不同加工工藝對刺梨葉茶品質(zhì)和化學(xué)成分的影響

張寶會，姚新轉(zhuǎn)，陳湖芳，張傳明，呂立堂,※

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院山地植物資源與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 5500251；2.貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州 貴陽 550025；）

刺梨具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。它富含山梨素、維生素C、多酚、多糖和-谷甾醇等物質(zhì)，其中所含維生素C為27 040 mg/kg[1]，被稱為“維生素C 之王”。前期研究發(fā)現(xiàn)，刺梨具有多種生理功能：山梨素具有消化、健脾、收斂和止瀉的作用，主要用于治療腹脹和腹瀉等疾?。稽S昌娥等[2]研究刺梨提取物可在體外抗肝癌細(xì)胞增殖，對肝癌有一定抑制作用；王輝等[3]發(fā)現(xiàn)刺梨干粉可以調(diào)節(jié)腎功能并延緩腎功能衰竭；王慧等[4]研究了刺梨中砷的吸附機(jī)理；李俊等[5]發(fā)現(xiàn)刺梨粉具有解毒作用；楊江濤等[6]發(fā)現(xiàn)刺梨花可以提高小鼠的抗氧化能力并延緩衰老。由于刺梨的各種作用，其果實(shí)的研究已經(jīng)廣泛開展。目前市場上有刺梨干果、刺梨酒、刺梨飲料、刺梨果粉、刺梨蜜餞和刺梨軟糖等產(chǎn)品，價(jià)格便宜，營養(yǎng)豐富，易于保存，并有良好的市場反應(yīng)。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.F. normalisRehd. Et Wils.）是多年生的落葉喬木薔薇科灌木[7]，廣泛分布在中國西南地區(qū)，如貴州、廣西、湖南、四川和重慶。刺梨果是可食用的，長期以來一直被用作傳統(tǒng)中草藥[8]，因此，作為貴州獨(dú)特的植物資源一直是貴州保健食品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，但刺梨幼葉未得到合理地應(yīng)用，主要因?yàn)槠溆兹~很難采摘，且產(chǎn)量很小。刺梨幼葉通過茶的加工工藝制成的刺梨葉茶，由于其獨(dú)特的茶香氣和保健功效，在當(dāng)?shù)厥袌錾瞎┎粦?yīng)求。然而，關(guān)于刺梨葉茶研究的報(bào)道很少，因此，本實(shí)驗(yàn)以刺梨鮮葉為原料，研究不同加工工藝對刺梨葉茶的品質(zhì)、主要營養(yǎng)成分和抗氧化活性的影響，對將來在保健飲料、營養(yǎng)食品和化妝品行業(yè)中使用刺梨葉開發(fā)功能性產(chǎn)品具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

2019 年6 月15 日，在貴州省貴陽市龍里縣的“刺梨溝”種植基地采摘刺梨的新芽。它們由1 芽、1 芽1葉、1 芽2 葉和少量的1 芽3 葉組成。所用標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸（CAS號：149-91-7）、野薔薇苷（CAS號：88515-58-6）、胡蘿卜苷（CAS號：474-58-8）、蘆?。–AS號：153-18-4）及試劑1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）均購自上海源葉生物技術(shù)有限公司（中國上海），所有標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 方法

將刺梨鮮葉均勻地?cái)偡旁谥裣希捎? 種制茶加工工藝對刺梨鮮葉進(jìn)行加工，它們的投葉量都是10 kg，具體方法如下：

刺梨葉綠茶加工分為:1）微波殺青（中國格蘭仕集團(tuán)有限公司微波爐型號：WP700P21）：殺青1 min、揉捻20 min、干燥60 ℃12 h；2）滾筒殺青（浙江上洋機(jī)械有限公司型號：6CST-40）：滾筒溫度360℃，殺青45 s、揉捻15 min、干燥60 ℃12 h；3）蒸汽殺青（蘇泊爾不銹鋼蒸鍋）：殺青2.5 min、揉捻15 min、干燥60 ℃12 h。

