提高供鎂水平對(duì)西洋參幼苗鎘脅迫緩解作用研究

錢佳奇，吳晨，阮音音，吳虎平，孫海，邵財(cái)，張亞玉,2※

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2 成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106）

鎘（Cd）是毒性最強(qiáng)、農(nóng)田污染最嚴(yán)重的重金屬之一[1]，Cd脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)過多活性氧（如O2-、H2O2等）的產(chǎn)生與積累，從而引發(fā)或者加劇細(xì)胞膜脂過氧化、蛋白質(zhì)變性以及核苷酸受損等，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。土壤中的鎘有著很強(qiáng)的生物遷移性，土壤鎘污染已對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的安全及人體健康構(gòu)成潛在威脅。

鎂（Mg）為植物生長(zhǎng)必需元素之一，也是葉綠素的重要組分[3]。鎂離子（Mg2+）也是許多酶的激活劑或組分，尤其是轉(zhuǎn)移磷酸基酶的活化劑，其所活化的酶類關(guān)系到糖類、脂肪、蛋白質(zhì)和核酸等的物質(zhì)代謝與能量轉(zhuǎn)化[4]，在植物的光合作用和植物抗逆過程中發(fā)揮著重要作用，近年來的研究表明，鎂可以減輕重金屬對(duì)植物的毒害作用，但關(guān)于鎂是否能緩解鎘對(duì)植物的毒害作用及其生理作用機(jī)制還不清楚。

西洋參（Panax quenquifolium L.）又稱西洋人參、花旗參等，屬五加科人參屬名貴藥材，以根部入藥，有抗疲勞、提高免疫、清熱解毒、滋陰補(bǔ)腎和口齒生津的功效[5]，被醫(yī)藥及保健行業(yè)廣泛應(yīng)用。就國(guó)產(chǎn)西洋參而言，目前并未發(fā)現(xiàn)鎘含量超標(biāo)現(xiàn)象[6]，但在西洋參主要栽培區(qū)的部分散戶依然進(jìn)行著過量使用農(nóng)藥、化肥等不規(guī)范的生產(chǎn)方式，這給西洋參及其土壤安全帶來了極大的隱患，目前依然存在西洋參產(chǎn)品安全及鎘超標(biāo)的潛在風(fēng)險(xiǎn)[7]。而國(guó)內(nèi)外對(duì)鎘脅迫下提高供鎂水平對(duì)西洋參生理特性及鎘積累的影響尚未報(bào)道。鑒于此，通過水培試驗(yàn)，研究鎘脅迫條件下提高供鎂水平對(duì)西洋參幼苗的緩解作用，為探索緩解植物鎘脅迫的途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為健康無病、大小一致的1 年生西洋參幼苗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)開始之前設(shè)置兩個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定西洋參幼苗最適鎘脅迫濃度及最適鎂培養(yǎng)濃度：1、設(shè)置0、10、20、30、40、50mol L-1的CdCl2，培養(yǎng)12 d，最終結(jié)果表明30mol L-1的CdCl2 脅迫效果最佳（即脅迫癥狀較10、20mol L-1更明顯，生長(zhǎng)狀態(tài)更差，葉片萎蔫更嚴(yán)重，植株發(fā)育更遲緩；40、50mol L-1的脅迫濃度幼苗死亡率較高，無法完成試驗(yàn)的樣品采集）；2、設(shè)置0、1、2、4、8、16 mmol L-1的Mg2+濃度，通過衡量生長(zhǎng)及生理指標(biāo)，最終確定Mg2+的最佳培養(yǎng)濃度為2 mmol L-1。

