miR-16 在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展中的作用及初步機(jī)制研究

查 晴，于晨溪，劉 亞，楊 玲，葉佳雯，劉 艷

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200011；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200025）

冠心病為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊引起血管腔狹窄、阻塞或功能性改變導(dǎo)致心肌缺血或壞死，是最常見的心血管疾病[1]。近年來，我國的冠心病患病率逐年增高，2019 年估計(jì)我國的冠心病患者已達(dá)1 100 萬例，且農(nóng)村地區(qū)的冠心病死亡率明顯上升，2017 年農(nóng)村居民冠心病死亡率為122.04/10萬，超過城市水平[2]。遺傳因素、脂代謝紊亂、內(nèi)皮損傷、平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、內(nèi)源性免疫調(diào)控異常及炎癥反應(yīng)等是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制[1,3]。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成大致可分為脂紋、纖維斑塊和粥樣斑塊3 個(gè)階段[4]，在整個(gè)過程中可觀察到低密度脂蛋白 （low density lipoprotein,LDL）透過內(nèi)皮細(xì)胞深入內(nèi)皮細(xì)胞間隙，促使單核細(xì)胞遷入內(nèi)膜；進(jìn)而氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,oxLDL） 與巨噬細(xì)胞表面清道夫受體結(jié)合并被攝取，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞；之后，血管中層平滑肌細(xì)胞大量增殖、遷移，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)形成纖維帽，待oxLDL 累積后，泡沫細(xì)胞壞死、崩解，釋放炎癥因子，最終形成粥樣斑塊[4]。在這一病理過程中，oxLDL 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，后者大量凋亡和釋放炎癥因子，是導(dǎo)致纖維斑塊向粥樣斑塊進(jìn)展的重要病理機(jī)制[4-6]。在粥樣斑塊組織中，泡沫細(xì)胞大量浸潤和形成，其凋亡顯著高于纖維斑塊中的泡沫細(xì)胞[7]。

微小RNA（microRNA,miRNA，miR）調(diào)控多種參與動(dòng)脈粥樣硬化病理生理過程的細(xì)胞功能，但其對(duì)泡沫細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制目前尚不明確[8]。miRNA 是由21～25 個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，其與靶mRNA 的3′-非翻譯區(qū) （3′-untranslated region,3′-UTR）結(jié)合，調(diào)控靶mRNA 的翻譯和降解，在調(diào)控心血管組織中細(xì)胞的分化、發(fā)育和凋亡等中發(fā)揮重要作用[9]。以往研究表明，miR-146a 不僅可經(jīng)TLR4-Myd88-IRAK1-TRAF6-NFκ B 細(xì)胞信號(hào)通路控制炎癥反應(yīng)，還可經(jīng)TLR4-Src-FAK-JNK 細(xì)胞信號(hào)通路控制細(xì)胞吞脂[10]。然而，關(guān)于miR-16 在調(diào)節(jié)斑塊局部炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促進(jìn)炎癥還是抑制炎癥的作用，以及其在粥樣斑塊進(jìn)展中發(fā)揮促進(jìn)還是抑制作用，目前仍存在爭議[11-12]。本研究采用miRNAs 微陣列芯片（miRNAs array）檢測及比較冠心病患者的冠狀動(dòng)脈纖維斑塊與粥樣斑塊中miR-16 的表達(dá)情況，并建立oxLDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞模型，初步探究miR-16 在調(diào)控冠狀動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，這可能為將來控制冠狀動(dòng)脈斑塊進(jìn)展及預(yù)防和治療冠心病提供新的靶點(diǎn)。

材料與方法

一、材料

1.組織獲?。哼x取2016 年6 月至2017 年6 月間的16 例冠心病患者（排除風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病及炎癥性疾?。谢颊呔邮芰斯跔顒?dòng)脈旁路移植術(shù)治療，于術(shù)中獲取冠狀動(dòng)脈斑塊組織。所有患者均簽署書面知情同意書，且本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意。

2.細(xì)胞及試劑：THP-1 細(xì)胞 （人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞，在佛波肉荳蔻醋酸誘導(dǎo)下向單核系方向分化） 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞中心。本研究所用試劑中，10%胎牛血清、1×磷酸鹽緩沖液、100×雙抗（青霉素和鏈霉素）、100×三抗（青霉素、鏈霉素和兩性霉素）、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）、含1‰吐溫20 的磷酸鹽緩沖液均購自Gibco 公司（美國）。RPMI-1640 培養(yǎng)基、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測相關(guān)炎癥因子[白細(xì)胞介素（interleukin,IL）-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9,MMP-9）]購自Invitrogen 公司（美國），TUNNEL 檢測試劑盒購自Promega 公司 （美國）。miRNA 轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞使用lipofectamine 2000，由Invitrogen 公司提供，miR-16 由上海吉?jiǎng)P公司合成并提供。RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)PCR 檢測試劑盒由日本TaKaRa 公司提供，miRNAs array由Affymetrix 公司提供 （Affymetrix miRNA 4.0，美國）。

