色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的進步與農(nóng)藥多殘留分析方法的發(fā)展(之二)
——從低分辨質(zhì)譜技術(shù)的選擇性談起

李重九

(中國農(nóng)業(yè)大學，北京 100091)

農(nóng)藥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)不可替代的、重要的生產(chǎn)資料，也是保證現(xiàn)代社會公共安全、生產(chǎn)生活正常運行的必需品。農(nóng)藥不僅用于防治農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的病蟲草害，殺滅蚊、蠅、蚤、鼠等傳染病媒介動物，還用于家庭園藝、草坪、道路等雜草防除，在各類物資儲存及家庭用品的防蛀、防霉、防菌方面也發(fā)揮著不可或缺的重要作用。由于農(nóng)藥的廣泛施用，監(jiān)測農(nóng)產(chǎn)品、食品及生態(tài)環(huán)境中的農(nóng)藥殘留，是保障食品安全、控制生態(tài)環(huán)境風險的重要環(huán)節(jié)[1]。

二次世界大戰(zhàn)后，有機農(nóng)藥快速發(fā)展。雖然我國登記的農(nóng)藥只有600余種，但各國應用或曾經(jīng)應用可能依舊殘留在環(huán)境中的農(nóng)藥合計上千種，種類繁多、理化性質(zhì)各異。與有機氯、有機磷殺蟲劑等傳統(tǒng)農(nóng)藥相比，新型農(nóng)藥的生物活性更高，施用濃度大幅度降低，加之降解半衰期短，它們在農(nóng)產(chǎn)品、食品和生態(tài)環(huán)境中的殘留量很低，有些農(nóng)藥的代謝物具有生物活性，其代謝物含量往往更低。這就要求農(nóng)藥殘留技術(shù)能從復雜的樣品基質(zhì)中，準確無誤地檢出性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)不同的痕量殘留農(nóng)藥及部分有毒代謝物。高通量、高選擇性、高靈敏度是對農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的基本要求，其中高選擇性是檢測技術(shù)的基礎(chǔ)，不僅要求區(qū)分各種目標物(農(nóng)藥)，還需要將目標物與樣品基質(zhì)的干擾成分區(qū)分開。農(nóng)藥殘留分析方法的研究主要是對選擇性的研究，很多文章或分析方法中的靈敏度大多來源于高選擇性。農(nóng)藥殘留分析的各個步驟，包括樣品的前處理、色譜分離能力及其檢測方法、數(shù)據(jù)處理方法等，都影響農(nóng)藥殘留分析方法的選擇性。當前需要檢測的農(nóng)藥種類及數(shù)目逐漸增多，使得樣品提取溶液的溶解范圍越來越寬泛，凈化方法不可太嚴苛，由此造成樣品基質(zhì)中的提取干擾物較多，加重了分析儀器的負擔，對分析儀器及分析方法的選擇性提出了更高的要求。

幾十年來，農(nóng)藥殘留分析工作經(jīng)過了以下幾個階段。

1 以生物化學性質(zhì)、理化性質(zhì)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)分析方法

20世紀50年代，人們開始研究農(nóng)藥殘留的檢測方法。早期根據(jù)某一類農(nóng)藥的化學性質(zhì)，利用顯色反應區(qū)分樣品基質(zhì)干擾物和有機氯農(nóng)藥；或根據(jù)有機氯農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制膽堿酯酶的特性，用光學儀器監(jiān)測抑制酶解反應的結(jié)果，判斷樣品中是否含有這兩類農(nóng)藥[2]。以上方法無法區(qū)分一類農(nóng)藥中的單一品種，色譜技術(shù)的發(fā)展解決了這一問題。根據(jù)農(nóng)藥在色譜固定相及流動相中分配系數(shù)的不同，對樣品目標物和基質(zhì)進行分離，采用選擇性檢測器進一步解決與農(nóng)藥色譜峰重疊的基質(zhì)干擾問題。在此基礎(chǔ)上建立的多類農(nóng)藥殘留檢測體系包括三部分：用氣相色譜-電子俘獲檢測器(GC-ECD)檢測有機氯類和含鹵素的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，用氣相色譜-火焰光度檢測器(GC-FPD)或氮磷檢測器(NPD)檢測有機磷農(nóng)藥，用液相色譜-柱后衍生化-熒光檢測器(LC-FLD)檢測氨基甲酸酯類農(nóng)藥[2-3]。

