漢中綠茶重要香氣成分及其在加工過程中的變化研究

劉珍珍，陳小華，李崇勇，楊培君

1. 內(nèi)江師范學(xué)院 地理與資源科學(xué)學(xué)院，四川 內(nèi)江 641000；2. 陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001；3. 陜西理工大學(xué) 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001；4. 漢中市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 漢中 723001

茶是當(dāng)今世界除水以外消費量最大的飲料[1]。 我國作為全球最大的綠茶主產(chǎn)國，茶產(chǎn)區(qū)主要分布于包括陜西省在內(nèi)的18 個省市區(qū)[2]。漢中盆地位于陜西省西南部，地處我國茶區(qū)最北緣，是我國北方地區(qū)最大的優(yōu)質(zhì)綠茶生產(chǎn)基地，主產(chǎn)炒青綠茶[3]。該地北依秦嶺，南屏巴山，所產(chǎn)綠茶具有“香高、味濃、耐沖泡”的特點[4]。

香氣是決定茶葉品質(zhì)和市場價值的重要因子[1]。現(xiàn)已從各類綠茶中鑒定出200 余種揮發(fā)性物質(zhì)，其中對綠茶香氣具有重要貢獻的化合物約30 種[5]。茶葉中香氣物質(zhì)的產(chǎn)生受多種因素的影響，如茶樹品種及其生長環(huán)境、栽培管理措施、鮮葉采摘時間以及加工工藝等[6]。漢中綠茶產(chǎn)區(qū)主要分布于海拔1000～1500 m、緯度32°～37°、年平均降雨量800～1300 mm、年日照時數(shù)2000 h 與年平均溫度14℃的秦嶺和巴山山區(qū)[7]，加工工藝流程主要包括攤青、殺青、揉捻 和干燥（二青、三青和足干）等[8]；獨特的地理氣候環(huán)境和加工工藝使得漢中綠茶呈現(xiàn)出以青香和板栗香為主、花香次之的香氣特征。

茶葉香氣物質(zhì)提取是茶葉香氣研究的前提。近二十年來，已有多種方法被用于提取茶葉香氣物質(zhì)，主要有溶劑輔助香氣蒸發(fā)提取法（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）、固相萃取法（solid phase extraction，SPE）、同時蒸餾萃取提取法（simultaneous distillation and extraction，SDE）、攪拌吸附提取法（stir bar sorptive extraction，SBSE）和固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME） 等[1]。SPME 法是一種快速、有效和簡便收集揮發(fā)性物質(zhì)的方法。該方法不但可用于收集干茶葉和茶湯中的揮發(fā)性物質(zhì)，亦可用于提取正常生長中的茶鮮葉實時釋放出的揮發(fā)性物質(zhì)[1]。與當(dāng)前廣泛使用的SDE 法相比，SPME 避免了SDE 法提取過程中由于高溫引起的降解、氧化和熱反應(yīng)導(dǎo)致的香氣“失真”，使提取的香氣物質(zhì)更接近于茶葉本身[1,9]。與SAFE 法相比，SPME 提取法更方便快捷（提取濃縮一步到位）和環(huán)保（無有機溶劑參與）[1]。

目前，關(guān)于漢中炒青綠茶中香氣成分在加 工過程中的變化研究未見報道。本試驗采用SPME 方法提取漢中炒青綠茶關(guān)鍵加工階段茶葉中的香氣物質(zhì)，使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chro- matography-mass spectrometry，GC-MS）結(jié)合香氣氣味特征對其重要香氣物質(zhì)在加工過程中的變化進行檢測分析，旨在為今后漢中炒青綠茶加工工藝的改進和香氣品質(zhì)的提升提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹品種為紫陽群體種，鮮葉標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉，于2019 年5 月10 日采自陜西理工大學(xué)秦巴紅茶研究所西鄉(xiāng)試驗站。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Shimadzu GC-MSTQ8040, Japan），色譜柱：Inert Cap-purWax（30 m×0.25 mm×0.25 μm, Shimadzu, Japan），固相微萃取頭（DVB/CAR/PDMS/50/30μm, Supleco, USA），恒溫磁力攪拌水浴鍋（HH-J4，金壇市精達(dá)儀器制造廠），萬分之一電子天平（ME104, Mettler Toledo），竹篾墊（自制），滾筒殺青機（XHB-XQ100，福建安溪鑫恒寶機械），揉捻機（ND-55，安溪縣南丹機械廠），干燥機（XHB-400，福建安溪鑫恒寶機械），電子數(shù)顯溫度計（WST-101，上海飛龍儀表電器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 茶樣加工