刺梨葉紅茶加工：萎凋15 h、揉捻15 min、發(fā)酵3.5h，將發(fā)酵后的葉子（約1 cm 厚）鋪在干燥機(jī)（浙江綠峰機(jī)械有限公司，瞿州，6CZG-60）的干燥盤上，最后將發(fā)酵后的葉子用80 ℃的干燥方法處理，以得到每100 g葉子中約含5 g 水分的紅茶[9]。

刺梨葉白茶加工：采摘鮮葉用竹匾及時(shí)攤放，厚度均勻，不可翻動(dòng)。攤青后，選用室內(nèi)（24±2℃）自然萎凋,當(dāng)茶葉達(dá)七、八成干時(shí)，室內(nèi)自然萎凋刺梨葉進(jìn)行并篩。初烘烘干機(jī)溫度100～120 ℃，10 min；攤涼15 min，復(fù)烘溫度80～90 ℃；低溫長烘70 ℃左右。茶葉干茶含水分控制在5%以內(nèi)，放入冰庫，溫度1～5 ℃。

重復(fù)測試3 次。將一部分茶葉樣品保存下來，將另一部分研磨并通過孔徑為0.425 mm 的篩子進(jìn)行篩分，進(jìn)行物理化學(xué)分析。

1.3 感官評審和主要成分分析

1.3.1 感官評審 由貴州大學(xué)茶學(xué)院的5 位評茶員（2 男，3 女）對不同的刺梨葉茶的外形、湯色、香氣、滋味和葉底5 項(xiàng)因子進(jìn)行評價(jià)并打分。計(jì)算公式為：感官得分=外形（25%）+湯色（10%）+香氣（25%）+滋味（30%）＋葉底（10%）[10]。茶樣品用隨機(jī)數(shù)盲編碼，將干茶放入專門的白板中以評估干茶的外形等，用新鮮煮沸的純凈水分別向標(biāo)準(zhǔn)的評審?fù)胫凶⑷胨崛〔铇悠罚? g）5 min。小組成員被要求聞及品茶水等，并在樣品之間暫停30s[11]。紅茶、綠茶和白茶的感官特性的定義和等級參考國家標(biāo)準(zhǔn)[12]。

1.3.2 抗壞血酸含量的測定 稱量100 g代表性樣品的可食用部分，放入組織搗碎器中，加入100 mL提取劑，然后迅速搗碎成勻漿，稱量10～40 g 漿液樣品，將樣品轉(zhuǎn)移到帶有萃取劑的100 mL 容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻并過濾，按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 6185-6186-2016）[13]測定。

1.3.3 氨基酸含量的測定 稱取10 g 過篩（100 目）粉末，吸取1 mL 樣品提取物和1 mL L-1谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到10 mL試管中，然后分別加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）和2%0.5 mL L-1的茚三酮溶液，將試管在沸水浴中放置10 min，然后立即在冰浴中冷卻至室溫，定容至25 mL，放置10 min，用分光光度計(jì)在570 nm 下測量樣品的吸光度，以試劑空白溶液做參照，用標(biāo)準(zhǔn)品吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算方式參考中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 8314-2013）[14]。

1.3.4 總黃酮含量測定 精密稱取4 g 干茶過篩（100目）粉末，置于150 mL 具塞錐形瓶，加適量甲醇溶液提取，每次提取30 min，共2次，濾過，濾液置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，通過微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液參考中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 20574-2006）[15]。