當待測目標物組分過多時，許多農(nóng)藥的理化性質(zhì)相近，無法用1根色譜柱分離，由此產(chǎn)生了雙柱雙檢測器方法。1臺氣相色譜儀配置雙塔進樣器、2根固定相不同的色譜柱，柱后各連接1個相同類型的檢測器。用雙塔進樣器同時進樣，分別用2根色譜柱分離，1根色譜柱無法分離的組分用另1根色譜柱分離，2根色譜柱的分離結(jié)果互補，可以解決受色譜分離效能所限而無法滿足多組分農(nóng)藥檢測的問題。如此，農(nóng)藥多殘留分析至少需要2臺雙柱氣相色譜儀(分別配置ECD、FPD或 NPD)和1臺具有柱后衍生化功能的高效液相色譜儀。1個樣品要在3臺儀器上進樣5次，綜合處理5次進樣的分析數(shù)據(jù)才能得到測試結(jié)果。無論是儀器配置，還是分析工作，這都是沉重的負擔[4]。

該體系同樣存在選擇性不足的問題。食品中存在的大量含氧化合物會干擾ECD對鹵族元素的檢測；磷和硫元素的發(fā)射光譜部分重疊，富含硫的食品(如韭菜、圓蔥等)會干擾FPD對有機磷農(nóng)藥的檢測，用NPD檢測有機磷農(nóng)藥時會受到樣品中含氮組分的干擾。圓蔥、大蒜、韭菜等富含有機硫化物的樣品一直被認為是問題蔬菜。更重要的是，這一方法依據(jù)色譜保留時間定性，并不提供農(nóng)藥分子結(jié)構(gòu)信息。在同一色譜條件下，分配系數(shù)相同的化合物保留時間相同，所以在“農(nóng)藥殘留分析質(zhì)量控制程序”中指出，即使GC或LC使用2根“不同極性的色譜柱分離樣品，用專化性強的選擇性檢測器檢測，其分析結(jié)果對目標化合物的確認能力是有限的，這一點應在分析報告中注明”[5]。Cook等[6]根據(jù)農(nóng)藥中多含有雜原子，曾嘗試用一種具有選擇性的廣譜檢測器——原子發(fā)射檢測器(AED)進行多殘留分析，建立了多種農(nóng)藥的數(shù)據(jù)庫，包括色譜保留時間、每種農(nóng)藥所含元素及質(zhì)譜圖。用GC-AED分析農(nóng)藥殘留量為1～5 mg/kg的果蔬樣品中各色譜峰所含的元素(硫、氮、磷和氯)，通過數(shù)據(jù)庫檢索篩查農(nóng)藥，并與GC-MS(全掃描)比較。由于AED的選擇性和靈敏度不能滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，該技術(shù)并不能在農(nóng)藥殘留分析中發(fā)揮重要作用。另外，這一色譜系統(tǒng)分析方法的檢測對象主要針對殺蟲劑，不包括大量的除草劑、殺菌劑以及各種農(nóng)藥的有毒理學意義的代謝物。

2 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀用于農(nóng)藥殘留分析的基礎(chǔ)研究

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)結(jié)合了色譜的分離和質(zhì)譜的分子結(jié)構(gòu)鑒定能力，一問世便受到農(nóng)藥殘留分析工作者的關(guān)注。在1963年的國際農(nóng)藥會議上就有專家預言：在整個農(nóng)藥殘留領(lǐng)域的研究中,展望未來，質(zhì)譜儀與氣相色譜儀(原文為氣液色譜儀)聯(lián)用將得到發(fā)展，這種裝置的高昂價格不會阻礙人們對這種吸引人的技術(shù)的鉆研[7]。1976年，當美國環(huán)保局(U.S.EPA)針對各個工業(yè)類型的污染源和排放的有毒污染物及其處理技術(shù)和排放限量做出規(guī)定時，要求分析化學家們從65類上千種污染物中確定優(yōu)先檢測的污染物，其中包括各種有機氯農(nóng)藥。大量的分析工作包括有機樣品的采集、保存、制訂復雜廢水的標準分析方法。面對這一極其困難的任務，經(jīng)過討論，環(huán)保局的化學家們發(fā)現(xiàn)，GC-MS是當時唯一可利用的技術(shù)，能在μg/L級水平上完成對污染物的鑒定和半定量。由此，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于環(huán)境污染物和農(nóng)藥殘留分析的方法學研究逐步發(fā)展起來[8]。

2.1 樣品前處理方法的改進——針對分子類型排除干擾物

傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留色譜分析方法的樣品前處理過程主要根據(jù)農(nóng)藥和樣品基質(zhì)的理化性質(zhì)不同將二者分離。選擇對農(nóng)藥溶解度大的有機溶劑提取樣品后，經(jīng)填充柱或固相萃取柱凈化，其填料一般為活性炭、硅鎂吸附劑、酸性氧化鋁和硅膠。根據(jù)實驗室以往的經(jīng)驗，充分利用吸附劑對農(nóng)藥和樣品基質(zhì)吸附能力的不同將二者分離。大量時間消耗于前處理方法的研究，如需要反復嘗試提取溶劑的種類、探索不同吸附劑的配比和用量，以及各種農(nóng)藥在不同吸附劑上的流出體積等。當被測農(nóng)藥種類較多時，這種方法的效果不佳[9]。