試驗(yàn)于2020 年7 月12 日至2020 年7 月24 日在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所智能光照培養(yǎng)間內(nèi)進(jìn)行。溫度范圍在23～28 ℃，濕度控制在60%～70% 之間，光照強(qiáng)度光強(qiáng)為105mol m-2s-1，光譜信息見圖1。將西洋參種子經(jīng)多菌靈處理后栽培至營(yíng)養(yǎng)土中，萌發(fā)35 d 后（株高為5～6 cm），于2020 年7 月12 日用直徑為2 cm、高為2.5 cm的圓柱狀海綿夾住莖部插入預(yù)先準(zhǔn)備好的帶孔（直徑1.7 cm）的塑料板（59 cm 11 cm）上，每板插苗30 株，將其放入盛有不同鎂濃度的改良Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液的水培箱（60 cm 12 cm 20 cm）中，水培箱內(nèi)含循環(huán)系統(tǒng)，潛水泵（Atman 創(chuàng)星AT-301）提供動(dòng)力完成水培箱內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液循環(huán)，以提高營(yíng)養(yǎng)液中溶解氧含量，保障在試驗(yàn)過程中西洋參根系溶解氧的供應(yīng)。每箱盛有7 L 營(yíng)養(yǎng)液，開始脅迫處理。營(yíng)養(yǎng)液配方pH 值為6.0。在此基礎(chǔ)上加施的并設(shè)置Mg2+濃度為2、3、4、5 mmol L-1，記為Cd、CM1、CM2、M3，另設(shè)置Mg2+濃度為2 mmol L-1但不加CdCl2 記為CK，共5 組，見表1，每組3 次重復(fù)，共15 箱。當(dāng)Mg2+濃度大于2 mmol L-1時(shí)，用MgCl2來增加Mg2+的供應(yīng)，為防止鹽分積累，每3 d 更換1 次營(yíng)養(yǎng)液。為探究鎘含量的動(dòng)態(tài)變化，每3 d 進(jìn)行1 次破壞性取樣，將根、莖、葉分離，105℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒重備用，其余各項(xiàng)指標(biāo)在培養(yǎng)12 d 后進(jìn)行測(cè)定：保護(hù)性酶樣品采集后分裝，液氮速凍，80 ℃冰箱保存；根系活力、生長(zhǎng)指標(biāo)及熒光參數(shù)均在取樣當(dāng)天完成。

圖1 培養(yǎng)所用LED 燈的光譜信息Fig.1 Spectral information of LED lamps for culture

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of this experiment

1.3 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

株高、莖粗分別用直尺及游標(biāo)卡尺測(cè)量，葉面積使用葉面積儀YMJ-D（托普云農(nóng)）進(jìn)行測(cè)量，均6 次重復(fù)；每組選取10 株長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，根用蒸餾水沖洗5 min，將根、莖、葉分離，分別測(cè)量其鮮重，后105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干6 h 至恒重，使用精確度為0.000 1的電子天平稱量其干重，備用。

1.4 根系活力的測(cè)定

根系活力采用TTC 還原法測(cè)定，用TTC 還原量表示根系活力[8]。

1.5 鎘含量的測(cè)定

樣品烘干后進(jìn)行研磨，過100 目篩，準(zhǔn)確稱量0.100 0 g 樣品，使用濃HNO3-HCIO4 法進(jìn)行消解后上機(jī)（ICP-OES）檢測(cè)[9]。

1.6 保護(hù)性酶的測(cè)定

破壞性取樣，將每組葉片去掉主葉脈，使用手術(shù)刀將葉片切成正方形小塊，混勻，準(zhǔn)確稱量0.1 g 葉片，液氮速凍，80 ℃冰箱保存，按照試劑盒（蘇州科銘）說明書操作進(jìn)行測(cè)定。