1.3.5 高效液相色譜檢測 刺梨葉茶中蘆丁、野薔薇苷、沒食子酸及胡蘿卜苷的含量。

（1）樣品提取方案：

（a）取樣品約0.5 g，加入色譜級甲醇2.5 mL，渦旋震蕩1 min。

（b）4 ℃，水浴超聲30 min，4 ℃，10 000 g 離心1 min，取上清液。

（c）沉淀再次加入色譜級甲醇2.5 mL，重新提取1 次。

（d）4 ℃，10 000 g 離心1 min，取上清液，合并兩次上清液。

（2）HPLC-MS/MS 方法

液相條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C8 反相色譜柱（2.1150,3.5m）。

柱溫：35 ℃。

流動(dòng)相：A：0.1%甲酸；B：乙腈。

流速：0.3 mL min-1。

表1 液相梯度參數(shù)Table 1 Gradient Parameters of HPLC

儀器所測得濃度為最終提取液的濃度，經(jīng)計(jì)算獲得原樣品中物質(zhì)含量，計(jì)算方法如下：

物質(zhì)含量（ng g-1）=檢測濃度（ng mL-1）稀釋體積（mL）/稱取質(zhì)量（g）

其中稀釋體積為樣品最終溶解進(jìn)樣時(shí)所用的溶液體積，稱取質(zhì)量為提取時(shí)的取樣質(zhì)量。檢測濃度由待測物質(zhì)峰面積代入標(biāo)曲方程，由儀器自動(dòng)求得。

1.4 自由基活性清除

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由獨(dú)立的3 次重復(fù)試驗(yàn)計(jì)算得出，標(biāo)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用單向方差分析（ANOVA）分析結(jié)果。Fisher 最小顯著差異（LSD）檢驗(yàn)用于評估均值差異，P ＜0.05 被認(rèn)為是顯著的。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS，美國伊利諾伊州芝加哥市）進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同加工方法對刺梨葉茶感官品質(zhì)的影響

對不同的加工工藝的刺梨葉茶進(jìn)行了感官審評，結(jié)果表明，制成的刺梨葉茶的感官品質(zhì)，不同的加工方式存在較大差異，見表1。刺梨葉制成的紅茶總評分最高，顏色紅明亮，有花果香氣，沖泡的茶湯滋味醇厚鮮爽，綜合品質(zhì)分析，刺梨幼嫩鮮葉可用于制作高品質(zhì)的紅茶。微波殺青刺梨葉綠茶顏色嫩綠明亮，但沖泡茶湯的香氣稍顯不足；綠茶蒸汽殺青和綠茶滾筒殺青茶葉湯色深黃色或黃綠欠亮，香氣不足。刺梨白茶顏色尚綠明亮，湯色欠明亮，香氣清香，滋味鮮爽，葉底軟嫩欠明亮，勻整。結(jié)果分析可知，刺梨鮮葉適合制紅茶，其次是微波殺青綠茶。

圖1 刺梨葉茶樣品Fig.1leaves tea sample

表1 不同加工方法刺梨葉茶樣品的感官質(zhì)量得分Table 1 Sensory quality scores ofleaves tea samples with different processing methods

表1 不同加工方法刺梨葉茶樣品的感官質(zhì)量得分Table 1 Sensory quality scores ofleaves tea samples with different processing methods

注：括號里的數(shù)值表示該項(xiàng)評分占總分的比例，同一列中‘*’表示差異達(dá)到顯著水平（P ＜0.05）。Note:The value in brackets indicates the proportion of the score in the tatal score,‘*’in the same column means the difference has reached a significant level(P ＜0.05).