借助于前人建立的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，分析者對樣品基質(zhì)干擾物進行研究，發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥樣品的基質(zhì)干擾物主要有酚類和有機酸、弱極性或非極性的植物次生代謝產(chǎn)物(如甾類、色素)，以及大分子的葉綠素、脂肪和蠟質(zhì)等[10]。針對這些干擾物，將提取溶劑由經(jīng)典方法中的乙酸乙酯或丙酮改為乙腈，可以最大限度地排除非極性干擾物(如脂肪、蠟質(zhì))；將凈化柱的填料改為堿性有機胺類吸附劑(如PSA)、烷基鍵合硅膠(C18)和呈平面結(jié)構(gòu)的石墨化炭黑，分別吸附酸性物質(zhì)、弱極性干擾物和葉綠素(分子結(jié)構(gòu)是平面的鐵卟啉環(huán))等[11-13]。這種根據(jù)農(nóng)藥及干擾物分子類型設(shè)計的提取/凈化方案的針對性強、凈化效果好，經(jīng)過不斷完善而廣泛用于各種農(nóng)作物及有關(guān)食品的樣品處理。特別是2003年，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了一種新型的樣品快速前處理方法——QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)，將樣品用乙腈提取，加入氯化鈉使有機相與水相分層除去極性干擾物，在有機相中加入PSA、C18和石墨化炭黑等吸附基質(zhì)中的干擾物，簡單離心后，上清液即可用于儀器分析[14]。QuEChERS方法使用方便，被各國用于農(nóng)藥殘留分析。根據(jù)應用中存在的問題，2018年歐洲標準化委員會針對不同植物源食品(或食材)的特點，對QuEChERS方法做了詳盡的修改，使其更加完善[15]。

2.2 農(nóng)藥質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及數(shù)據(jù)處理方法的研究

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀與色譜儀最大的區(qū)別是其檢測結(jié)果(質(zhì)譜圖)可以提供分子結(jié)構(gòu)信息。自20世紀40年代有機質(zhì)譜儀面世以來，大量的質(zhì)譜圖編纂為數(shù)據(jù)集。當時受手工處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)能力的限制，每張圖譜僅收集8個強峰。計算機技術(shù)的發(fā)展使質(zhì)譜儀采集的完整圖譜數(shù)據(jù)可以全部數(shù)字化，并建立了方便檢索的譜庫，使農(nóng)藥殘留定性分析的依據(jù)從僅依靠農(nóng)藥的理化性質(zhì)(色譜保留時間)擴展到包括表示分子結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。更重要的是，計算機可對采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)重建色譜圖和質(zhì)量色譜圖，根據(jù)質(zhì)量色譜圖的保留時間和形狀判斷各個離子是否屬于同一組分。這為如何從樣品基質(zhì)干擾中識別出目標物分子結(jié)構(gòu)信息，或分辨部分重疊的農(nóng)藥色譜峰，解決農(nóng)藥殘留檢測的關(guān)鍵問題提供了技術(shù)支撐。