攤青：采摘后的茶鮮葉于竹篾墊中攤晾5 h（攤?cè)~厚度5 cm，室內(nèi)溫度22±2℃）；殺青：攤青適度后的鮮葉于滾筒殺青機中殺青8 min（殺青溫度260±2℃）；揉捻：殺青后的茶葉晾至室溫后于揉捻機中揉捻40 min；干燥：揉捻后的茶葉在烘干機中于120±2℃溫度下干燥40 min 后制得成品茶。

1.3.2 茶樣采集

茶葉樣品分別在茶葉各加工階段（鮮葉采摘、攤青、殺青和干燥）結(jié)束后進行采集，經(jīng)液氮冷凍后于-80℃冰箱中保存直至分析。

1.3.3 茶葉香氣萃取及熱脫附

茶葉香氣物質(zhì)萃取采用SPME 方法進行。稱取5.0 g 經(jīng)液氮研磨的茶葉樣品置于50 mL 頂空瓶中，將SPME 纖維萃取頭插入頂空瓶中并于45℃水浴鍋中萃取30 min，萃取結(jié)束后立即將萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進樣口（200℃）熱脫附3 min。每樣品萃取不少于3 次。

1.3.4 GC-MS 檢測

GC 參數(shù)如下：升溫程序為40℃保持5 min， 然后以 3 ℃/min 升溫至 220 ℃。進樣方式為不分流進樣，進樣口溫度200℃，柱流量 1.2 mL/min， 載氣控制方式為恒線速度方式。MS 參數(shù)如下：傳輸線溫度（接口溫度）為230℃，電離方式為EI 源（70 eV），離子源溫度為200℃，質(zhì)譜掃描范圍為20～200 u，采集方式為Q3 scan。

1.3.5 定性定量分析

定性分析：質(zhì)譜數(shù)據(jù)首先采用GC-MS 自帶的NIST14 標(biāo)準(zhǔn)譜庫進行檢索，然后使用實驗室基于香氣化合物標(biāo)準(zhǔn)品自建的香氣物質(zhì)質(zhì)譜庫（約300 種香氣化合物）進行進一步檢索，最后通過對這二種譜庫檢索的結(jié)果進行綜合分析，對未知化合物進行最終鑒定。定量分析：采用峰面積歸一法進行，對鑒定的化合物進行相對定量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析與處理

平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差使用Excel 軟件（Version 2010, Microsoft, USA）進行分析，差異顯著性使用IBM SPSS Statistics 軟件（Version 22, IBM Crop., USA）進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 漢中綠茶香氣成分

漢中綠茶通常被認(rèn)為具有明顯的青香和板栗香氣，花香則較弱。定性定量及氣味特征分析結(jié)果顯示（表1 和圖1），漢中綠茶香氣中存在多種氣味化合物，其中主要以花香化合物為主（48.14%），其次為青香（18.14%）化合物，對板栗香具有重要作用的堅果香化合物含量則較低（0.06%）。現(xiàn)有研究表明，芳樟醇及其氧化物I～IV（花香氣）、香葉醇（玫瑰香氣）和β-紫羅蘭酮（紫羅蘭香氣）、(Z)-3-己烯醇（青香氣）和E-己酸葉醇酯（青香氣）、2-乙基-5-甲基吡嗪（堅果香氣）、苯并噻唑（堅果香氣）和2-乙?；量▓怨銡猓┍徽J(rèn)為是各類綠茶中花香氣、青香氣和板栗香氣的重要貢獻化合物[10-14]。這些重要的香氣化合物在本試驗漢中綠茶樣中被鑒定出來，其中以芳樟醇含量最高（13.62%），其次為E-己酸葉醇酯（10.20%）、芳樟醇氧化物I～IV（4.87%、8.18%、1.33%和5.96%）和香葉醇（5.07%），(Z)-3-己烯醇（0.94%）、β-紫羅蘭酮（0.07%）、2-乙基-5-甲基吡嗪（0.02%）、苯并噻唑（0.02%）和2-乙酰基吡咯（0.02%）含量則較低。Baba 和 Kumazawa 等人[10-11]采用固相萃?。⊿PE）和溶劑輔助香氣蒸發(fā) （SAFE）等方法從中國炒青綠茶中提取出另外4 種重要的低含量堅果香氣化合物包括2-乙基-3,5-二甲基吡咯、2,3-二乙基-5-甲基吡咯和2-乙基噻唑和2-乙基-2-噻唑，在本試驗樣中未被鑒定出來，目前通過使用SPME 方法提取綠茶香氣的研究中這些化合物亦均未見報 道[15-20]。