序號Code葉底（10%）Leaf bottom 總分Total score評語 得分Comments score外形（25%）Appearance香氣（25%）Aroma湯色（10%）Liquor color滋味（30%）Taste評語 得分Comments score評語 得分Comments score評語 得分Comments score評語 得分Comments score刺梨葉綠茶微波殺青Rosa roxbunghii leaves green tea microwave wrap刺梨葉綠茶滾筒殺青Rosa roxbunghii leaves green tea tumbler wrap刺梨葉綠茶蒸汽殺青Rosa roxbunghii leaves green tea steam wrap刺梨葉紅茶Rosa roxbunghii leaves black tea嫩綠90±0.5 Verdant嫩綠87±1.5 Verdant嫩綠85±1.9 Verdant烏黑油潤，緊結(jié)93±1.2*Jet black oily,tight knot尚高爽89±1.2 Still Fresh清香88±0.6 Fragrant清香82±1.5 Fragrant嫩香85±1.3 Tender fragrance綠明亮88±1.8 Bright green綠明亮84±1.3 Bright green綠明亮83±3.1 Bright green紅明亮90±2.7 Bright red鮮醇88±0.6 Fresh alcohol清爽88±0.17 Refreshing清爽86±1.8 Refreshing鮮醇91±0.3*Fresh alcohol勻齊86±0.6 Evenly 88±0.94勻齊86±0.12 Evenly 86.6±0.74勻齊87±2.0 Evenly 84.6±2.06細(xì)嫩92±0.7*Tender 90.2±1.24刺梨葉白茶Rosa roxbunghii leaves white tea尚勻整83±0.9 Still neat清香83±0.8 Fragrant尚綠黃85±2.5 Still green yellow醇厚87±2.4 Mellow尚灰綠明亮84±0.9 Grayish green and bright 84.4±1.5

2.2 不同的加工方法對刺梨葉茶中抗壞血酸、氨基酸和黃酮含量的影響

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刺梨葉綠茶和刺梨葉紅茶的維生素C 含量低于刺梨葉白茶，可能是因?yàn)榫G茶殺青高溫和紅茶發(fā)酵過程中維生素C 降解速度比白茶快（圖2 A）；刺梨葉茶中不同加工方式氨基酸的含量，刺梨葉微波殺青綠茶含量最高28.8 mg/g，其次是白茶25.9 mg/g（圖2 B）。刺梨葉中含有生物活性物質(zhì)黃酮類化合物的含量，白茶＞紅茶＞蒸汽殺青綠茶（圖2 C）。

圖2 不同刺梨葉茶中抗壞血酸、氨基酸和黃酮的含量Fig.2 The contents of ascorbic acid,amino acids and flavonoids in different Rosa roxbimghi leaves tea

2.3 不同的加工方法對刺梨葉茶中野薔薇苷、沒食子酸、胡蘿卜苷和蘆丁含量的影響

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS/MS 對刺梨葉茶中野薔薇苷、沒食子酸、胡蘿卜苷和蘆丁含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3，野薔薇苷含量在刺梨葉綠茶和刺梨葉白茶中比刺梨葉紅茶中高，差異極顯著，綠茶中野薔薇苷含量是紅茶的3.8倍，白茶是紅茶的3.2 倍（圖3A）；沒食子酸在紅茶中含量是54758.09ng/g，在微波殺青綠茶中是15 484.1 ng/g，在白茶中是31 045.49 ng/g（圖3 B）；胡蘿卜苷在紅茶中含量是1 104.04 ng/g，在微波殺青綠茶中是244.32 ng/g，在白茶中是804.81 ng/g（圖3 C）；蘆丁含量在紅茶中是650.3ng/g，在微波殺青綠茶中是408.38 ng/g，在白茶中是506.11 ng/g（圖3 D），分析結(jié)果可知，不同的處理方式對刺梨葉茶中化學(xué)成分含量具有一定的影響，但是化學(xué)成分在刺梨葉紅茶中的含量比刺梨葉綠茶中的含量穩(wěn)定。

圖3 不同刺梨葉茶中野薔薇苷、沒食子酸、胡蘿卜苷和蘆丁的含量Fig.3 The content of rosamultin,gallic acid,carotin and rutin in different leaves tea

2.4 不同的加工方法對清除DPPH自由基能力的測定

分別提取刺梨葉茶中的黃酮和維生素C，黃酮和維生素C 對DPPH 均具有一定的清除能力，但是刺梨葉茶總黃酮的DPPH 清除能力小于維生素C。不同加工方式刺梨葉茶中黃酮的DPPH 清除率：紅茶（76.16%）＞微波殺青綠茶（75.86%）＞白茶（75.57%）＞蒸汽殺青綠茶（71.67%）＞滾筒殺青綠茶（71.58%）；不同加工方式刺梨葉茶中維生素C 的DPPH 清除率：紅茶（91.16%）＞微波殺青綠茶（90.19%）＞白茶（89.90%）＞蒸汽殺青綠茶（81.67%）＞滾筒殺青綠茶（81.58%）。研究表明黃酮具有較好的抗氧化性[18,19]，刺梨葉茶中的黃酮也有一定的抗氧化活性。

