槲皮素對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜血管新生的影響

褚小磊,柴繼俠,郭 帥,王元元,陳傳好*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，蚌埠 233030；2組織移植安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3蚌埠醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；4感染與免疫安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；*通訊作者,E-mail:cch711124@sina.com；#共同通訊作者，E-mail:wanyuanyuantcm@126.com)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是常見的自身免疫性炎癥性關(guān)節(jié)病[1]。目前認(rèn)為主要的病因包括遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、環(huán)境、生活方式的改變，這些因素共同導(dǎo)致慢性炎癥、血管新生、關(guān)節(jié)破壞，甚至引起進(jìn)展性殘疾、全身并發(fā)癥、早期死亡[2]。血管新生(angiogenesis)是從現(xiàn)有血管重生新血管，是新組織發(fā)育、生長(zhǎng)和組織修復(fù)的重要方面，在RA早期階段起著關(guān)鍵作用[3]。近年來(lái)，許多研究證明血管新生在炎癥和免疫應(yīng)答持續(xù)存在的過程中發(fā)揮著重要作用，并支持RA血管翳生長(zhǎng)和發(fā)展[4]。同時(shí)，已有研究表明在RA中阻斷血管新生可以抑制滑膜炎癥以及血管翳形成[5-7]。有針對(duì)性的免疫治療和積極的治療策略大大改善了病情的進(jìn)展，但目前還沒有治愈的方法，同時(shí)，服用這類藥物通常會(huì)發(fā)生各種不同的副作用，且費(fèi)用高，這使得臨床應(yīng)用受到限制[8]。亟待尋找新型潛在的藥物。槲皮素(quercetin，QUE)是眾多天然類黃酮化合物中的一種，存在于多種水果和蔬菜中，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，包括抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)[9,10]，以及抑制毛細(xì)血管通透性和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[11]，同時(shí)毒副作用小，可以作為一種有前景的安全治療策略[12]。在RA中進(jìn)行的一系列體內(nèi)外研究表明，槲皮素通過多種途徑影響RA疾病的進(jìn)展。因此，本文研究槲皮素在RA中是否具有抗血管新生作用，以及潛在的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑

槲皮素(純度98%)和DMSO(純度99%)分別購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司和德國(guó)Biofroxx公司。不完全弗氏佐劑(IFA)和牛Ⅱ型膠原(C Ⅱ)獲自美國(guó)Chondrex公司。兔抗大鼠HIF-1α、兔抗大鼠CD34、小鼠抗大鼠VEGFA和二抗(山羊抗兔免疫球蛋白G辣根過氧化物酶)、ELISA試劑盒均購(gòu)買自武漢Abclonal公司。一抗β-actin、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PMSF、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、RIPA裂解緩沖液均產(chǎn)于上海Beyotime公司。山羊血清購(gòu)買于武漢Elabscience Biotechnology公司。檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、蘇木精、伊紅染料購(gòu)自北京Solarbio公司。

1.2 動(dòng)物

從濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司獲得24只SPF級(jí)雄性SD大鼠(體質(zhì)量180-220 g)，合格證號(hào)：SCXK(魯)20190003。飼養(yǎng)溫度26-28 ℃，光照12 h，均自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行整個(gè)實(shí)驗(yàn)。該研究所有協(xié)議均由蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)(審查編號(hào)2020-084)。

1.3 方法

1.3.1 膠原誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型的建立和槲皮素治療 為明確槲皮素對(duì)關(guān)節(jié)炎的影響，采用SD大鼠通過以下步驟[13]建立CIA模型：C Ⅱ溶解于0.01 mol/L醋酸中配制成2 mg/ml濃度，在4 ℃下過夜，然后與等體積的2 mg/ml IFA充分乳化后于第0天在大鼠尾根部皮內(nèi)注射(0.2 ml)誘導(dǎo)炎癥(初次免疫)。初次免疫后第7天，在大鼠右后肢皮內(nèi)注射相同體積的該乳劑，以增強(qiáng)初次免疫(第2次免疫)。將無(wú)關(guān)節(jié)腫脹體征的動(dòng)物移除。CIA大鼠隨機(jī)分為：CIA組(n=6)和QUE組(n=6)，并選擇6只正常大鼠作為正常對(duì)照組(control)。以往研究表明，在CIA大鼠模型中，給予QUE(150 mg/kg)可顯著改善大鼠關(guān)節(jié)炎癥[14]，所以本實(shí)驗(yàn)采用該劑量灌胃。在初次免疫后第14天，每天1次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(初次免疫后35 d)，QUE粉末溶解于0.05% DMSO溶液中，QUE組按150 mg/kg體質(zhì)量(下同)經(jīng)口灌胃給藥；control組和CIA組僅給予等體積0.05% DMSO溶液。

