星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化柴胡皂苷提取工藝研究

趙艷丹，趙艷潔，李小陽，宋麗華

（1.錦州紫金藥業(yè)有限公司，遼寧 錦州121001；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六八醫(yī)院，遼寧 錦州121001）

柴胡（Bupleurum chinense）為傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根。柴胡始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《傷寒論》為最早運(yùn)用柴胡的醫(yī)學(xué)類著作。柴胡具有解熱、保肝、抗菌、抗腫瘤等作用［1，2］。《中華人民共和國藥典》以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為指標(biāo)控制成分，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d是抗炎、抗病毒主要活性成分［3，4］。

響應(yīng)面法是通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立數(shù)學(xué)模型，篩選最優(yōu)條件的統(tǒng)計(jì)分析方法。傳統(tǒng)的單因素分析不考慮各因素之間的影響，響應(yīng)面法可以評(píng)估各影響因素的相互作用，建立連續(xù)表面模型，預(yù)測(cè)結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果接近，在研究中得到廣泛的應(yīng)用［5，6］。響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，可以評(píng)價(jià)各因素與響應(yīng)值間的關(guān)系，使準(zhǔn)確度提高，指導(dǎo)性強(qiáng)［7］。

目前，提取柴胡皂苷的方法主要有乙醇提?。?］，其提取效率高，但也存在溶劑殘留問題。中藥防病治病是中華民族幾千年來寶貴的傳承，多采用水煎法進(jìn)行服用。本研究以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，采用傳統(tǒng)水提工藝提取柴胡皂苷，以響應(yīng)面法研究優(yōu)化提取的因素，以便更好地發(fā)揮藥效。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

樣品和試劑：柴胡藥材，來自山西省長治市，符合《中華人民共和國藥典》的標(biāo)準(zhǔn)。柴胡皂苷a對(duì)照品（批號(hào)110777-200507，純度為93.2%）、柴胡皂苷d對(duì)照品（批號(hào)110778-200505，純度為97.3%）均購自中國食品藥品檢定研究所。乙腈、甲醇為色譜純，氨水、正丁醇為分析純。

L-2130型高效液相色譜儀、L-2455DAD型檢測(cè)器（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 柴胡皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取柴胡皂苷a對(duì)照品與柴胡皂苷d對(duì)照品，加甲醇制成含柴胡皂苷a 1.93 mg/mL、柴胡皂苷d 2.43 mg/mL的溶液。再分別稀釋得到含0.077、0.193、0.386、0.772、1.930 mg/mL柴 胡 皂 苷a，含0.097、0.243、0.486、0.972、2.430 mg/mL柴胡皂苷d的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 供試品溶液的制備取柴胡粉末10 g，加水80 mL，減壓加熱提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，放冷。在-80℃冷凍干燥，制得柴胡皂苷提取物。取上述柴胡皂苷提取物，加水20 mL溶解，用飽和正丁醇60 mL萃取3次，再用5%氨水50 mL洗2次，分取飽和正丁醇并蒸干［9］，用甲醇10 mL溶解殘?jiān)?，過濾，得到柴胡皂苷供試品。

色譜條件：Hypersil BDS C18色譜柱（250 mm×46 mm，5μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～50 min（25%～90%A），50～55 min（90%A），55～60 min（90%～25%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長為210 nm［10］。

1.2.3 柴胡皂苷類成分的單因素試驗(yàn)以柴胡皂苷類成分提取含量為指標(biāo)，考察提取次數(shù)對(duì)柴胡皂苷類成分提取含量的影響，進(jìn)行單因素分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

準(zhǔn)確稱取10 g柴胡粉末，放入燒瓶中，在提取溫度80℃、液料比8∶1（mL∶g，下同），減壓加熱回流提取60 min的條件下，考察提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）對(duì)柴胡皂苷類成分提取含量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化柴胡提取工藝在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 8.05軟件，采用CCD（Central composite design）設(shè)計(jì)試驗(yàn)［11，12］。選擇主要的3個(gè)影響因素：提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、液料比（C）為自變量，柴胡皂苷類成分提取含量為因變量，每個(gè)因素設(shè)計(jì)5個(gè)水平，分別用-α、-1、0、1、α（α=1.682）表示，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 CCD設(shè)計(jì)影響因素和水平

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin 75軟件作圖，采用Design Expert 8.05軟件進(jìn)行CCD響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴胡皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

柴胡皂苷a濃度與峰面積擬合的回歸方程為Y=7 963.4X+59 797，R2=0.999 8；柴胡皂苷d濃度與峰面積擬合的回歸方程為Y=8 137.1X-150.59，R2=0.999 7。柴胡皂苷a的質(zhì)量濃度在0.077～1.930 mg/mL，柴胡皂苷d的質(zhì)量濃度在0.097～2.43 mg/mL范圍有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，提取2次比提取1次柴胡皂苷類成分提取含量增加明顯，提取第3、4、5次后柴胡皂苷類成分提取含量變化不大，從節(jié)約能源和縮短試驗(yàn)周期角度考慮，最終確定提取次數(shù)為2次。提取次數(shù)為非連續(xù)變量，未將提取次數(shù)作為后續(xù)優(yōu)化因素。

