脈管Ⅱ號膠囊對大鼠后肢缺血后血管再生的影響及其機(jī)制

王世軍, 楊尾蓮, 陳福偉, 張美吉, 楊 旭

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院外科，福建 福州 350004）

外周動(dòng)脈疾病是缺血性卒中和糖尿病等主要大血管并發(fā)癥之一，是動(dòng)脈粥樣硬化的一種表現(xiàn)形式，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢，對患者生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響［1-2］。隨著外周血管粥樣硬化情況逐漸加重，下肢的血液供應(yīng)減少，嚴(yán)重者將導(dǎo)致血管閉塞，最終形成下肢缺血導(dǎo)致的壞疽、足部潰瘍、甚至截肢等嚴(yán)重后果［3-4］。治療外周動(dòng)脈疾病的藥物較少，研究［5-6］表明：雖然溶栓治療可提高肢體存活率，但易導(dǎo)致顱內(nèi)出血癥等并發(fā)癥。血管生成素1（angiopoietin-1，Ang-1）是血管成熟和抗炎的重要成分，對缺血?jiǎng)游锬Ｐ脱苌删哂兄匾饔茫?］。血管生成標(biāo)志物，如血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素（angiopoietin，Ang）及酪氨酸激酶受體2（tyrosine kinase receptors 2，Tie2） 可能是評估外周動(dòng)脈疾病患者死亡率的標(biāo)記物［8］。

脈管Ⅱ號膠囊是福建省著名老中醫(yī)鄭則敏主任的家傳驗(yàn)方，由君藥赤芍、牡丹皮清熱涼血，活血化瘀，臣藥水蛭、莪術(shù)破血逐淤，佐使藥全蝎、蜈蚣解毒散結(jié)，通絡(luò)止痛，共奏清熱活血和化瘀通脈之功效［9］。前期研究［10］顯示：脈管Ⅱ號膠囊可通過調(diào)控Ang-1/Tie2 信號通路表達(dá)促進(jìn)血管生成。臨床數(shù)據(jù)亦顯示脈管Ⅱ號膠囊對下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥具有較好的治療效果［11］。因此，為了探討脈管Ⅱ號膠囊是否通過調(diào)控Ang-1/Tie2 信號通路作用于外周動(dòng)脈疾病，本研究通過構(gòu)建大鼠后肢缺血模型，經(jīng)脈管Ⅱ號膠囊治療后，檢測大鼠肌肉組織血管再生以及Ang-1/Tie2表達(dá)變化，以期為脈管Ⅱ號膠囊治療外周動(dòng)脈疾病提供一定的數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器60 只SPF級雌性SD 大鼠，3 月齡，體質(zhì)量（254±22）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2015-0018，購于湖北省疾病預(yù)防控制中心。飼養(yǎng)環(huán)境室溫控制在23 ℃左右，濕度60%左右，自然光源，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由飲水1 周，適應(yīng)環(huán)境。脈管Ⅱ號膠囊（福建中醫(yī)藥大學(xué)，閩藥制字：Z06106040），主要成分：全蝎、水蛭、延胡索和玄參等；復(fù)方丹參（廣州白云山制藥廠，批號：D18A034）。Tie-2 兔抗（美國abcam 公司，貨號：AB227219）；Ang-1 兔抗（中國BIOSWAMP 公司，貨號：PAB31570）；3-磷酸甘 油 醛 脫 氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH） 兔 抗 （ 中 國BIOSWAMP 公司，貨號：PAB36264）。石蠟切片機(jī)（徠卡纖維系統(tǒng)有限公司，型號：RM2235），電泳儀（上海天能科技有限公司，型號：EPS300），全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司，型號：Tanon-5200）。

1.2 造模和分組參考陳兵等［12］大鼠慢性后肢缺血模型的造模方法進(jìn)行造模。將大鼠分為正常對照組、 模型組、 假手術(shù)組、陽性對照組（0.202 5 g·kg－1復(fù)方丹參）、低劑量脈管Ⅱ號膠囊組（30 mg·kg－1）和高劑量脈管Ⅱ號膠囊組（90 mg·kg－1），每組10 只。模型制備：大鼠腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉30 mg·kg－1，麻醉成功后，固定大鼠呈仰臥位，腹股溝區(qū)備皮常規(guī)消毒，縱行切開一后肢正中皮膚，分離出股動(dòng)脈，范圍從腹股溝韌帶直至膝關(guān)節(jié)，用7-0 絲線結(jié)扎股動(dòng)脈及其于股部的所有分支，大鼠的另一后肢僅分離股動(dòng)靜脈而不結(jié)扎，5-0 絲線縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠僅分離股動(dòng)靜脈而不結(jié)扎，5-0 絲線縫合皮膚。手術(shù)結(jié)束后將大鼠置于37 ℃孵箱中直到麻醉蘇醒，再將動(dòng)物轉(zhuǎn)移回飼養(yǎng)籠。

