醫(yī)學院校科研中與心肌梗死相關(guān)基因MIAT位點篩選的研究＊

唐賽賽（通訊作者） 李寶燕 周玉明 程 林 王海鳳 許夢婷 胡江波

（1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W校，山東 煙臺 264100；2.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 煙臺 264100）

隨著生活方式的改變，我國心肌梗死（myocardialinfarction，MI）發(fā)病率呈逐年升高，且有年輕化趨勢。目前已證實MI主要危險因素包括：高血壓、血脂異常、糖尿病、吸煙、超重和肥胖、年齡、性別等[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[2]，在一些個體中，常表現(xiàn)出明顯家族史，提示遺傳因素在誘發(fā)MI發(fā)揮重要作用，而基因多態(tài)性是決定這種遺傳性重要因素。因此，對某一疾病人群和正常對照人群進行單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）對比研究，可確定SNP位點與該疾病發(fā)病風險的關(guān)系[3]，因而廣泛應(yīng)用于疾病遺傳易感性研究。長鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt，位于細胞質(zhì)內(nèi)或胞核內(nèi)功能性非編碼RNA分子。但近年來研究發(fā)現(xiàn)真核細胞lncRNA表現(xiàn)出復(fù)雜調(diào)控機制，主要從表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多方面實現(xiàn)調(diào)控，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化等進程[4]，并在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程起重要作用。lncRNA可從炎癥、凋亡、增殖、自噬等多方面影響動脈粥樣硬化病理進程。研究表明，lncRNAs基因多態(tài)性可影響自身空間結(jié)構(gòu)，改變lncRNAs表達及其調(diào)控的信號通路，而影響個體對疾病易感性。這都提示lncRNAs基因多態(tài)性可能與MI遺傳易感密切相關(guān)。研究也發(fā)現(xiàn)，lncRNAMIAT的SNPs與日本人群MI發(fā)病風險密切相關(guān)。有關(guān)MIAT影響MI遺傳易感的潛在分子機制有待深入挖掘。

位于染色體22q12.1的lncRNAMIAT（myocardialinfarctionassocia tedtranscript，MIAT）研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)MIAT可促進內(nèi)皮細胞遷移和增殖，進而導(dǎo)致病理性血管生成[5]。研究發(fā)現(xiàn)ST段抬高性MI病人外周血MIAT表達水平與非ST段抬高性MI病人相比明顯降低，并且MIAT與CPK和TnT水平呈負相關(guān)，這提示MIAT可作為心臟早期損傷輔助診斷依據(jù)。研究表明MIAT多態(tài)位點rs230152A等位基因能顯著增加日本個體罹患MI風險。我們推測MIAT基因多態(tài)性在MI發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要作用，而本項目通過對MIAT基因中國漢族人群最小等位基因頻率大于20%的SNPs位點進行分型，篩選出影響MI發(fā)病風險SNPs位點，并探討這些多態(tài)位點影響MI遺傳易感的潛在分子機制。

一、資料與方法

SNP經(jīng)典思路步驟是先找目的基因標簽SNPs，然后挑選功能位點，但HapMap網(wǎng)站關(guān)閉，很多選擇標簽SNPs的方法不能使用，但還有千人基因組網(wǎng)站數(shù)據(jù)能用，本文將詳細敘述如何從千人基因組網(wǎng)站下載某個區(qū)段位點信息導(dǎo)入Haploview選擇標簽SNPs。

1.獲取基因在染色體上的位置信息，以MIAT為例，打開http：//grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index，輸入基因MIAT，點擊Go后進入MIAT基因信息界面，會出現(xiàn)MIAT在染色體上的位置。

2.將信息復(fù)制到VCFtoPEDConverter界面里，VCFtoPEDConverter是千人基因組網(wǎng)站自帶的將vcf轉(zhuǎn)換為HapMap格式在線工具，直接輸入基因位置信息可轉(zhuǎn)換。打開網(wǎng)站找到VCFtoPEDConverter把頁面包括基因位置、中國漢族北京人群（CHB）等信息填寫完整。點擊run后等待刷新完畢，顯示done，點擊查看結(jié)果。下載ped和info文件，解壓兩個文件放入同一文件夾。

3.在Haploview里，打開ped文件，info文件也可以自動識別填入。如果提示morethantwoallelesatmarker86，去文件里找到錯誤的位點，將其修改過來便可。結(jié)果177個位點可100%覆蓋這個基因，不需要這么多位點，Minimumminorallelefreq可設(shè)置0.05、0.1、0.2，本實驗選0.20。點擊RescoreMarkers。一般r2＞0.8說明兩個位點是高度連鎖，一個位點可以代表另外一個，點擊runtagger，得到13組（其中4個沒有和其他SNP高度連鎖）。最后根據(jù)位點在基因上的位置一般和最小等位基因頻率（MAF）大于20%選出合適的位點進行分析。結(jié)合NCBI上SNP位點在染色體的位置，挑選出位于外顯子并且有轉(zhuǎn)錄本的SNP，結(jié)果如表2所示。

二、結(jié)果

1.染色體的位置，在千人基因組中查找到MIAT在染色體的位置是22：27042392-27072438，用于VCFtoPEDConverter。

2.MIAT的SNP，在Haploview里通過篩選獲得SNP，rs763271、rs35778551、rs1981493、rs36053931這四個沒有和其他SNP高度連鎖。MIAT中其他高度連鎖的SNP編號如表1所示。

表1 MIAT中其他高度連鎖的SNP編號（MAF＞20%）

3.進一步篩選SNP，結(jié)合NCBI上SNP位點在染色體位置，挑選出位于外顯子并且有轉(zhuǎn)錄本的MAF大于20%SNP，最終確定MIAT5個SNP位點，結(jié)果如表2所示。

表2 篩選出MIAT的基因多態(tài)性（MAF＞20%）

結(jié)語

遺傳變異中最常見SNP，當排除其他混雜因素后，一個遺傳標記在病例組中的頻率高于對照組，即表明該遺傳標記與疾病相關(guān)聯(lián)，根據(jù)MI危險因素、病理機制和代謝通路等，從已知基因內(nèi)部和其5’和3’端選擇多個遺傳標記作為研究對象，為進一步研究SNP位點與MI發(fā)病風險奠定基礎(chǔ)。本研究從MIAT基因177個SNP位點篩選出5個檢測位點分別為rs5761670、rs4280、rs9625066、rs4274、rs5997112，通過此種方法大大節(jié)省人力物力，但篩選方法不僅拘泥于此，也可使用其他方法，并且更多功能有待發(fā)掘。