二、方法

1.冠狀動(dòng)脈組織的處理和分組：術(shù)后將患者的冠狀動(dòng)脈組織送病理學(xué)檢查，對(duì)組織切片行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色，根據(jù)斑塊特征分為纖維斑塊型及粥樣斑塊型（見圖1）。采用miRNAs array 檢測miR-16 在冠狀動(dòng)脈纖維斑塊和粥樣斑塊中的表達(dá)情況。

圖1 冠狀動(dòng)脈纖維斑塊及粥樣斑塊病理圖片

2.反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及miRNAs array 檢測：用RNeasy Mini Kit 抽提細(xì)胞的總RNA 共10 μg，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后獲得用生物素標(biāo)記的cRNA。取10 μg的cRNA 雜交Affymetrix miRNA 4.0 芯片，一共檢測2 000 個(gè)miRNA 的表達(dá)情況?；蛐酒褂肎eneChip Scanner 3000 掃描雜交信號(hào)，用分析軟件GeneSpring GX 7.3.1 對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行均一化、篩選以及基因功能分類分析，利用隨機(jī)方差模型，計(jì)算每個(gè)miRNA 的P 值和誤判率 （false discovery rate,FDR），篩選出在2 種斑塊間差異表達(dá)的基因（表達(dá)變化>1.5 或<0.5，P<0.05）。

2.佛波肉荳蔻醋酸誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞：將THP-1 細(xì)胞用含10%胎牛血清（Gbico公司，美國）的RPMI-1640 培養(yǎng)基（Invitrogen），在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)THP-1 細(xì)胞至106/mL；換為無血清培養(yǎng)基，加入佛波肉荳蔻醋酸至終濃度為100 nmol/L，孵育24～48 h。THP-1 細(xì)胞在刺激48 h 后，由懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)化為粘附狀態(tài)，貼附于細(xì)胞培養(yǎng)皿底部，貼壁細(xì)胞即為轉(zhuǎn)化完成的巨噬細(xì)胞。洗去未貼壁的細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細(xì)胞。

3.oxLDL 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化及泡沫細(xì)胞凋亡、炎癥因子釋放檢測：分別用0、25、50 μg/mL 的oxLDL 刺激巨噬細(xì)胞，采用TUNEL 檢測、細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白質(zhì)印跡法檢測不同濃度oxLDL 刺激下的泡沫細(xì)胞形成比例和凋亡比例；不同濃度oxLDL 刺激巨噬細(xì)胞24 h 后，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測泡沫細(xì)胞上清液中的炎癥因子（IL-6、IL-8、MCP-1、MMP-9）水平。

4.miR-16 對(duì)于靶點(diǎn)分子表達(dá)影響的檢測：采用lipofectamine 2000 將外源合成的miR-16 轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞中，用50 μg/mL 的oxLDL 刺激巨噬細(xì)胞，使用TUNEL 檢測試劑盒檢測細(xì)胞的凋亡情況。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測相關(guān)炎癥因子（IL-6、IL-8、MCP-1 和MMP-9）的分泌。

5.oxLDL 對(duì)于miR-16 表達(dá)影響的檢測：用0、25、50 μg/mL 的oxLDL 刺激巨噬細(xì)胞，裂解并收集細(xì)胞中總miRNAs，使用miRNAs array 檢測miR-16的表達(dá)情況。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 21.0（IBM,美國）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，首先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布且方差齊，組間采用非配對(duì)t 檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、粥樣斑塊中miR-16 表達(dá)上調(diào)

對(duì)冠心病患者的纖維斑塊和粥樣斑塊進(jìn)行miRNA 表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)在768 種miRNAs 中有29 種在2 種斑塊間表達(dá)存在顯著差異，其中miR-16、miR-590-3P、miR-1290、miR-223 和miR-140-3p在粥樣斑塊中的表達(dá)顯著升高，而miR-1208、miR-296、miR-193a-5p、miR-485-3p 和miR-144 表達(dá)顯著下降（見圖2），提示差異表達(dá)的miRNAs 可能參與了粥樣斑塊發(fā)生、發(fā)展的病理生理過程。

對(duì)在2 種斑塊間有差異表達(dá)的miRNA 進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，miR-16 的FDR 值為>0.000 1，在所有差異表達(dá)的miRNA 中排首位。結(jié)合表達(dá)差異倍數(shù)以及FDR 值差異，后續(xù)選擇miR-16 作為本研究的研究目標(biāo)。與冠狀動(dòng)脈纖維斑塊相比，冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊組中的miR-16 表達(dá)升高1.75 倍。

二、oxLDL 刺激巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化并促進(jìn)泡沫細(xì)胞表達(dá)miR-16

本研究表現(xiàn)隨著oxLDL 水平的升高，巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化增多，泡沫細(xì)胞凋亡比例上升，炎癥因子IL-6、IL-8、MCP-1 和MMP-9 的釋放增加，提示oxLDL 可促發(fā)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)增加了炎性因子的釋放（見圖3）。同時(shí)，隨著oxLDL 水平升高，miR-16 的相對(duì)水平也增高，提示oxLDL 可促進(jìn)泡沫細(xì)胞表達(dá)miR-16（見圖4）。

