響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取-原子吸收光譜法測定海魚中的鉻

鄧政義

（錦州市疾病預(yù)防控制中心理化檢驗(yàn)科， 遼寧 錦州121000）

海魚種類豐富、 味道鮮美、 營養(yǎng)價(jià)值高， 深受人們喜愛， 是百姓餐桌上常見的菜肴。 但近年來海洋污染日益嚴(yán)重， 特別是重金屬超標(biāo)現(xiàn)象普遍存在［1］， 而處于海洋生物食物鏈頂端的海魚最容易富集重金屬， 并通過食物鏈進(jìn)入人體［2］。 鉻（Cr） 是人體內(nèi)必需的微量元素， 但如果長期攝入量超過一定值， 也會對人體造成危害［3］。 有研究顯示， 遼西地區(qū)食用魚中Cr 等元素的每周可耐受攝入量（PTWI） 約為10%， 經(jīng)常食用仍存在潛在危害［4］。 因此對海魚樣品中重金屬含量的測定是十分必要的。 食品中重金屬消解的常用方法主要有濕式消解法［5］、 干法灰化法［6］和微波消解法［7］等， 但這些方法存在著消解時(shí)間長、 精密度低、需要高溫高壓條件等問題。 超聲提取法通過超聲波在樣品內(nèi)部的“空穴” 作用， 產(chǎn)生強(qiáng)烈的機(jī)械破碎、 攪拌、 振動、 空化等作用［8］， 加速樣品的溶出， 縮短預(yù)處理時(shí)間， 提高樣品提取率， 有利于大批量樣品的快速處理［9-10］。 因此， 本研究建立一種簡便快速， 且適用于魚類樣品中Cr 測定的方法—超聲提取-原子吸收光譜法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器 市售海魚（帶魚、 黃花魚）；硝酸（HNO3）、 高氯酸（HClO4）、 30%過氧化氫（H2O2）； 1 000 μg／ml Cr 標(biāo)準(zhǔn)溶液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心）； GBW08573 黃魚（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）。

WYS2200 型原子吸收分光光度計(jì)（安徽皖儀科技股份有限公司）， KQ-100DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）， 電熱板（常州國宇儀器制造有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲提取法 準(zhǔn)確稱取一定量的海魚樣品于離心管中， 加入7 ml HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V）， 70 ℃下超聲提取20 min， 4 000 r／min 離心5 min， 取上清液于電熱板蒸發(fā)至約1 ml； 殘?jiān)?jīng)超純水清洗后再超聲提取2 min， 4 000 r／min 離心5 min， 取上清液合并于上述酸提取液中， 去離子水定容于10 ml 比色管中， 同時(shí)作空白試驗(yàn)。

1.2.2 濕式消解法 準(zhǔn)確稱取一定量海魚樣品于高腳燒杯中， 并放入數(shù)粒玻璃珠， 加10 ml HNO3-HClO4（9 ∶1， V／V） 加蓋浸泡8 h 并于電熱板上加熱， 直至冒白煙并且消化液呈透明， 將過量的混酸蒸發(fā)近干。 冷卻， 用滴管將消化液移入10 ml 容量瓶中， 去離子水定容， 混勻備用， 同時(shí)作空白試驗(yàn)［11］。

1.2.3 石墨爐原子吸收光譜法（GFAAS） 測定Cr的含量 測定條件： 波長258.2 nm， 狹縫0.4 nm，燈電流10 mA， 干燥溫度110 ℃， 干燥時(shí)間15／15 s； 灰化溫度1 000 ℃， 灰化時(shí)間5／10 s； 原子化溫度2 600 ℃， 原子化時(shí)間2／3 s； 高溫清洗溫度2 650 ℃， 清洗時(shí)間3／3 s。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn) 分別考察超聲時(shí)間、 超聲溫度、 樣品量和溶劑體積4 個(gè)影響海魚中Cr 提取濃度的影響， 以獲得單因素試驗(yàn)最佳值。 每次固定其中3 個(gè)因素， 變化另1 個(gè)因素。 因素變化范圍為超聲時(shí)間5 ～35 min， 超聲提取溫度30 ～80 ℃，樣品量0.05～0.30 g， 溶劑體積1～9 ml。

1.3.2 中心組合設(shè)計(jì)（CCD） 實(shí)驗(yàn) 采用CCD 對單因素試驗(yàn)選出的最佳條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 利用Design-Expert.V8.0.6 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲時(shí)間的選擇 準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品（GBW08573 黃魚） 加入HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V）， 放入超聲浴中， 室溫下超聲5、 10、 15、 20、25、 30、 35 min， 以考察超聲時(shí)間對Cr 提取濃度的影響， 結(jié)果見圖1。 Cr 的提取濃度隨著超聲時(shí)間的增加而增大。 當(dāng)超聲時(shí)間20 min 時(shí)， Cr 的提取濃度均接近最大值， 再增加超聲時(shí)間對Cr 提取濃度影響不大。 因此， 本實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取20 min。

2.1.2 超聲溫度的選擇 選擇超聲時(shí)間為20 min， 準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品加入HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V）， 分別在30、 40、 50、 60、 70、 80 ℃溫度下超聲提取， 考察超聲溫度對Cr 提取濃度的影響， 結(jié)果見圖2。 Cr 的提取濃度均隨著超聲溫度的升高而增大， 當(dāng)超聲溫度為70 ℃時(shí)， Cr 的提取濃度達(dá)到最大值。 因此， 本實(shí)驗(yàn)選擇超聲溫度70 ℃。