早期，一般用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀全掃描方法進行農(nóng)藥殘留分析，即使樣品經(jīng)過復雜的凈化處理和色譜分離，也很難避免相鄰組分之間重疊以及樣品基質(zhì)的干擾。在痕量分析中，最困難的是排除干擾得到純凈正確的質(zhì)譜圖。1974年，Biller等[16]最早提出了以點為比較參數(shù)的算法處理重疊的化合物質(zhì)譜圖，通過提取每個離子質(zhì)量色譜峰最高點相對應的掃描數(shù)，合并具有相同最高點掃描數(shù)的離子及其相對應的強度, 建立此掃描點處的“提取”質(zhì)譜圖。Colby等[17]曾對Biler的算法進行改進，除每個離子色譜峰的最大峰值外，又將最大峰值的左右2點也納入到比較范圍中，使結(jié)果更精確。這種以點為參數(shù)的算法簡單，對計算機的配置要求低，但用于計算的確證數(shù)據(jù)過少，結(jié)果易受外界因素的干擾，無法滿足痕量分析的要求。Dromey等[18]提出以峰型為比較參數(shù)，對GC-MS數(shù)據(jù)文件中每個離子的質(zhì)量色譜圖進行分析，對不同的峰選取1～2個模型離子(model ions)，比較其他離子與模型離子峰在保留時間和峰型上的相似度，決定該離子是否歸屬于此峰。整個文件掃描后，將所有具有相同保留值和峰形的離子組合成一張新的質(zhì)譜圖，從而完成質(zhì)譜圖的提取。在此基礎(chǔ)上建立了自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)(automated mass spectral deconvolution and iIdentification system, AMDIS)。當2個化合物的保留時間相差不小于2次掃描，濃度相差不大于5倍(濃度水平為mg/L)時，2個化合物的主要離子質(zhì)量不相同，而且質(zhì)量色譜圖信號平滑，AMDIS可以區(qū)分這些部分重疊的化合物，并在一定程度上有效地去除柱流失物和基質(zhì)共流出物的干擾離子，得到可供鑒定的“較純凈的”質(zhì)譜圖。但是，如果相鄰的目標物相差濃度過大，AMDIS只能提取出高濃度組分的離子。同樣，干擾物與待測目標物的濃度相差過大時，痕量目標物也難以辨認[19]。Dagan等[20]采用AMDIS分析了土壤中6種殘留農(nóng)藥，并與GC-PFPD、GC-MS/MS方法進行比較，由于圖譜數(shù)據(jù)相對完整，AMDIS確證殘留農(nóng)藥的能力強于另外2種方法，但靈敏度不如后者。Norli等[21]在蘋果、橙子和生菜中分別添加了177種農(nóng)藥,未凈化的樣品提取液經(jīng)GC-MS全掃描分析、AMDIS處理，得到的質(zhì)譜圖與NIST譜庫中標準圖譜比對，根據(jù)相似度(FIT)、逆相似度(RFIT)計算AMDIS匹配度(AMF)。結(jié)果表明，添加濃度水平分別為0.02、0.1 mg/kg的177種農(nóng)藥中，平均AMF值≥70(%)的比例分別為23%和80%。如果降低匹配度，農(nóng)藥檢出率會增加，但在實際樣品檢測中，假陽性樣品也會增加。在為期3個月的實際檢測工作中，發(fā)現(xiàn)AMF≥70的樣品未出現(xiàn)假陽性。但如以AMF大于20為陽性標準，假陽性率為4%。張偉國等[19]采用GC-MS全掃描方式分析含水量多的蔬菜，當樣品經(jīng)過凈化處理后，AMDIS鑒定率會提高，然而對于含水量少、基質(zhì)復雜的糙米，其基質(zhì)的干擾物含量遠遠高于目標待測物。雖然以上方法的選擇性效果并不理想，但實驗證明，通過AMDIS的輔助分析可以有效提升全掃描分析的選擇性，使檢測能力提高1個數(shù)量級。

為了提高退卷積技術(shù)處理重疊峰和干擾背景的能力，哥本哈根大學[22]根據(jù)平行因子分析原理開發(fā)了PARAFAC2計算方法，它可以合并從同一樣品獲取的多個色譜圖信息提取每個成分的質(zhì)譜圖：將總離子流色譜圖分為若干小區(qū)間，每個區(qū)間含少量目標物；對于每個間隔都建立1個單獨的PARAFAC2模型，在給定的保留時間區(qū)域內(nèi)同時對所有被分析樣品的組分、低信噪比(S/N)色譜峰進行解卷積。該方法需要5個平行分析樣本，這在實際工作中很難實現(xiàn)。Dabrowski等[23]提出了一種基于來自1個色譜圖有限數(shù)據(jù)集的簡化分析GC/MS數(shù)據(jù)的方法——Paradise，即對1次分析的總離子流色譜圖通過數(shù)學修改(改變峰值保留時間，將信號乘以模擬樣本的“獨立變化”)生成幾張“平行分析”結(jié)果，用以滿足PARAFAC2軟件的要求。作者用該方法分析了土壤和水果(桔子)中的多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯和有機農(nóng)藥。目前，雖然Paradise尚未廣泛應用，但是可以被視為AMDIS的補充軟件。

由于全掃描方式的靈敏度達不到農(nóng)藥殘留檢測的要求，目前以上數(shù)據(jù)處理方面的應用還不夠普遍。但是，質(zhì)譜全掃描譜是提供痕量農(nóng)藥完整分子結(jié)構(gòu)信息的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。隨著人們對食品安全、環(huán)境保護意識的增強，期待更好的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析技術(shù)面世。

3 選擇離子掃描及農(nóng)藥多類多殘留檢測方法的探討

質(zhì)譜全掃描技術(shù)相當于通用檢測器，痕量的殘留農(nóng)藥信息被掩蓋于樣品基質(zhì)的汪洋大海中。20世紀60年代開始，通過控制掃描參數(shù)使掃描型質(zhì)譜儀(磁質(zhì)譜、四極桿質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜)具備了選擇性掃描特定離子的功能。針對農(nóng)藥殘留的分析，人們不斷將GC-MS的全掃描技術(shù)、選擇離子技術(shù)與氣相色譜選擇性檢測器相比，發(fā)現(xiàn)選擇離子檢測(SIM)的靈敏度接近選擇性檢測器，而鑒定結(jié)果的可靠性要優(yōu)于選擇性檢測器，于是“寄希望于可根據(jù)保留時間編程的氣相色譜-質(zhì)譜選擇離子技術(shù)”[24]。20世紀90年代以來，伴隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，同時對多類農(nóng)藥進行多殘留分析，從設(shè)想變成了現(xiàn)實。

