetic characteristics of the wild type(WT) and mutant ad1

2.6 透射電鏡觀察葉綠體

利用透射電子顯微鏡觀察抽穗期WT 和突變體ad1 倒2 葉葉綠體超微結構。結果顯示，WT 葉片葉肉細胞內(nèi)葉綠體發(fā)育正常，結構完整，呈紡錘狀，基質(zhì)濃厚，基 粒 豐 富，片 層 垛 疊 排 列 緊 密、厚 實(圖7-A、B、C)。而突變體ad1 葉片內(nèi)部，葉綠體結構異常，淀粉顆粒明顯增多，類囊體排列紊亂，片層結構模糊，基粒垛疊松散(圖7-D、E、F)。說明突變體ad1中葉綠體降解加快，從而影響光合能力，導致產(chǎn)量降低。

2.7 組織化學染色

葉片衰老伴隨著大量細胞死亡，會造成機體細胞內(nèi)累積大量ROS。通過EB 染色(圖8-A)、DAB 染色(圖8-B)、NBT (圖8-C)染色結果，對比WT 和突變體ad1 倒2 葉發(fā)現(xiàn)，WT 倒2 葉葉片上均未染上顏色，突變體ad1 倒2 葉染色結果較深。說明WT 葉片中死細胞含量、H2O2含量、超氧陰離子含量較少，而突變體ad1 中死細胞含量、H2O2含量、超氧陰離子含量增多。對比突變體ad1 從劍葉到倒4 葉染色結果發(fā)現(xiàn)，染色逐漸加深。說明突變體ad1 葉片中死細胞含量、H2O2含量、超氧陰離子含量從新葉到老葉逐漸升高。

2.8 衰老相關參數(shù)的測定

在水稻衰老過程中，葉片內(nèi)ROS 大量積累，當ROS 水平超出防御機制所及范圍，細胞會處于氧化脅迫狀態(tài)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化、核酸損傷和酶失活，并能激活程序性細胞死亡[22]。抽穗期突變體ad1 劍葉、倒2 葉、倒3 葉中MDA 含量分別是WT 的2.99、3.11、1.40 倍。表明突變體ad1 葉片中機體脂質(zhì)過氧化的程度高，受到ROS 攻擊損失更嚴重。同時，抽穗期突變體ad1 的劍葉、倒2 葉、倒3 葉中SP 含量僅占WT 的49.24%、44.84%、47.58%。

通過檢測植物細胞內(nèi)ROS 相關清除機制發(fā)現(xiàn)，抽穗期突變體ad1 劍葉、倒2 葉、倒3 葉中的下T-SOD活性分別是WT 的144.56、5.01、1.66 倍；CAT 活性分別是WT 的10.15、3.14、3.36 倍；T-AOC 活性分別是WT 的0.58、1.25、3.12 倍(圖9)。說明伴隨突變體ad1 體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，突變體ad1 體內(nèi)抗氧化酶活性增加，使得突變體清除自由基能力增強。

2.9 遺傳分析

將突變體ad1 雜交，F(xiàn)1植株葉片為正常表型。F1自交得到出現(xiàn)性狀分裂的F2群體，對正常株和突變株數(shù)目進行卡方分析，不同組合的χ2＜χ20.05=3.84，均符合3∶1 的分離比(表4)。表明ad1 突變體表型特征由一對核隱性基因控制。

3 討論

水稻的衰老受到多種因素的調(diào)控影響。目前已經(jīng)鑒定出與水稻衰老有關的突變體，如esl6[23]、ospse1[24]、Psd128[25]、spl33[26]、es1-1[27]、spl3[28]、psd128[29]、rsl3[30]、lts1[31]、es3 (t)[32]、psls1[33]、spl29[34]、del1[35]、OsELF3.1[36]等，其早衰或遲衰現(xiàn)象的差異主要集中在生育期及表型的不同，這些差異受到基因調(diào)控，與環(huán)境無關，目前有關環(huán)境響應的衰老突變體研究較少。本研究的突變體ad1 在海南、合肥兩地種植的田間表型差異明顯。通過考察兩地環(huán)境氣差異候發(fā)現(xiàn)，溫度和光照可能是最主要的影響因素。在突變體ad1 抽穗成熟期，合肥最高溫度達到38℃，而海南最高溫度僅為33℃。同時田間觀察發(fā)現(xiàn)突變體ad1 衰老現(xiàn)象的發(fā)生伴隨著氣溫升高，且持續(xù)高溫天氣下(32℃以上)，突變體ad1 迅速衰老，推測突變體ad1 的衰老在受到光照影響的同時也受到高溫影響。由于海南、合肥兩地也存在氣候、生態(tài)等條件差異，因此后續(xù)計劃克隆相關的突變基因，通過對不同環(huán)境因子的響應試驗(高溫、光照、濕度等)，揭示這種早衰特性發(fā)生的具體機理。