與國內(nèi)其他產(chǎn)區(qū)綠茶相似[15-20]，漢中綠茶香氣中也存在高含量的芳樟醇和香葉醇，但芳樟醇氧化物和E-己酸葉醇酯含量顯著高于國內(nèi)其他產(chǎn)區(qū)綠茶。這可能與茶樹品種、茶葉生長所處的地理氣候環(huán)境以及加工工藝等有很大的關(guān)系[6]。在本試驗漢中綠茶樣中，盡管花香化合物含量顯著高于青香和堅果香化合物，但該綠茶卻被認(rèn)為具有明顯的青香和板栗香，花香反而較弱。這可能歸因于茶香氣的形成除與氣味物質(zhì)的濃度有關(guān)外，還受到包括揮發(fā)度、氣味閾值以及氣味物質(zhì)之間的協(xié)同和遮蓋作用等諸多因素的影響[21]。有研究表明，盡管堅果香氣化合物含量很低，但由于氣味閾值遠(yuǎn)低于花果香氣化合物，使得堅果香氣強度遠(yuǎn)高于花果香氣[7,21-25]。此外，在試驗綠茶樣中花香氣貢獻化合物主要為醇類及其氧化物如香葉醇和芳樟醇及其氧化物，青香氣貢獻化合物主要為烯醇類化合物如(Z)-3-己烯醇，由于前者的揮發(fā)度顯著低于后者，使得青香氣更容易被感知[7,21-25]。 可見，漢中綠茶中的這些香氣物質(zhì)在其青香氣和花香氣形成過程中扮演重要角色。

表1 漢中綠茶香氣成分及其在加工中的變化Table 1 Aroma components of Hanzhong green tea and their changes during processing

續(xù)表1

2.2 漢中綠茶香氣物質(zhì)在加工中的變化

圖2 漢中綠茶重要香氣物質(zhì)在加工中的變化Figure 2 Changes of important aroma compounds in Hanzhong green tea during processing

結(jié)果顯示，漢中綠茶香氣化合物受到加工工序的影響較大（圖2）。與鮮葉相比，青香氣化合物經(jīng)攤青含量顯著增加，經(jīng)殺青和干燥工序后顯著降低（圖2A）；花香氣化合物含量變化表現(xiàn)出同樣的趨勢，僅變化幅度相對較小，經(jīng)攤青后含量明顯增加，經(jīng)殺青和干燥工序后分別較前一工序降低（圖2B）。堅果香氣化合物則隨著攤青、殺青、干燥工序的推進分別呈現(xiàn)明顯或顯著增加（圖2D）。其中 (E)-己酸葉醇酯和芳樟醇分別在攤青和殺青后含量均顯著增加，在干燥后則分別顯著下降（圖2A 和2B）；香葉醇和β-紫羅蘭酮含量經(jīng)攤青后含量顯著增加，但經(jīng)殺青和干燥工序后均呈顯著下降（圖2B 和2C）；(Z)-3-己烯醇在攤青階段呈下降趨勢，經(jīng)殺青后含量達(dá)到最低，干燥完成略有增加（圖2A）；芳樟醇氧化物I ～IV 含量則隨加工工序的推進逐漸增加（2C）。苯并噻唑、2-乙基-5-甲基吡嗪和2-乙酰基吡咯在鮮葉和攤青階段均未檢出，經(jīng)殺青后有少量產(chǎn)生，干燥完成有增加（圖2D）。