1.3.2 關(guān)節(jié)炎評(píng)價(jià) 關(guān)節(jié)炎病變程度參考文獻(xiàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估[15]。在初次誘導(dǎo)后的第14天開始，每3 d由兩個(gè)獨(dú)立的觀察者進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分的評(píng)估：0分，沒有紅腫；1分，腳趾和腳踝輕度腫脹；2分，腳趾和腳踝中度腫脹；3分，腳趾和腳踝嚴(yán)重腫脹；4分，整個(gè)腳掌腫脹，有強(qiáng)直。四只足爪的得分相加，最大得分為16分，表示最嚴(yán)重的程度，同時(shí)測(cè)量每只大鼠左后肢足爪體積以及大鼠體質(zhì)量，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3.3 組織病理學(xué)評(píng)估 初次免疫后第35天，在10%水合氯醛麻醉后，通過頸椎脫臼法處死大鼠。解剖雙后肢踝關(guān)節(jié)，立即在4%多聚甲醛中固定24 h。在4 ℃下，10% EDTA中脫鈣處理1個(gè)月，每隔1 d更換脫鈣液。包埋在石蠟中，組織切片(4 μm)固定在普通玻片上，蘇木精伊紅(HE)染色。由兩名專業(yè)的病理學(xué)觀察者對(duì)所有切片進(jìn)行隨機(jī)分組和評(píng)價(jià)，觀察者對(duì)給藥組和每只大鼠的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度設(shè)盲。數(shù)據(jù)表示為平均滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、血管翳形成、軟骨侵蝕評(píng)分。使用5個(gè)高倍放大視野(HPFs)平均值評(píng)分進(jìn)行分析，關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分見表1[16]。

表1 關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分

1.3.4 免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)CD34、VEGFA、HIF-1α蛋白表達(dá) 采用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-biotin-peroxidase，SP)法進(jìn)行操作。將組織石蠟切片在68 ℃下烘烤20 min。用二甲苯對(duì)組織進(jìn)行脫蠟，梯度乙醇(由高到低)水化，將切片浸泡在檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中，95 ℃加熱約15 min，隨后用0.3%過氧化氫處理以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶活性，然后用PBS溶液洗滌3次×5 min，添加山羊血清封閉液后在室溫下放置20 min，用PBS溶液浸洗3次×3 min后分別將切片與CD34(1 ∶100)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)(1 ∶150)、HIF-1α(1 ∶200)的一抗孵育在4 ℃下過夜，再次用PBS溶液浸洗5次×5 min，然后用相應(yīng)的二抗在37 ℃孵育1 h，接著用PBS洗滌。使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行著色，蘇木精復(fù)染2 min，常規(guī)脫水，透明和固定后中性樹膠封片，最后進(jìn)行顯微鏡觀測(cè)。使用血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原CD34作為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)踝關(guān)節(jié)4 μm厚石蠟包埋切片進(jìn)行微血管和單內(nèi)皮細(xì)胞染色?；?-3等級(jí)評(píng)分(見表1)，觀察滑膜微血管密度，并評(píng)估滑膜組織CD34、VEGFA、HIF-1α蛋白表達(dá)情況，在200倍光學(xué)視野下選擇最豐富的血管區(qū)域，然后在400倍光學(xué)視野下計(jì)數(shù)5個(gè)高微血管密度區(qū)域的并取平均值。用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行累積光密度(IOD)評(píng)估，結(jié)果表示為平均感興趣區(qū)域，表示在放大倍數(shù)為400倍時(shí)每張圖像被陽(yáng)性染色細(xì)胞覆蓋的面積百分比[17]。