20世紀80年代初，限于質(zhì)譜掃描速度及儀器的自動控制水平，1次分析過程中能選擇的離子數(shù)目僅有20～30個，每個離子的駐留時間為100～200 ms，而且中途不能更換離子，該技術(shù)被稱為單離子檢測(SID)或多離子檢測(MID)[25]。這一時期檢測的農(nóng)藥品種很少，1次實驗所涉及的農(nóng)藥不超過20種。當時主要考慮所選用農(nóng)藥的特征離子不存在于樣品基質(zhì)中，以避免樣品基質(zhì)的干擾。為了用少量離子檢測更多的農(nóng)藥品種，盡量選擇一些農(nóng)藥的共有離子，如硫代有機磷酸酯類農(nóng)藥都含有m/z125[C2H6O2PS]+或m/z153[(C2H5O)2PS]+離子,可用這些離子檢測多種甲基或乙基取代的硫代磷酸酯類農(nóng)藥，如對硫磷、溴硫磷、樂果、馬拉硫磷等農(nóng)藥，前提是它們的色譜峰不重疊[26]。

20世紀90年代后，各公司的質(zhì)譜儀掃描速度普遍達到1 000 u/s以上，1次色譜分析能夠選擇的離子數(shù)目大大增加,研究人員開始嘗試應用GC-MS取代氣相色譜-雙柱雙檢測器法進行單類或多類農(nóng)藥的多殘留檢測。對于四極質(zhì)譜儀，被稱為選擇離子檢測技術(shù)(SIM)；對于離子阱質(zhì)譜儀，則被稱為離子存儲技術(shù)(SIS)。由于檢測的農(nóng)藥品種增多，許多農(nóng)藥的保留時間相近，選擇特征離子不僅要考慮避免基質(zhì)干擾，而且要考慮重疊組分之間的干擾。

隨著質(zhì)譜儀掃描速度的繼續(xù)提高及儀器自控技術(shù)的進步，可以按照待測組分的色譜流出時間用計算機編程，針對每個待測物和干擾物“精準”選擇特征離子進行掃描，由此促進了色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀在農(nóng)藥多殘留分析中的應用。

1995年，Julie等[27]報道了GC-MS(SIM)檢測199種不同類型農(nóng)藥的方法，沿襲了色譜檢測技術(shù)的樣品前處理方法，根據(jù)各種農(nóng)藥的色譜保留時間，設(shè)置了55個時間段，色譜峰相互重疊或保留時間相近的組分歸為同一時間段，檢測此時間段內(nèi)的農(nóng)藥特征離子。根據(jù)各時間段待測離子的多寡影響，其駐留時間為20～200 ms不等。每種農(nóng)藥用2～3個特征離子檢測，其中豐度最高的離子為目標離子(target ion)，其余離子為(輔助)定性離子。用色譜保留時間、特征離子質(zhì)量數(shù)、以及1個定性離子與目標離子的相對豐度比進行定性，以目標離子的質(zhì)量色譜峰面積進行定量。使用該方法，1992年可檢測125種農(nóng)藥，1994年擴大到199種農(nóng)藥，為了避免過多的色譜峰重疊，將被測組分分為2次進樣，實際測定了數(shù)千個蔬菜水果樣品的農(nóng)藥殘留。由于被測組分多、時間程序切換頻繁，要求載氣流量和壓力必須穩(wěn)定，否則被測組分會因保留時間波動溢出特定的檢測時間段。為了避免此類現(xiàn)象發(fā)生，該方法在每個時間段不僅包括本段內(nèi)的檢測對象，還包括前后2個時間段的組分，如在31.19～31.81 min內(nèi)僅包括4種農(nóng)藥，應該只檢測8個特征離子，而該時間段卻包括了前后相鄰時間段的各2種農(nóng)藥，增加了8個特征離子，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集的有效率只有50%。大部分組分的保留時間集中在25～40 min，平均采集有效率為45%，最低只有15%。這樣雖然避免了丟失檢測目標，卻降低了儀器的采集效率。90年代后期，大部分氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的電子流量壓力控制性能得到改進，而后有些儀器增加了保留時間鎖定功能，此問題才得以解決。