表4 突變體ad1 的遺傳分析Table 4 Genetic analysis of mutant ad1

已有研究表明環(huán)境誘發(fā)水稻衰老主要通過高溫、強光等誘發(fā)產(chǎn)生自由基，引起生物膜相變和膜脂過氧化，加速植物衰老，同時葉片中SP 含量隨葉片衰老降低[37]。本研究通過染色及化學檢測發(fā)現(xiàn)突變體ad1體內(nèi)相關ROS:過氧化氫，超氧陰離子，MDA 含量升高；突變體ad1 葉片SP 含量降低，死細胞含量增多，證明突變體ad1 葉片衰老程度更高。在很多表型類似的早衰突變體中，如早衰突變體lmes3 和lmes4[4]的ROS相關清除機制受到了損傷。而本研究通過化學檢測發(fā)現(xiàn)，衰老突變體ad1 中ROS 相關的清除機制未受損，表現(xiàn)為CAT、T-SOD、T-AOC 含量均高于WT，因此，突變體ad1 衰老雖然受到自由基離子作用，但并不是突變體ad1 體內(nèi)ROS 清除機制受損造成的?？赡苡捎诃h(huán)境誘導突變體產(chǎn)生過量ROS，導致突變體中ROS 與其清除機制間的平衡被打破，ROS 水平超出防御機制所及范圍，細胞會處于氧化脅迫狀態(tài)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，并通過鏈式或鏈式支鏈反應放大ROS 的作用[38]，最終導致突變體ad1 主要的膜組織葉綠體受損，葉肉細胞減少，細胞死亡，引發(fā)植株早衰。

突變體ad1 在合肥生長產(chǎn)生衰老并且最終產(chǎn)生植株整體腐解現(xiàn)象，通過觀察突變體ad1 莖稈組織發(fā)現(xiàn):(1)腐解使突變體表皮變薄，厚壁組織細胞排列變得松散、細胞層數(shù)減少、細胞變大且排列均勻；(2)薄壁細胞結構模糊，細胞間隙變小，排列松散。推測突變體秸稈的結構改變是造成其最終發(fā)生完全腐解的原因。目前關于秸稈快速腐解的研究主要借助于相關理化技術以及微生物的作用[39]，從品種材料研究水稻秸稈腐解特性的報道相對較少。本研究通過對突變體ad1 衰老腐解的生物學研究，為探究水稻植株快速腐解提供了新材料。目前正在進行突變體目的基因定位相關工作，后續(xù)將進一步對該突變體基因進行克隆，從而從分子水平上進一步解釋造成該突變體衰老的原因，以及從分子機制上解釋高溫調(diào)控該突變體發(fā)生衰老腐解的機制。

4 結論

本研究結果表明，突變體ad1 是環(huán)境響應的早衰腐解植株，衰老程度受光照影響。與野生型水稻相比，突變體ad1 葉片葉肉細胞及氣孔受損，莖稈厚壁細胞減少，葉綠體結構異常，光合色素減少，植株光合作用受到明顯抑制。突變體ad1 衰老過程中葉片內(nèi)清除ROS 的相關保護酶CAT、T-SOD、T-AOC 活性上升，但是ROS 仍然大量積累，死細胞、過氧化氫以及超氧陰離子增多，MDA 含量升高，SP 含量降低，最終造成農(nóng)藝性狀受損。遺傳分析表明ad1 突變表型受一對隱性核基因控制。本研究結果為突變體ad1 基因定位和基因功能研究奠定了一定的理論基礎。