造模后，連續(xù)觀察后肢皮膚顏色變化及閉塞缺血情況。后肢皮膚顏色呈現(xiàn)紫色，后肢行動(dòng)受阻，后肢行動(dòng)受阻的標(biāo)準(zhǔn)［13］如下：0 級，后肢完全癱瘓，刺激肌肉時(shí)未產(chǎn)生任何收縮反應(yīng)，記為5 分；1 級，肌肉收到刺激后有輕微的收縮，后肢有小動(dòng)作，記為4 分；2 級，后肢能作運(yùn)動(dòng)，但肌力差，不能克服重力，不能抬起腳掌，記為3 分；3 級，肌肉可抗阻力，后肢能正常運(yùn)動(dòng)，部分時(shí)間可抬起腳掌，記為2 分；4 級，肌力較好，跛行，記為1 分；5 級，能正常行走，記為0 分。且分?jǐn)?shù)達(dá)到2 分及以上表示造模成功。低和高脈管Ⅱ號膠囊組大鼠分別給予15 和45 mg·kg－1脈管Ⅱ號膠囊，灌胃體積10 mL·kg－1，每日灌胃2 次［10］。正常對照組大鼠給予等體積生理鹽水；陽性對照組大鼠每天給予復(fù)方丹參片0.202 5 g·kg－1［14］。觀察大鼠每天的狀態(tài)，觀察大鼠趾甲的變化以及兩側(cè)后肢皮膚顏色和閉塞缺血情況。檢測大鼠后肢的溫度差。兩后肢溫度差=假手術(shù)后肢溫度—缺血造模后肢的溫度。

1.3 HE 染色觀察大鼠后肢肌肉組織病理形態(tài)表現(xiàn)將大鼠后肢肌肉組織經(jīng)過脫水，包埋于蠟塊中，以5 μm 的厚度均勻切片。將蘇木精加入蒸餾水內(nèi)加溫溶解，冷卻后加入酒精和甘油，備用。石蠟切片脫蠟至水，用蘇木精液染核7 min，置于容器中，流水沖洗2 h。以1% 的鹽酸酒精溶液分化3 s，用伊紅染液染色5～10 min。用95%酒精、無水酒精和二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察大鼠后肢肌肉組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測大鼠肌肉組織中Ang-1 和Tie2 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)組織玻片脫蠟后用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，玻片置于500 mL 的檸檬酸鈉緩沖液（0.01 mol·L－1，pH 6.0）中，微波爐加熱沸騰10 min，冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS） 洗滌3 次，每次5 min，H2O2滅活內(nèi)源性過氧化氫酶15 min，PBS緩沖液沖洗，加0.2%Triton X-100 通透10 min，滴加10%山羊血清封閉，室溫孵育20 min，然后滴加Ang-1（稀釋比例1∶100）和Tie2（稀釋比例1∶100）抗體，陰性對照滴加PBS 緩沖液，4 ℃過夜，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min，滴加Ang-1和Tie2 二抗試劑，室溫孵育20 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min，滴加DAB 顯色，鏡下觀察，當(dāng)目的蛋白顯色發(fā)生變化時(shí)，立即浸泡在去離子水中，終止反應(yīng)。然后進(jìn)行核染。蘇木精溶液中染色4 min，去離子水浸泡1 min。于顯微鏡下觀察細(xì)胞核的顏色，若染色過深，在分化液中浸3 s，去離子水洗滌5 min。促藍(lán)1 s，去離子水浸泡1 min。再于電子顯微鏡下觀察細(xì)胞核的顏色；如果細(xì)胞核的顏色過淺，可再用蘇木精復(fù)染，直至染出理想的顏色。核染以后，在室溫晾干片子，浸二甲苯透明，中性樹膠封片。將玻片晾干，在顯微鏡下拍片。正常組織細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性表達(dá)細(xì)胞主要為黃色或棕黃色，分析陽性區(qū)域平均光密度（average optical density，AOD）值，得出陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測大鼠微血管密度免疫組織化學(xué)檢測過程同“1.4”，CD31兔抗稀釋比1∶100。顯微鏡下觀察切片染色結(jié)果，細(xì)胞核呈藍(lán)色，CD31 陽性表達(dá)細(xì)胞被染成棕色或棕黃色，是微血管形成的特征。通過CD31 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)進(jìn)而分析AOD 以評價(jià)微血管密度。