三、轉(zhuǎn)染miR-16 后促進(jìn)泡沫細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)TUNEL 檢測和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-16 后，泡沫細(xì)胞的凋亡比例上升，炎癥因子IL-6、IL-8、MCP-1 和MMP-9的表達(dá)升高（見圖5、6），提示miR-16 可進(jìn)一步加劇泡沫細(xì)胞的凋亡以及炎癥因子的分泌。

圖2 人冠狀動(dòng)脈纖維斑塊和粥樣斑塊差異表達(dá)的miRNA

圖3 0、25、50 μg/mL oxLDL 誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞凋亡及炎癥因子釋放

圖4 oxLDL 刺激對(duì)泡沫細(xì)胞miR-16 表達(dá)的影響

圖5 miR-16 對(duì)泡沫細(xì)胞凋亡的作用

圖6 miR-16 對(duì)炎癥因子分泌的作用

討 論

在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中，LDL 透過內(nèi)皮細(xì)胞后，在氧化和磷脂酶等作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閛xLDL，oxLDL 進(jìn)一步與巨噬細(xì)胞清道夫受體SR-A、CD36 等結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成[13]；隨著oxLDL 積聚，泡沫細(xì)胞崩解形成壞死核心，釋放IL-1β、IL-6 等炎癥因子，使炎癥細(xì)胞被招募，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致粥樣斑塊形成[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與纖維斑塊相比，粥樣斑塊中miR-16 的表達(dá)升高。進(jìn)一步行體外細(xì)胞研究，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測證實(shí)，oxLDL 在誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也誘導(dǎo)miR-16 表達(dá)上調(diào)，且在轉(zhuǎn)染miR-16 后，oxLDL 誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞凋亡和組織炎癥反應(yīng)也明顯增加，提示miR-16 促進(jìn)了冠狀動(dòng)脈纖維斑塊向粥樣斑塊進(jìn)展。

本研究中共有5 種miRNA 分子（miR-16、miR-590-3P、miR-1290、miR-223 和miR-140-3P）在粥樣斑塊中的表達(dá)顯著升高。其中，miR-590-3P 和miR-223 已被報(bào)道可促進(jìn)斑塊中血管形成，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[15-16]。目前，對(duì)于miR-1290 和miR-140-3P 的研究主要關(guān)注其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響[17-18]，而miR-16 對(duì)于動(dòng)脈斑塊局部炎癥反應(yīng)和冠心病的影響目前仍存在爭議。miR-16 的上調(diào)可以促進(jìn)NF-κB 調(diào)節(jié)的IL-8 促炎因子的表達(dá)[19]。另一方面，miR-16 也可結(jié)合基因的3′UTR 區(qū)域，促進(jìn)炎癥因子IL-6、TNF-α 等的mRNA 降解，從而抑制炎癥因子的表達(dá)[20]。炎癥反應(yīng)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的機(jī)制之一，而目前關(guān)于miR-16 對(duì)冠心病的影響尚不明確[21]。一些研究發(fā)現(xiàn)，與非冠心病患者相比，冠心病患者的循環(huán)miR-16 表達(dá)水平下降，但也有部分研究結(jié)果與之相反[12,22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-16 可使局部促炎因子（如IL-6、IL-8）的表達(dá)升高，增強(qiáng)泡沫細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)冠脈硬化斑塊的進(jìn)展，同時(shí)推測這一過程可能涉及以下2 個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路。①NF-κB-TNFα-MAPK/JNK 通路：oxLDL 促進(jìn)了NF-κB 的磷酸化，NF-κB的磷酸化可使miR-16 表達(dá)增高，進(jìn)而導(dǎo)致TNF-α分泌增加，促進(jìn)泡沫細(xì)胞凋亡[23]；而TNF-α 的增高又可激活MAPK/JNK，從而促進(jìn)相關(guān)炎癥因子釋放[24]。②TNFα-NF-κB-Bcl-2/ERK 通路：TNF-α 增加可反向激活NF-κB，使miR-16 表達(dá)升高，miR-16靶向性結(jié)合mRNA 的3′-UTR，抑制Bcl-2 和MEK1基因表達(dá)，直接作用于Bcl-2 和MAPK/ERK 通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡反應(yīng)，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展和惡化[24-26]。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中，oxLDL 誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞的生成和凋亡時(shí)，同時(shí)促進(jìn)miR-16 表達(dá)上調(diào)；而上調(diào)的miR-16 表達(dá)又進(jìn)一步誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞的凋亡和局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。本研究結(jié)果可能為今后治療冠心病和預(yù)防急性心肌梗死提供潛在的治療靶點(diǎn)，抑制斑塊部位miR-16 的表達(dá)可能可以延緩冠狀動(dòng)脈斑塊進(jìn)展。