2.1.3 樣品量的選擇 選擇超聲時(shí)間為20 min、超聲溫度為70 ℃下， 分別準(zhǔn)確稱取0.05、 0.10、0.15、 0.20、 0.25、 0.30 g 的標(biāo)準(zhǔn)品加入HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V）， 考察樣品量對Cr 提取濃度的影響， 結(jié)果見圖3。 Cr 的提取濃度均隨著樣品量的增加而減小， 說明單位體積的溶劑對重金屬的提取量是有限的。 當(dāng)樣品量多于0.15 g 時(shí)， Cr的提取濃度明顯減少。 因此， 本實(shí)驗(yàn)選擇樣品量0.10 g。

2.1.4 溶劑體積的選擇 選擇超聲時(shí)間20 min、超聲溫度為70 ℃下， 準(zhǔn)確稱取0.10 g 標(biāo)準(zhǔn)品分別加入1、 3、 5、 7、 9 ml 的HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V）， 考察溶劑體積對Cr 提取濃度的影響， 結(jié)果見圖4。 Cr 的提取濃度均隨著溶劑體積的增大而增大， 但溶劑用量大會增加成本。 綜合考慮重金屬提取濃度和測定成本， 本實(shí)驗(yàn)選擇溶劑體積為7 ml。

2.2 CCD 實(shí)驗(yàn)及分析

2.2.1 回歸模型的建立 根據(jù)CCD 原理設(shè)計(jì)4 因素3 水平共30 組實(shí)驗(yàn)， 因素和水平見表1， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2， 方差分析結(jié)果見表3。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸擬合得到回歸方程為： Cr 提取濃度＝＋0.38 ＋0.063A＋0.044B-0.031C＋0.00375D-0.006875AB-0.006875AC-0.005625AD-0.012BC-0.003125BD＋0.019CD-0.032A2-0.016B2-0.043C2-0.024D2（A 為超聲時(shí)間， B 為超聲溫度， C 為樣品量， D為溶劑體積）。 回歸模型的一次項(xiàng)A、 B 為極顯著（P＜0.01）， C 為顯著； 交互項(xiàng)CD 為顯著； 二次項(xiàng)A2和C2為極顯著， B2和D2為顯著。 并且二次回歸模型P＜0.01， 說明回歸方程關(guān)系為極顯著； 失擬項(xiàng)為0.3483＞0.05 表明失擬不顯著， 此方程擬合較為合理。 回歸模型的R-Squared ＝0.947 4，Adj R-Squared ＝0.898 4， 說明此模型與實(shí)際擬合程度較為相符， 用此模型分析和預(yù)測Cr 的超聲提取工藝合適。 Pred R-Squared ＝0.754 5， 與Adj R-Squared合理一致。 模型的信噪比Adeq Precision＝15.377＞4， 說明此模型具有足夠的信號以響應(yīng) 此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖1 超聲時(shí)間對Cr 提取濃度的影響

圖2 超聲溫度對Cr 提取濃度的影響

圖3 樣品量對Cr 提取濃度的影響

圖4 溶劑體積對Cr 提取濃度的影響

續(xù)表2

表3 CCD 方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析 利用響應(yīng)面分析確定4 個(gè)因素交互作用對Cr 提取濃度的影響。 兩兩因素交互作用的響應(yīng)面圖見圖5 所示。 通過比較可見， C（樣品量） 與D （溶劑體積） 響應(yīng)面坡度最為陡峭， 說明C 和D 兩因素交互作用顯著。 其它因素交互作用影響不顯著。 由軟件預(yù)測的最佳超聲提取條件為： 超聲時(shí)間29.79 min， 超聲溫度80 ℃，樣品量0.07 g， 溶劑體積6.28 ml， Cr 提取濃度理論值為0.45 mg／kg。 考慮實(shí)際操作條件， 適當(dāng)修正超聲提取條件為： 超聲時(shí)間30 min， 超聲溫度80 ℃， 樣品量0.07 g， 溶劑體積6.50 ml， 驗(yàn)證結(jié)果表明， Cr 濃度為0.41 mg／kg。 實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值比較相符， 說明此模型可靠， 超聲輔助提取海魚中Cr 可行。

2.3 2 種消解方法的比較 分別采用超聲提取法和濕式消解法處理標(biāo)準(zhǔn)品， 取6 次平行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 濕式消解法測定結(jié)果為： Cr 濃度0.37 mg／kg，回收率為87.1%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD） 為5.6%。 超聲提取法測定結(jié)果為： Cr 濃度0.39mg／kg， 回收率為96.4%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為4.4%。 2 種方法的測定結(jié)果均與標(biāo)準(zhǔn)品參考值（0.43 mg／kg） 相符。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖

2.4 樣品的測定 取海魚樣品可食用部分， 流水沖洗， 去離子水清洗， 晾干， 搗碎混勻。 在選擇的最佳超聲提取條件下， 分別用超聲提取法和濕式消解法測定樣品中Cr 的含量。 濕式消解法測定結(jié)果為： 帶魚中Cr 為0.21 mg／kg， 黃花魚中Cr 為0.30 mg／kg。 超聲提取法測定結(jié)果為： 帶魚中Cr為0.19 mg／kg， 黃花魚中Cr 為0.23 mg／kg。 根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中污染物限量》 （GB 2762-2017）［12］對水產(chǎn)動物及其制品中Cr 的限量標(biāo)準(zhǔn)為≤2.0 mg／kg， 所檢測的帶魚和黃花魚樣品中， Cr 的含量均未超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本研究建立了超聲波輔助提取-原子吸收光譜法測定海魚樣品中Cr 的方法。 在選定的最佳條件下， 超聲提取法能夠定量提取樣品中的Cr。 與濕式消解法相比， 超聲提取法時(shí)間更短、 消解過程更溫和、 試劑消耗更少、 污染更小。