2000年，Juile等[28]對此方法進行了改進，采用針對分子類型的提取凈化法添加了新內(nèi)標，規(guī)定所有定性離子與目標離子的相對豐度比作為定性鑒定的依據(jù)。將檢測范圍擴大至251種農(nóng)藥，其中239種農(nóng)藥及其代謝物用氣相色譜-質(zhì)量檢測器(GC-MSD)檢測，另外12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥用液相色譜-熒光檢測器檢測，實現(xiàn)了用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀代替2臺氣相色譜(各自為雙柱雙檢測器)檢測水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留。2009年，龐國芳等[29]改進了樣品前處理方法，優(yōu)化了儀器技術(shù)參數(shù)，其中最短的駐留時間縮減至10 ms，建立的GC-MS(SIM)方法可分析383種農(nóng)藥。

特征離子是SIM檢測的依據(jù)，特征離子數(shù)目越多，包含農(nóng)藥的分子結(jié)構(gòu)信息越全面。但是,離子數(shù)目過多，會增加掃描所需的時間，從而減少色譜峰的數(shù)據(jù)采樣點；離子數(shù)目過少，會降低定性分析的可靠性。歐盟農(nóng)藥殘留監(jiān)測指南(1999/333/EC)提出的最低要求是：選擇2個m/z>200的離子，或選擇3個m/z>100的離子[5]。2000年，Zweigenbaum[30]通過分析檢測誤差的概率，提出了色譜保留時間結(jié)合4個特征離子，可使鑒定誤差小于10-4。然而，大多數(shù)有機農(nóng)藥的分子質(zhì)量不大于500 u，很難選擇4個特征離子。于是，根據(jù)實際情況，對于一般農(nóng)藥選擇3個特征離子檢測，對于禁用農(nóng)藥則需要4個離子。目前這一標準在我國已普遍采用。

至此，適用于質(zhì)譜的樣品前處理技術(shù)、儀器檢測方法、質(zhì)量控制方法都已具備，基于質(zhì)譜技術(shù)的農(nóng)藥多類多殘留分析方法初步完備。21世紀以來，GC-MS的性能指標迅速提升。2007年，大部分儀器的掃描速度接近、甚至超過10 000 u/s，掃描速度不再是制約農(nóng)藥殘留檢測的要素,采用上述系統(tǒng)檢測的農(nóng)藥種類越來越多。我國建立了一系列百種以上基于GC-MS(SIM)技術(shù)的農(nóng)藥多類多殘留檢測標準方法，樣品基質(zhì)包括中草藥、糧谷、果蔬、茶葉、飼料、牛奶和奶粉、蜂蜜及果酒等農(nóng)產(chǎn)品和食品，也包括水和土壤等環(huán)境樣品[31-39]。

4 串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展使農(nóng)藥多類多殘留分析進入實際應用領(lǐng)域

隨著檢測目標化合物的增多，SIM技術(shù)選擇性欠佳的問題顯現(xiàn)出來。如GB 23200.8—2016方法[33]所涉及的500種農(nóng)藥, 352種農(nóng)藥(約70.4%)的保留時間集中在17.0～29.9 min，單位時間(min)內(nèi)的農(nóng)藥密度甚至多達31個。為解決待測目標物密集的問題，將500種農(nóng)藥標準品分為5組，分5次進樣,使待測目標物的保留時間分散，并且盡量使相鄰組分選用質(zhì)量數(shù)不相同的特征離子。此方法對標準品的檢測效果較好，但是樣品中待測目標物可能同時存在，會影響檢測結(jié)果。同類農(nóng)藥往往具有相同的母體結(jié)構(gòu)，如三嗪類除草劑莠滅凈和撲草凈，它們的氣相色譜保留時間相差0.02 min，都具有m/z184離子[C6H10N5S]+，豐度分別為16.6%和72%，雖然前者并未用m/z184為特征離子，但在檢測撲草凈時，如果樣品中存在莠滅凈，尤其是其濃度較高時，會增強m/z184離子的豐度，從而影響撲草凈的鑒定。另外，有機農(nóng)藥的分子質(zhì)量一般較小，經(jīng)電子轟擊電離(EI)后，大多數(shù)農(nóng)藥的特征離子為m/z50～300。樣品基質(zhì)的干擾離子一般也位于這一區(qū)域，目標物的信號響應值很低時，容易被淹沒。與全掃描技術(shù)相比，SIM的選擇性增強，可使靈敏度提高1個數(shù)量級，但是仍然不能滿足越來越嚴苛的食品安全和生態(tài)環(huán)境的檢測需求。2000年前后，雖然GC-MS技術(shù)已經(jīng)形成標準方法，但其靈敏度不如氣相色譜選擇性檢測器，無法確認色譜法檢出的痕量陽性樣品。在檢測復雜樣品時，無法排除基質(zhì)共萃物的干擾，如含大量硫醚的韭菜、蔥、蒜等蔬菜，次生代謝產(chǎn)物豐富的茶葉、咖啡和中草藥等，都是難以檢測的樣品。串聯(lián)質(zhì)譜增加了選擇性，無論是被測目標物，還是基質(zhì)共萃物中質(zhì)量數(shù)相同的離子(如上文中m/z184)，只要來源于質(zhì)荷比不同的母離子，或者具有質(zhì)荷比不同的子離子，都可以通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分開。