1.6 Western blotting 法檢測大鼠肌肉組織中Ang-1 和Tie2 蛋白表達(dá)水平提取后肢肌肉組織蛋白并定量，取25 μg 處理好的蛋白，60 V 預(yù)電泳30 min；100 V 電泳1 h，轉(zhuǎn)膜緩沖液中100 V 轉(zhuǎn)膜30 min， TBS封閉液封閉1 h， 兔 抗Ang-1（1∶1 000） 和Tie2 抗體（1∶2 000） 4 ℃過夜后，分別加入二抗室溫孵育1 h，ECL 發(fā)光顯色，以GAPDH 為內(nèi)參，對顯影條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組大鼠后肢溫度差、肌肉組織中Ang-1 和Tie2 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)、微血管密度及Ang-1 和Tie2 蛋白表達(dá)水平均呈正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況大鼠手術(shù)側(cè)后肢皮膚溫度偏低，皮膚呈現(xiàn)暗紅色，后肢體出現(xiàn)紫紺和趾甲脫落等現(xiàn)象發(fā)生。正常對照組（0.02 ℃±0.08 ℃）和假手術(shù)組（－0.01 ℃±0.10 ℃） 大鼠兩后肢溫度差較低；模型組（2.76 ℃±0.13 ℃） 大鼠兩后肢溫度差明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），即模型組大鼠缺血后肢溫度降低比較明顯。陽性對照組（0.56 ℃±0.20 ℃）、低劑量脈管Ⅱ號膠囊組（1.05 ℃±0.49 ℃） 和高劑量脈管Ⅱ號膠囊組（0.67 ℃±0.27 ℃）大鼠后肢溫度差明顯降低（P＜0.05），即缺血后肢溫度回升。

2.2 各組大鼠后肢肌肉組織病理形態(tài)表現(xiàn)正常對照組和假手術(shù)組大鼠顯示正常橫紋肌結(jié)構(gòu)；模型組大鼠后肢肌肉組織呈現(xiàn)染色不均，細(xì)胞腫脹明顯，橫紋消失，部分細(xì)胞核染色深、密集，并出現(xiàn)肌束膜內(nèi)肌原纖維萎縮；低和高劑量脈管Ⅱ號膠囊組大鼠以上情況有所緩解。見圖1。

2.3 各組大鼠肌肉組織中Ang-1 和Tie2 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：正常對照組和假手術(shù)組大鼠肌肉組織中Ang-1 和Tie2 陽性表達(dá)細(xì)胞較少，Ang-1 和Tie2 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肌肉組織中Ang-1 和Tie2 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和高劑量脈管Ⅱ號膠囊組大鼠組織中Ang-1 和Tie2 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯升高（P＜0.05）。見圖2、圖3和表1。

2.4 各組大鼠微血管密度與正常對照組（0.31±0.05） 比較，假手術(shù)組（0.30±0.06） 大鼠微血管密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組（0.20±0.08）大鼠微血管密度明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組（0.31±0.02） 和高劑量脈管Ⅱ號膠囊組（0.33±0.04） 大鼠微血管密度均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，低劑量脈管Ⅱ號膠囊組（0.25±0.07）大鼠微血管密度也有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

2.5 各組大鼠肌肉組織中Ang-1 和Tie2 蛋白表達(dá)水平與正常對照組比較，假手術(shù)組大鼠肌肉組織中Ang-1 和Tie2 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肌肉組織中Ang-1 和Tie2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和高劑量脈管Ⅱ號膠囊組大鼠肌肉組織中Ang-1 和Tie2 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）。見圖5 和表2。

表1 免疫組織化學(xué)染色觀察各組大鼠肌肉組織中Ang-1 和Tie2 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)Tab. 1 Number of cells with positive expressions of Ang-1 and Tie2 in muscle tissue of rats in various groups observed by immunohistochemistry staining (n=10，±s）

表1 免疫組織化學(xué)染色觀察各組大鼠肌肉組織中Ang-1 和Tie2 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)Tab. 1 Number of cells with positive expressions of Ang-1 and Tie2 in muscle tissue of rats in various groups observed by immunohistochemistry staining (n=10，±s）

*P＜0.01 vs sham operation group；△P＜0.05 vs model group.