圖1 提取次數(shù)對(duì)柴胡皂苷類成分提取含量的影響

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 模型擬合將數(shù)據(jù)用Design Expert 8.05軟件進(jìn)行響應(yīng)面法分析，以柴胡皂苷類成分提取含量為響應(yīng)值，分別對(duì)各影響因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合，試驗(yàn)結(jié)果見表2。對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，用二階多項(xiàng)式回歸較優(yōu)，得到柴胡皂苷類成分提取含量（Y）為響應(yīng)值，3個(gè)參數(shù)（A、B、C）為自變量的二次回歸方程模型為Y=-2.361+0.020A+0.057B+0.316C-1.25×105AB+6.25×105AC-6.25×105BC-1.569×104A2-3.511×104B2-0.019C2（r2=0.970 6，P＜0.01）。

表2 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.3.2 方差分析和顯著性檢驗(yàn)采用Design Expert 8.05軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

圖2 提取時(shí)間與提取溫度對(duì)柴胡皂苷類成分提取含量影響的響應(yīng)曲面和等高線

表3 的回歸方差分析結(jié)果表明，響應(yīng)面的回歸模型F=36.72，P＜0.000 1，說明該模型極顯著。模型的失擬項(xiàng)F=4.13，P=0.073＞0.05，對(duì)柴胡皂苷類成分提取含量影響不顯著，說明該模型回歸方程不失擬，試驗(yàn)誤差小，能充分反映實(shí)際情況，可用作模型分析。從表3還可以看出，因素一次項(xiàng)A和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著（P＜0.05），交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著（P＞0.05）。各因素對(duì)柴胡皂苷類成分提取含量影響程度依次為提取時(shí)間＞液料比＞提取溫度。

表3 CCD方差分析結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面和等高線，分析提取時(shí)間、提取溫度、液料比等因素及其交互作用對(duì)柴胡皂苷類成分提取含量的影響，結(jié)果分別見圖2、圖3、圖4。

圖3 提取時(shí)間與液料比對(duì)柴胡皂苷類成分提取含量影響的響應(yīng)曲面和等高線

圖4 提取溫度與液料比對(duì)柴胡皂苷類成分提取含量影響的響應(yīng)曲面和等高線

通過響應(yīng)面坡度的陡峭程度、等高線橢圓形狀可以反映出2個(gè)因素交互作用的強(qiáng)度。坡度平緩說明因素間交互作用弱。當(dāng)條件改變時(shí)，對(duì)響應(yīng)值影響不大。相反，坡面陡峭說明因素間交互作用強(qiáng)，當(dāng)條件改變時(shí)，響應(yīng)值變化大。等高線為橢圓形表示交互作用顯著，接近圓形表示交互作用不顯著。因此，由圖2、圖3和圖4可知，提取時(shí)間和溫度、提取溫度和液料比、提取時(shí)間和液料比的交互作用都不顯著，與上述方差分析和顯著性分析相符。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)優(yōu)化后的回歸方程進(jìn)行分析，在各試驗(yàn)因素水平范圍內(nèi)水提取柴胡皂苷類成分的最佳參數(shù)為提取時(shí)間63.33 min、提取溫度78.99℃、液料比8.12∶1.00，在此最佳工藝條件下柴胡皂苷類成分的最大提取含量為1.81 mg/g。

為了驗(yàn)證回歸模型的有效性，考慮試驗(yàn)的可行性、便捷性和可操作性，對(duì)預(yù)測(cè)的工藝參數(shù)進(jìn)行微調(diào)，選擇提取時(shí)間60 min、提取溫度80℃、液料比8∶1，提取2次的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，柴胡皂苷類成分提取含量分別為1.80、1.79、1.82 mg/g，實(shí)際平均提取含量為1.80 mg/g，與預(yù)測(cè)值1.81 mg/g偏差較小。結(jié)果表明該模型合理，有效地對(duì)水提取柴胡工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

3 小結(jié)與討論

肖功勝等［13］采用單因素試驗(yàn)篩選主因素和水平，以正交試驗(yàn)篩選柴胡有效成分提取最佳工藝。Zhao等［14］研究了超聲波輔助提取柴胡中柴胡皂苷的方法，考察了時(shí)間、溫度、超聲功率、粒徑、溶劑固體比和溶劑濃度等因素對(duì)目標(biāo)組分收率的影響，結(jié)果表明，超聲波輔助提取的提取速度比傳統(tǒng)的熱提取快6倍。衛(wèi)昊等［15］研究采用HPLC法測(cè)定秦嶺柴胡及其不同溶劑提取部位中柴胡皂苷a和b的方法，結(jié)果表明，柴胡皂苷a在2.160～28.875μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，平均回收率為98.31%，RSD為1.04%；柴胡皂苷b在0.144～1.800 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，平均回收率為97.00%，RSD為1.12%。本研究以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，以柴胡皂苷類成分提取含量為衡量指標(biāo)，對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行了單因素考察，確定了提取次數(shù)為2次，同時(shí)明確了各影響因素的試驗(yàn)范圍。采用傳統(tǒng)水提工藝，以響應(yīng)面法研究優(yōu)化提取的因素，以便更好地發(fā)揮藥效。

采用CCD響應(yīng)面分析法進(jìn)行柴胡皂苷提取工藝的優(yōu)化，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，P＜0.000 1，表明模型具有顯著性。得到最佳工藝條件，提取時(shí)間60 min、提取溫度80℃、液料比8∶1，提取2次。在此優(yōu)化條件下柴胡皂苷類成分的實(shí)際提取含量為1.80 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值1.81 mg/g較為接近。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，試驗(yàn)建立的模型有較好的預(yù)測(cè)性，采用CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化柴胡皂苷類成分的提取工藝可行。整個(gè)工藝流程操作方便，研究結(jié)果為柴胡皂苷類成分的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。