醫(yī)藥院校黃芪多糖含藥血清制備的實驗研究＊

（山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺 264199）

一、材料與方法

1.材料

1.1 實驗動物和細(xì)胞

SPF級雌性SD大鼠，24只，體質(zhì)量（180±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；人胃癌細(xì)胞株SGC7901購自上海美軒生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

黃芪多糖粉（APS）（純度≥90%），購自山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院中藥房。完全RPMI-1640培養(yǎng)基（批號：KGM31800S-500）購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；CCK8法細(xì)胞增殖檢測試劑盒（批號：KGA317）購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱（BPN-80CW，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；熒光倒置顯微鏡（MF53，廣州市明美光電有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（02L3006，TECAN）；離心機（TD4A，長沙英泰儀器有限公司）。

2.實驗方法

2.1 黃芪多糖含藥血清的制備

在無菌條件下將黃芪多糖粉末溶解于PBS，制成 4mg/mL液體。取24只正常健康的雌性SD大鼠，隨機分為A、B、C三組。A、B兩組以不同的給藥途徑給藥。A組灌胃給藥，B組腹腔注射、C組灌胃給予等量生理鹽水。黃芪多糖給藥量相當(dāng)于臨床黃芪注射液的等效劑量（成人用藥量250mg/d），根據(jù)藥理學(xué)實驗設(shè)計與統(tǒng)計分析第三版“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值”表計算，大鼠黃芪多糖給藥量應(yīng)為22mg/d，而腹腔注射吸收率為80%左右，故B組大鼠腹腔注射的給藥量為7mL/Kg。A灌胃給藥量28 mL/Kg（灌胃吸收利用率為腹腔注射的35%～40% 左右）[12]三組大鼠均禁食相同時間（8～12小時），保持空腹?fàn)顟B(tài)下，在同一時間進(jìn)行給藥。連續(xù)給藥10天。每次給藥后8h及末次給藥后1h，清醒狀態(tài)下進(jìn)行大鼠股動脈取血，連續(xù)采集10天，無菌分離血清，經(jīng)56℃，35min 滅活補體后，超凈臺中用0.22μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌細(xì)胞SGC7901在10% 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液（含青霉素、鏈霉素各 100 U/mL）中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

2.3 CCK8法檢測含藥血清對SGC7901細(xì)胞生長的影響

實驗設(shè)4組，分別為A組（灌胃給藥組）、B組（腹腔注射組）、C組（空白血清組）以及Control組（陰性對照組），A、B組內(nèi)再各分10個組（以血清采集日期分組），設(shè)3個復(fù)孔。取對數(shù)生長期SGC7901/ADR細(xì)胞以1×104個/孔接種于96 孔板的100μL培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至其貼壁約70%，向完全培養(yǎng)基中按20%的比例分別加入黃芪多糖含藥血清、空白血清等體積空白1640培養(yǎng)液?？装逯糜谂囵B(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每孔加入10μL CCK8檢測溶液，再置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，水平搖床上低速振蕩混勻，在酶標(biāo)儀上于波長450nm 處讀取光密度值（OD值），比較藥物效應(yīng)的發(fā)揮。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，定量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，獨立樣本之間比較采用方差分析，以P＜0.05作為顯著性差異。

二、結(jié)果

由表1可知，A組（灌胃給藥組）當(dāng)給藥到第4天，與Control組及C組相比OD值明顯降低（P＜0.05）。B組（腹腔給藥組）當(dāng)給藥到第3天，與Control組及C組相比OD值明顯降低（P＜0.05）。A組內(nèi)從第6天開始與第4天相比OD值有明顯差異（P＜0.05）。B組內(nèi)第6天開始與第3天相比OD值有明顯差異（P＜0.05）。

表1 不同方法制備的含藥血清對SGC7901細(xì)胞增殖影響比較（OD值，X±s，n=3）

三、討論

獲取中藥含藥血清進(jìn)行體外實驗，可降低中藥中非有效成分對實驗結(jié)果造成的干擾。而含藥血清制備受多種因素影響，如給藥動物選擇、給藥劑量、給藥間隔、采血時機、血清滅活及儲存等條件的不同均會造成含藥血清濃度的差異及效應(yīng)的發(fā)揮。為了制備黃芪多糖含藥血清，我們選擇了兩種不同的給藥途徑，其他因素基本一致（前述給藥量的區(qū)別是為了盡量獲取一致的血藥濃度）以篩選較佳的黃芪多糖含藥血清制備的方案。通過實驗（見表），我們發(fā)現(xiàn)黃芪多糖含藥血清對SGC7901細(xì)胞的生長有一定的抑制作用，A、B兩組OD值比Control組和C組有降低趨勢。A組，當(dāng)給藥到第4天其OD值比Control組和C組明顯降低（P＜0.05），第6天比第4天OD值明顯減低（P＜0.05），第6天到第10天的OD值無顯著差異。B組，當(dāng)給藥到第3天其OD值比Control組和C組明顯降低（P＜0.05），第6天比第3天OD值明顯減低（P＜0.05），第6天到第10天的OD值無顯著差異。本實驗灌胃給藥、腹腔注射給藥，含藥血清藥效明顯發(fā)揮在分別給藥第4天和第3天，由此，說明黃芪多糖含藥血清制備是切實可行的，且腹腔給藥起效較早。A、B兩組均在給藥第6天血藥濃度有所升高基本保持穩(wěn)態(tài)，說明黃芪多糖在連續(xù)給藥6天后達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度。相對于灌胃給藥，腹腔注射給藥含藥血清的OD值有下降趨勢，說明腹腔注射給藥含藥血清濃度較高，可更好保證藥效發(fā)揮?；谝陨蠈嶒灲Y(jié)果，我們選擇腹腔注射給藥的方式制備黃芪多糖含藥血清，以保證較高的血藥濃度，同時該方法也更接近臨床給藥途徑。

在給藥動物選擇上一般選擇與人類生物特性盡量相似的動物進(jìn)行實驗，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔等，本實驗選擇大鼠作為給藥動物。根據(jù)對412種藥物的半衰期、藥物達(dá)峰時間等數(shù)據(jù)的分析，若以人為測試對象，每天給藥2次，連續(xù)給藥3天，末次給藥后1h采血，80%以上的藥物，其血濃度將大于其一次給藥的最高血藥濃度[13]。我們也參考在末次給藥后1h采血制備黃芪多糖含藥血清。

綜上所述，黃芪多糖含藥血清的制備我們制定如下的實驗方案，采用健康大鼠，以臨床黃芪注射液的等效劑量作為基礎(chǔ)給藥量，每天在固定時間腹腔注射給藥，連續(xù)給藥7天（本實驗連續(xù)給藥6天達(dá)穩(wěn)態(tài)，為了確保血藥濃度定連續(xù)給藥7天），在末次給藥后1h清醒狀態(tài)下進(jìn)行大鼠股動脈取血，無菌分離血清，經(jīng)56℃，35min滅活補體后，超凈臺中用0.22μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>