20世紀80、90年代，三重四極桿質(zhì)譜儀(TSQ)和離子阱質(zhì)譜儀(IT)問世，90年代開始就有使用這2種儀器研究農(nóng)藥殘留檢測方法的報道。IT儀器構(gòu)造較TSQ簡單，實驗室購置成本低，內(nèi)源離子阱可以在1次色譜分析過程中按照目標物的保留時間選擇合適的電離方式(EI或CI)。離子阱串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)曾一度在研究農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域比較活躍。但是，由于離子阱質(zhì)譜儀在1個質(zhì)量分析器中按照時間順序選擇母離子、對母離子進行誘導碰撞解離、繼而分析子離子，1次MS/MS掃描比TSQ需要的時間長。1次色譜進樣TSQ可檢測數(shù)百個組分，而IT只可以分離并檢測上百個組分。隨著TSQ技術(shù)的發(fā)展及儀器普及率的提高，目前多使用TSQ分析農(nóng)藥多殘留。

90年代開始，人們不斷比對色譜法和串聯(lián)質(zhì)譜法，研究結(jié)果表明,串聯(lián)質(zhì)譜法比氣相色譜選擇性檢測器和GC-MS(SIM)具有更高的選擇性，因此其靈敏度有望滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求。早期的檢測方法是選擇1個母離子，其裂解后對子離子進行掃描，在子離子譜中選擇2個或多個離子，用子離子及其相對豐度比進行定性分析，其中豐度高的子離子的質(zhì)量色譜峰面積用于定量分析。Sheridan等[40]指出,色譜保留時間結(jié)合1個母離子及其2個子離子可使鑒定誤差小于10-5，通過檢測蔬菜、水果、牛奶中100種農(nóng)藥及其代謝物，檢出限可達μg/kg(L)水平。

MS/MS方法的選擇性雖然明顯優(yōu)于SIM方法，但是如果目標物和干擾物有相同質(zhì)量數(shù)的母離子，仍會干擾子離子譜，進而干擾檢測結(jié)果。2000年左右開發(fā)的多反應監(jiān)測(MRM)功能，對母離子、子離子都進行了選擇離子掃描，該方法也稱為選擇反應監(jiān)測(SIR)，不僅選擇性更強，而且掃描速度快。需要注意的是，MRM技術(shù)不再出具子離子譜，而是2個子離子的質(zhì)量色譜圖。對目標物進行鑒定時，需要用2個子離子的峰面積(或峰高)之比代替離子強度之比。另外，串聯(lián)質(zhì)譜子離子的豐度受外界條件影響較大，必須以同一批次實驗中相近的標準品作為參照，二者子離子的峰面積(或峰強度)比值在允許誤差范圍內(nèi)時方能避免假陽性結(jié)果。Wong等[41]使用MRM方法研究了菠菜中166種有機氯、有機磷、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其代謝物、異構(gòu)體在菠菜中的農(nóng)藥殘留；Okihashi等[42]檢測了農(nóng)產(chǎn)品中260種農(nóng)藥殘留，列舉了串聯(lián)質(zhì)譜法所用的2對特征離子和CID能量，每個離子的駐留時間僅為10 ms，通道間切換時間為10 ms，檢測1個目標物需40 ms，作者對173份來自當?shù)厥袌龅牧闶鬯?、蔬菜和大米樣品進行了分析。