1.3.5 免疫印跡(Western blotting)檢測(cè)VEGFA和CD34蛋白表達(dá) 在初次免疫后第35天，無(wú)菌環(huán)境下分離大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜，簡(jiǎn)言之，大鼠在10%水合氯醛麻醉后，固定下肢、消毒、鋪巾，沿髕骨前方縱行切開皮膚及皮下組織，暴露髕韌帶，沿髕骨下緣橫斷髕韌帶，暴露并分離滑膜，淡黃色的軟組織即為滑膜(見圖1)。在RIPA裂解緩沖液中使用組織研磨機(jī)裂解關(guān)節(jié)滑膜組織，并在12 000g下離心10 min，得到蛋白提取物，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。通過6%和12% SDS-PAGE電泳分離關(guān)節(jié)滑膜組織蛋白，并轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜上，用3%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，一抗(VEGFA、CD34、β-actin)分別按1 ∶500、1 ∶500、1 ∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗3次，每次10 min，二抗按1 ∶8 000稀釋，室溫下孵育2 h，TBST溶液洗3次。使用ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對(duì)膜進(jìn)行曝光并獲取圖像。

A.固定、消毒、鋪巾 B.切開皮膚及皮下組織 C.切開髕韌帶、分離暴露滑膜 D.獲取滑膜圖1 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的分離和提取Figure 1 Isolation and extraction of rat synovial tissue

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β、IL-17表達(dá)水平 在初次免疫后第35天采集大鼠血清，3 000 r/min離心15 min后，使用ELISA試劑盒(武漢Abclonal公司)，在450 nm和570 nm處測(cè)定吸光度，檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-17表達(dá)水平。每個(gè)指標(biāo)進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素可延緩CIA大鼠關(guān)節(jié)炎進(jìn)展并降低關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度

從初次免疫后第14天開始，觀察到CIA組大鼠關(guān)節(jié)明顯腫脹，槲皮素治療后關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕(見圖2)。CIA組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分逐漸升高，在第30天左右達(dá)到高峰與control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；QUE組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分在初次免疫后第26天開始，評(píng)分逐漸下降,與CIA組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。從第14天開始，CIA組大鼠體質(zhì)量逐漸下降，在第23天左右達(dá)到最低，之后升高并維持相對(duì)較低的水平，與control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2)；QUE組大鼠體質(zhì)量從初次免疫后第26天開始逐漸上升，但是與CIA組相比無(wú)明顯差異。CIA大鼠左后足體積從第14天開始升高，與control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖2)；與CIA模型組相比較，從初次免疫后第20天開始，槲皮素能顯著降低關(guān)節(jié)炎大鼠足爪體積(P<0.05，見圖2)。

2.2 槲皮素減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常，滑膜無(wú)增生、水腫，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，未見血管翳，軟骨基質(zhì)和軟骨細(xì)胞無(wú)損壞；CIA大鼠具有顯著的關(guān)節(jié)炎組織病理學(xué)變化，包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、血管翳以及骨、軟骨破壞；然而，槲皮素治療明顯減輕CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎組織病理學(xué)變化(見圖3)。

與control比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；與CIA組比較，#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001圖2 槲皮素對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分、體質(zhì)量、足爪體積影響Figure 2 Effect of quercetin on arthritis score, body weight and foot and paw volume in CIA rats

與CIA組比較，#P<0.05，##P<0.01圖3 槲皮素對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程及組織病理學(xué)變化的影響Figure 3 Effect of quercetin on the pathogenesis and histopathological changes of arthritis in CIA rats

與CIA組比較，QUE組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)嚴(yán)重程度評(píng)分、滑膜炎性評(píng)分、滑膜增生評(píng)分、血管翳評(píng)分、軟骨侵蝕評(píng)分均明顯降低(P<0.05，見圖3)。