Group Number of positive cells Ang-1 0.36±0.04 0.36±0.04 0.25±0.02*0.32±0.02△0.25±0.04 0.30±0.02△Normal control Sham operation Model Positive control Low dose of Vascular CaspuleⅡHigh dose of Vascular CaspuleⅡTie2 0.33±0.01 0.31±0.01 0.23±0.02*0.30±0.03△0.28±0.02 0.29±0.02△

3 討 論

外周動(dòng)脈疾病導(dǎo)致動(dòng)脈狹窄或閉塞，組織和器官則會(huì)出現(xiàn)血供應(yīng)不足，處于缺血狀態(tài)，機(jī)體會(huì)生成代償性的側(cè)支血管，這種現(xiàn)象稱為生理性的血管新生［15］。結(jié)扎或切斷股動(dòng)脈及其分支是目前最普遍應(yīng)用的后肢缺血模型的制備方法［16］，鄒偉等［17］采用左下肢股動(dòng)脈結(jié)扎并切斷股動(dòng)脈構(gòu)建小鼠下肢缺血模型，小鼠出現(xiàn)左下肢無法站立、足部出現(xiàn)嚴(yán)重發(fā)黑和壞死情況及趾甲發(fā)黑等缺血癥狀。本研究采用股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)建模發(fā)現(xiàn)：大鼠下肢動(dòng)脈缺血后，出現(xiàn)手術(shù)側(cè)后肢皮膚溫度偏低、皮膚顏色暗紅、肢體紫紺和趾甲脫落等現(xiàn)象，證明模型建立成功。

血管生成過程受多種信號通路調(diào)控，Ang-1 及其特異性受體Tie2 是最重要的血管生成信號通路之一。Ang/Tie2 信號通路可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞以及血管平滑肌細(xì)胞，從而促進(jìn)血管的新生和重塑［18］。Ang-1 作為一種內(nèi)皮特異性保護(hù)因子，通過激活內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的Tie2 促進(jìn)血管完整性，有利于促血管生成［19］。Ang-1 與受體Tie2 相結(jié)合并活化，發(fā)生自身磷酸化后被激活，才可發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)［20-21］。微血管密度是直接反映側(cè)支血管循環(huán)最可靠的指標(biāo)，CD31 作為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)可反映微血管密度［22］。研究［23］顯示：在糖尿病后肢缺血大鼠缺血區(qū)域附近的肌肉組織中Ang-1 以及血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)明顯下降。在局灶性腦缺血大鼠的缺血組織中，上調(diào)Ang-1/Tie2 表達(dá)可促進(jìn)血管再生［24］。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)過脈管Ⅱ號膠囊治療后，大鼠后肢肌束間有產(chǎn)生微血管的趨勢，且Ang-1 和Tie2 蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示脈管Ⅱ號膠囊可能是通激活A(yù)ng-1/Tie2 信號通路，促進(jìn)缺血組織的血管再生能力，增加微血管的形成。

圖4 免疫組織化學(xué)染色觀察各組大鼠肌肉組織微血管密度(×200)Fig.4 Microvessel densities of muscle tissue of rats in various groups observed by immunohistochemistry staining(×200)

表2 Western blotting 法檢測各組大鼠肌肉組織中Ang-1 和Tie2 蛋白表達(dá)電泳圖Tab. 2 Electrophoregram of expressions of Ang-1 and Tie2 in muscle tissue of rats in various groups detected by Western blotting method (n=10，±s）

*P＜0.01 vs sham operation group；△P＜0.05 vs model group.

Group A value Ang-1 1.00±0.10 0.96±0.14 0.39±0.11*0.75±0.09△0.51±0.06△0.72±0.09△Normal control Sham operation Model Positive control Low dose of Vascular CaspuleⅡHigh dose of Vascular CaspuleⅡTie2 1.00±0.05 0.94±0.05 0.38±0.05*0.78±0.06△0.53±0.09△0.73±0.08△

綜上所述，脈管Ⅱ號膠囊對下肢動(dòng)脈缺血癥狀產(chǎn)生一定的緩解作用，可能是通過激活A(yù)ng-1/Tie2 信號通路、促進(jìn)血管再生成。結(jié)合前期研究［9-11］結(jié)果，提示脈管Ⅱ號膠囊對下肢缺血具有一定的治療效果，應(yīng)進(jìn)行更深入全面的研究，進(jìn)而為外周動(dòng)脈疾病的新藥研發(fā)提供更多的理論基礎(chǔ)。