2010年之前，GC-MS/MS方法已經(jīng)成熟，但并未廣泛應用于實際工作中。除了儀器造價高，主要原因是GC-MS所用的硬電離技術(shù)——電子轟擊電離(EI)使分子離子的絕對豐度小、碎片離子多，許多農(nóng)藥難以獲取質(zhì)量數(shù)大的離子作為母離子。20世紀末，電噴霧電離技術(shù)(ESI)的產(chǎn)生使液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)得以普遍應用，擴大了農(nóng)藥多殘留檢測范圍，使GC-MS無法分析的許多極性農(nóng)藥，如殺菌劑、除草劑、一些極性殺蟲劑、以及農(nóng)藥的極性有毒代謝物都被納入可檢測范圍。與EI相比，ESI的碎片離子少，而分子離子、準分子離子(或加合離子)的絕對豐度高，適合作為母離子進行二級離子分析。從21世紀初以來，不斷有使用LC-MS/MS進行農(nóng)藥殘留分析的報道。由于大多數(shù)農(nóng)藥分子中含有雜原子，可以用ESI電離，一些原來用GC-MS分析的農(nóng)藥也開始用LC-MS分析。Alder等[43]于2006年總結(jié)了500種常用農(nóng)藥中僅有49種在LC-MS上無響應，這49種農(nóng)藥或是不宜用ESI電離(如有機氯類農(nóng)藥)，或是極性弱無法用反相色譜分析(如弱極性的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥)。GC-MS/MS與LC-MS/MS相比,后者覆蓋的農(nóng)藥種類多、靈敏度高。Maestronia等[44]使用化學成分復雜的中草藥大青葉作為試材，比較了GC-MS/MS 和LC-MS/MS檢測84個代表性農(nóng)藥殘留的選擇性和靈敏度，對于大多數(shù)農(nóng)藥，前者的最低定量限為10 μg/kg，后者則為50 μg/kg。

近十幾年，色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)快速發(fā)展。粒徑小于3 μm的液相色譜填料及超高壓輸液泵使液相色譜儀的分離能力大為改善，減輕了重疊組分(包括目標物和干擾物)對檢測結(jié)果的干擾，質(zhì)譜掃描速度進一步提高，離子駐留時間縮短至3～5 ms，單位時間可以檢測(即分辨)更多組分。質(zhì)譜電噴霧技術(shù)的改善，各種聯(lián)用儀離子傳輸效率的提升，質(zhì)量分析系統(tǒng)的改進，以及通過離軸式高壓打拿極，或在質(zhì)量分析器出口增加透鏡系統(tǒng)聚焦等措施提高儀器的信噪比，由此可減少了進入儀器的基質(zhì)含量，減輕了質(zhì)譜檢測器對選擇性的壓力，用更少的試樣即可滿足檢測靈敏度的需求。農(nóng)藥在農(nóng)作物中的最高允許殘留限量(MRL)一般不低于0.01 mg/kg(0.01 ng/mg)，分析方法的選擇性相當于從10 mg樣品中篩查0.1 ng的痕量農(nóng)藥。當儀器的最低檢出限為0.1 mg/L時，樣品一般需要濃縮10倍或以上才能進行檢測，即10 g樣品提取凈化后，濃縮為1 mL，試樣溶液中樣品基質(zhì)含量相當于10 mg/μL。隨著儀器信噪比的提高，樣品濃縮倍數(shù)越來越小，Nguyen等[45]使用QuEChERS法處理圓白菜和胡蘿卜，用GC-MS(SIM)檢測，樣品濃縮了3倍。目前大多數(shù)串聯(lián)檢測方法無需樣品濃縮[46]，有些甚至只需對樣品進行簡單提取即可檢測[47]。

無論是GC-MS還是LC-MS，都不能單獨檢測全部需要檢測的農(nóng)藥，于是產(chǎn)生了二者結(jié)合的多類多殘留檢測方法。Pang等[48]于2009年研究了839種農(nóng)藥和化學污染物在動物源食品(牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和兔肉)中的殘留分析方法，對脂肪含量較高的樣品，提取后經(jīng)凝膠色譜凈化，用GC/MS(SIM)和LC/MS/MS分析。而后，我國結(jié)合GC-MS/MS與LC-MS/MS技術(shù)建立了農(nóng)藥多類多殘留檢測標準方法，用于糧谷、油料作物、糖料作物、香辛料以及新鮮或干制的食用菌、蔬菜、水果等[49-50]。

5 目前的問題及展望

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)改變了農(nóng)藥殘留分析方法，經(jīng)過30多年，該技術(shù)從研究室進入檢測實驗室，色質(zhì)聯(lián)用儀成為農(nóng)藥殘留檢測不可或缺的設(shè)備。但在色譜的同一保留時間，一旦樣品干擾物中出現(xiàn)了與檢測所用的母離子/子離子對質(zhì)量數(shù)相同的離子，就可能產(chǎn)生誤差。如Wong等[41]發(fā)現(xiàn)，由于基質(zhì)干擾，氟啶酮在菠菜中的回收率超過300%；筆者也曾見到香菜中檢出了不可能出現(xiàn)的除草劑。另外，農(nóng)作物生產(chǎn)過程及環(huán)境復雜，農(nóng)藥殘留既可能產(chǎn)生于有意施用農(nóng)藥，也可能來源于環(huán)境影響，因此難以預測殘留農(nóng)藥的種類。近年來提出了非目標物農(nóng)藥殘留檢測的要求，這一切都在引導高分辨質(zhì)譜進入農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域。