2.3 槲皮素抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織血管新生

CIA組大鼠炎癥關(guān)節(jié)滑膜組織中存在大量CD34、VEGFA、HIF-1α陽(yáng)性染色，而QUE組大鼠炎癥關(guān)節(jié)滑膜組織中的CD34、VEGFA、HIF-1α染色明顯減弱(見圖4)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與control組比較，CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中的微血管密度以及CD34、VEGFA、HIF-1α的表達(dá)均升高(均P<0.01，見圖4)；與僅接受0.05% DMSO溶液給藥的CIA大鼠相比，150 mg/kg槲皮素可顯著降低CIA大鼠炎癥關(guān)節(jié)滑膜組織中的微血管密度以及滑膜組織中CD34、VEGFA、HIF-1α的表達(dá)(均P<0.01，見圖4)。

2.4 槲皮素對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中VEGFA、CD34的影響

采用Western blotting分析檢測(cè)滑膜組織中VEGFA和CD34蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，與control組相比，CIA組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中VEGFA和CD34的表達(dá)升高(P<0.01，見圖5)。相比于CIA組，QUE組CD34表達(dá)無(wú)明顯變化，VEGFA表達(dá)明顯降低(P<0.01，見圖5)。

與control組比較，**P<0.01；與CIA組比較，##P<0.01圖4 槲皮素對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中微血管密度以及CD34,VEGFA,HIF-1α的影響Figure 4 Effect of quercetin on density of synovial blood vessels in collagen-induced arthritis rats and expression of CD34, VEGFA, HIF-1α in joint synovium

與control組比較，**P<0.01；與CIA組比較，##P<0.01圖5 Western blotting檢測(cè)槲皮素對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中VEGFA、CD34的影響Figure 5 Effect of quercetin on VEGFA and CD34 in the synovium of CIA rats by Western blotting

2.5 槲皮素對(duì)CIA大鼠血清TNF-α和IL-1β、IL-17水平的影響

采用ELISA檢測(cè)初次免疫后第35天大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-17的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與control組相比，CIA組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-17水平升高(P<0.01，見圖6)。與CIA組比較，槲皮素組CIA大鼠血清中的TNF-α、IL-1β和IL-17明顯抑制(P<0.05-0.01，見圖6)。

與control組比較，**P<0.01；與CIA組比較，#P<0.05，##P<0.01圖6 槲皮素對(duì)血清TNF-α、IL-17、IL-1β水平的影響Figure 6 Effect of quercetin on plasma levels of TNF-α, IL-17 and IL-1β

3 討論

RA是一種復(fù)雜的免疫介導(dǎo)疾病，臨床表現(xiàn)主要涉及滑膜炎癥和關(guān)節(jié)損傷。大約每千人中有5例發(fā)生，并可能導(dǎo)致嚴(yán)重的關(guān)節(jié)損傷和殘疾[18]。目前在藥物治療方面，非甾體抗炎藥或止痛藥以及糖皮質(zhì)激素類藥物并不能阻止損傷的進(jìn)展和不可逆轉(zhuǎn)的殘疾，而只改善癥狀，抗風(fēng)濕藥物(DMARDs)分為合成的(口服小化學(xué)分子)和生物的(非腸道注射的蛋白質(zhì))制劑，使用DMARDs治療可以干預(yù)RA的體征和癥狀，改善身體功能，并抑制關(guān)節(jié)損傷進(jìn)展[19]。但是每一種藥物效價(jià)是有限的，研究表明，將近40%的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者實(shí)現(xiàn)了低活動(dòng)性，約20%的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者得到緩解。且大多數(shù)生物DMARDs和靶向合成DMARDs都存在感染風(fēng)險(xiǎn)等副作用。除此之外，高昂的費(fèi)用也限制了這些藥物的使用[20]。所以需要尋找潛在的藥物以改善RA疾病的進(jìn)展。