圖4 不同加工方式刺梨茶中的黃酮和維生素C 對清除DPPH自由基能力的測定Fig.4 Determination of the ability of flavonoids and Vc in different processing methods to scavenge DPPH free radicals

3 討論

刺梨是貴州特有植物資源，其對提高免疫功能、延緩衰老、抗氧化和降血脂等方面有明顯作用。本實(shí)驗(yàn)首次以刺梨鮮葉為原料，通過不同的加工方式加工成綠茶、紅茶和白茶，并對這些茶進(jìn)行感官評審及綜合評分，結(jié)果表明，刺梨鮮葉適制紅茶（顏色紅明亮，有花果香，沖泡的茶湯滋味醇厚鮮爽）。刺梨被稱為“維C 之王”，特別是刺梨富含的超氧化物歧化酶（簡稱SOD），是具有抗衰、防癌作用的活性物質(zhì)；此外還具有抗病毒、抗輻射的作用，在心血管、消化系統(tǒng)和各種腫瘤疾病防治方面，應(yīng)用十分廣泛。結(jié)果可知刺梨葉綠茶和刺梨葉紅茶維C 含量低于刺梨葉白茶，可能是綠茶高溫殺青和紅茶發(fā)酵過程中維生素C 降解。氨基酸是刺梨葉茶中最重要的化學(xué)成分之一，是新鮮，輕快的口感的主要成分之一，是形成香氣的基礎(chǔ)[11]，刺梨葉茶中不同加工方式氨基酸的含量，刺梨葉綠茶微波殺青含量最高28.8 mg/g，其次是白茶25.9 mg/g。刺梨中含有生物活性物質(zhì)黃酮類化合物，具有消炎、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、影響血壓、保護(hù)心血管、清除自由基和抗腫瘤等重要生物活性[20]。刺梨葉白茶黃酮類含量最高，但DPPH 清除能力低于刺梨葉紅茶，可能是在測定黃酮過程中出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)誤差或者是紅茶中還有其他物質(zhì)也參與了自由基清除。野薔薇苷是發(fā)揮抗缺氧作用的主要活性成分[21,22]，具有肝保護(hù)作用[23]，此外野薔薇苷還具有抗HIV、抗氧化應(yīng)激等作用[24-26]，結(jié)果顯示，不同的制茶工藝對野薔薇苷含量具有一定的影響，在綠茶中野薔薇苷含量最高，其次是白茶和紅茶。同時(shí)，對刺梨葉茶中沒食子酸、胡蘿卜苷和蘆丁進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3 種物質(zhì)在紅茶中含量最高且差異顯著，其次是白茶和綠茶，差異不顯著，紅茶發(fā)酵很大程度上取決于葉內(nèi)氧化酶活性的強(qiáng)弱[27]，使葉內(nèi)化學(xué)成分發(fā)生了變化。綜合茶葉感官審評結(jié)果和茶葉主要品質(zhì)成分分析，刺梨鮮葉適制紅茶。

本實(shí)驗(yàn)對不同刺梨葉茶的黃酮進(jìn)行了DPPH 清除能力測定，并以維生素C 為對照，初步評價(jià)了其抗氧化活性：紅茶（76.16%）＞綠茶微波殺青（75.86%）＞白茶（75.57%）＞綠茶蒸汽茶青（71.67%）＞綠茶滾筒殺青（71.58%），也為今后深入對其降糖、降脂和降壓等藥理研究提供了基礎(chǔ)[28]，為貴州特有野生資源刺梨葉茶的研究與開發(fā)提供了一定的科學(xué)參考依據(jù)。