花香氣和青香氣化合物在攤青階段大量積累的現(xiàn)象在楊春等人[20]的研究中也有報道，這可能與茶鮮葉在攤青過程中由脫水脅迫誘導(dǎo)的脫落酸（ABA）大量合成有關(guān)[26]。花香氣和青香氣化合物主要來源于萜類、脂肪酸和類胡蘿卜素代謝途徑，其生物合成前體均位于ABA 代謝通路的上游[1,27-29]，ABA 在攤青階段的大量合成可能誘導(dǎo)了上游代謝流的顯著增加或關(guān)鍵酶表達(dá)量提高，進而促進了這些香氣化合物的大量合成。本試驗結(jié)果還顯示，一些花香和青香氣化合物如芳樟醇和E-己酸葉醇酯除了在攤青階段進行大量合成外，經(jīng)殺青工序亦進行了一定量的積累。這可能由于殺青過程中茶鮮葉細(xì)胞并未被立刻殺死，加熱可能進一步促進了茶葉片的脫水程度及ABA 的積累[10]。可見，茶鮮葉經(jīng)適度攤青更有助于青香和花香化合物的合成和積累。芳樟醇氧化物經(jīng)干燥含量顯著增加可能歸因于芳樟醇在干燥階段的熱氧化反應(yīng)，定量結(jié)果可看到芳樟醇含量經(jīng)干燥后顯著降低，減少的部分可能在加熱過程中轉(zhuǎn)化為各種芳樟醇氧化物。綠茶花香的形成除與攤青工藝有關(guān)外，還受到干燥工藝的顯著影響。堅果類化合物經(jīng)干燥工序顯著增加主要歸因于這類化合物為米拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，高溫有利于這類化合物的化學(xué)合成[29]。

3 結(jié)論

漢中綠茶被認(rèn)為具有明顯的青香和板栗香氣以及弱的花香氣。本試驗采用SPME 技術(shù)結(jié)合GC-MS 和氣味特征分析對漢中烘青綠茶加工過程中重要香氣化合物的變化進行了檢測分析。結(jié)果表明，漢中綠茶香氣主要以花香化合物為主，其次為青香化合物，堅果香化合物較少。其中，對花香形成具有重要貢獻的化合物7 種，分別為芳樟醇及其氧化物I～IV、香葉醇和β-紫羅蘭酮；對青香氣形成具有重要貢獻的化合物2種，分別為(Z)-3-己烯醇和E-己酸葉醇酯；對堅果香氣形成具有重要貢獻的化合物3 種，分別為2-乙基-5-甲基吡嗪、苯并噻唑和2-乙?；量４送?，一些對堅果香氣形成具有重要貢獻的化合物如2-乙基-3,5-二甲基吡咯、2,3-二乙基-5-甲基吡咯、2-乙基噻唑和2-乙基-2-噻唑可能也存在，但在本次試驗茶樣中并未被檢測到，可能與提取方法有很大關(guān)系。這些香氣化合物受加工工藝的顯著影響。青香氣化合物經(jīng)攤青之后含量顯著增加，殺青和干燥后則顯著降低；花香氣化合物經(jīng)攤青和殺青工藝含量顯著增加，在干燥后則顯著降低；堅果香氣化合物在加工過程中含量隨著加工工序的推進逐漸增加。其中 (E)-己酸葉醇酯和芳樟醇分別在攤青和殺青后含量均顯著增加，在干燥后則分別顯著下降（圖2A 和2B）；香葉醇和β-紫羅蘭酮含量經(jīng)攤青后含量顯著增加，但經(jīng)殺青和干燥工序后均呈顯著下降（圖2B 和2C）；(Z)-3-己烯醇在攤青階段呈下降趨勢，經(jīng)殺青后含量達(dá)到最低，干燥完成略有增加（圖2A）；芳樟醇氧化物I～IV 含量則隨加工工序的推進逐漸增加（2C）。苯并噻唑、2-乙基-5-甲基吡嗪和2-乙?；量┰邗r葉和攤青階段均未檢出，經(jīng)殺青后有少量產(chǎn)生，干燥完成后增加。