具有抗氧化和抗炎性質(zhì)的天然化合物可被用作治療關(guān)節(jié)炎[21]。槲皮素是在水果、蔬菜、漿果和紅茶中含量豐富的主要天然類黃酮化合物之一，已證實(shí)槲皮素具有抗癌、抗氧化和抗炎特性[22]。研究發(fā)現(xiàn)，在體外實(shí)驗(yàn)中槲皮素可以促使類風(fēng)濕滑膜成纖維細(xì)胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RA-FLSs)凋亡[23,24]，并抑制其增殖[25]。在大鼠CIA模型中，以150 mg/kg劑量經(jīng)口給予槲皮素能夠顯著下調(diào)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)[26]。在雞胚絨毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane，CAM)模型中槲皮素能夠抑制血管新生[27]。研究還發(fā)現(xiàn)槲皮素可以抑制血管新生發(fā)揮抗腫瘤作用[28]。血管新生在RA發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用[3]。因此，靶向血管新生對(duì)RA治療有很大的潛力。然而，對(duì)于槲皮素能否減緩RA血管新生進(jìn)程的研究相對(duì)不足，所以該研究旨在明確槲皮素對(duì)于RA血管新生的影響，并進(jìn)一步了解其作用機(jī)制和潛在的治療靶點(diǎn)，以便有效地將槲皮素用于RA的治療。

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)與RA在臨床發(fā)病以及病理表現(xiàn)方面存在較多相似的特征，是研究RA發(fā)病機(jī)制最常用的動(dòng)物模型[29]。本研究中，大多數(shù)大鼠在初次免疫后約14 d出現(xiàn)CIA典型的足爪發(fā)紅、腫脹(見圖2)。而在槲皮素處理的大鼠中，觀察到平均關(guān)節(jié)炎評(píng)分和足爪體積明顯降低，從而關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度明顯減弱。此外，關(guān)節(jié)組織病理學(xué)結(jié)果表明，槲皮素治療可顯著改善CIA大鼠關(guān)節(jié)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、血管翳形成、軟骨和骨侵蝕(見圖3)。這些病理變化是RA重要的特征表現(xiàn)。ELISA結(jié)果表明，槲皮素可以降低CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中的細(xì)胞因子的釋放，從而減輕關(guān)節(jié)炎癥(見圖6)。綜合這些結(jié)果表明，槲皮素能夠有效阻止CIA大鼠關(guān)節(jié)炎進(jìn)展并降低關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。

血管新生在RA中主要參與血管翳形成并維持滑膜的浸潤(rùn)[30]。本研究中，為了評(píng)估槲皮素產(chǎn)生抗血管新生作用，通過免疫組織化學(xué)對(duì)關(guān)節(jié)滑膜組織中用于可視化血管新生的標(biāo)志物CD34進(jìn)行染色。槲皮素治療后，CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中微血管密度顯著降低(見圖4)。這表明槲皮素能在CIA中發(fā)揮有效的抗血管新生作用。本文進(jìn)一步探索槲皮素在CIA中發(fā)揮抗血管新生的的潛在機(jī)制。以往的體外和體內(nèi)研究證實(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)作為效果突出的促血管生成因子，在RA滑膜組織中高表達(dá)[5]。VEGFA結(jié)合其受體，通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮特異性作用，包括釋放多種生長(zhǎng)因子和炎性因子，加速內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，參與新血管的調(diào)節(jié)和生成，最終導(dǎo)致大量新生血管產(chǎn)生[31]。VEGFA在RA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[32]。VEGFA的表達(dá)下調(diào)可明顯減輕血管生成以及滑膜炎癥[33]。同時(shí)，RA關(guān)節(jié)缺氧環(huán)境與滑膜血管過度形成相互影響。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)在缺氧條件下大量表達(dá)，可促進(jìn)缺氧增加的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[34]。研究表明，在CIA大鼠中抑制HIF-1α可減少大鼠關(guān)節(jié)炎癥和血管生成[33]。本研究IHC與Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示槲皮素在體內(nèi)可以抑制CIA大鼠滑膜中VEGFA的表達(dá)。同時(shí)在IHC實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)槲皮素可以抑制HIF-1α、CD34的表達(dá)(見圖4)，而在Western blotting實(shí)驗(yàn)中CD34的表達(dá)沒有明顯變化(見圖5)。

總之，本文結(jié)果表明，槲皮素可能通過下調(diào)HIF-1α和VEGFA的表達(dá)，在體內(nèi)對(duì)RA產(chǎn)生抗血管新生作用。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)槲皮素在RA發(fā)病機(jī)制中的作用的提供了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，并表明槲皮素可能是治療RA的一種有潛力治療藥物。