1.7 葉綠素含量的測(cè)定

選取大小一致的葉片，擦拭干凈，使用取樣器取樣后剪成細(xì)絲，混勻并稱取0.2 g，采用分光光度計(jì)法測(cè)定葉綠素含量[10]。

1.8 熒光參數(shù)的測(cè)定

使用超便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒釳INI-PAM（WALZ,Effeltrich，Germany），用葉夾暗適應(yīng)30 min后，PAR設(shè)定為10mol m-2s-1。測(cè)定光系統(tǒng)II (PSII)最大量子產(chǎn)額Fv/Fm=(Fm Fo)/Fm 及相對(duì)電子傳遞速率ETR。利用內(nèi)置自動(dòng)光源測(cè)定熒光誘導(dǎo)曲線，計(jì)算PSII實(shí)際量子產(chǎn)量Y（II）=(Fm' Fs)/Fm'，Y(NPQ)=F/Fm' F/Fm。式中，F(xiàn)m'、Fs 分別為光適應(yīng)過程中的飽和熒光值和實(shí)時(shí)熒光值，F(xiàn)m 和Fo 分別為暗適應(yīng)后最大熒光值和最小熒光值[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提高供鎂水平對(duì)鎘脅迫下西洋參幼苗生長(zhǎng)的影響

圖2 提高供鎂水平對(duì)鎘脅迫下西洋參幼苗生長(zhǎng)的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）。Fig.2 Effect of increased magnesium level on the growth of Ginseng seedlings under cadmium stress(mean±SD).

由圖2 可知，鎘脅迫下西洋參幼苗的生長(zhǎng)受到顯著抑制，株高、莖粗和葉面積分別較CK降低了10.03%、8.69%和3.86%，鎘脅迫對(duì)株高的抑制最明顯。在此基礎(chǔ)上提高供鎂水平可不同程度地緩解鎘脅迫。其中CM2 組的緩解效應(yīng)較Cd 組佳。其株高和莖粗分別較Cd 增加了9.41%和9.38%，差異顯著，葉面積雖然增加了4.35%，但差異不顯著。

2.2 提高供鎂水平對(duì)鎘脅迫下西洋參幼苗根系活力的影響

由圖3 可知，鎘脅迫下西洋參幼苗根系活力受到顯著抑制，較CK 降低了17.50%。隨著供鎂水平的增加，根系活力逐漸增加，分別較Cd 增加了7.89%、23.12%和23.67%，當(dāng)Mg2+為5 mmol L-1時(shí)增幅最顯著，但與Mg2+為4 mmol L-1時(shí)差異并不顯著。

圖3 提高供鎂水平對(duì)鎘脅迫下西洋參幼苗根系活力的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.3 Effect of increased magnesium supply level on root activity of Panax quinquefolium seedlings under cadmium stress(mean±SD).

2.3 提高供鎂水平對(duì)鎘脅迫下西洋參幼苗鎘元素積累的影響

由圖4 可知，隨著脅迫天數(shù)的增加，各實(shí)驗(yàn)組各部位的鎘含量呈增加趨勢(shì)；且各實(shí)驗(yàn)組各部位的鎘含量呈現(xiàn)出Cd ＞CM1 ＞CM2 ＞CM3 ＞CK 的趨勢(shì)；同時(shí)出現(xiàn)根中鎘含量＞莖中鎘含量＞葉中鎘含量的現(xiàn)象。

2.4 提高供鎂水平對(duì)鎘脅迫下西洋參幼苗葉片保護(hù)性酶活性的影響

圖5 提高供鎂水平對(duì)鎘脅迫下西洋參幼苗葉片保護(hù)性酶活性的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.5 Effect of increased magnesium supply on the protective enzyme activity of panax quinquefolium seedling leaves under cadmium stress(mean±SD)

由圖5 可知，在鎘脅迫條件下，西洋參葉片保護(hù)性酶CAT、SOD 和POD 活性均顯著降低，較CK 分別降低了26.39%、24.60%和27.64%，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量呈顯著升高的趨勢(shì)，較CK升高了89.45%。隨著供鎂水平的提升，保護(hù)性酶活性有所升高，其中CAT 與POD 在Mg2+濃度為5 mmol L-1時(shí)增幅最顯著，較Cd 增加了35.54%和19.77%，SOD 在Mg2+濃度為4 mmol L-1時(shí)增幅最顯著，較Cd增加了42.00%，膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量在Mg2+濃度為4 mmol L-1時(shí)降幅最顯著，較Cd 降低了38.06%。但實(shí)驗(yàn)組CM2 與CM3 的各保護(hù)性酶活性及膜脂過氧化產(chǎn)物含量差異不顯著。

2.5 提高供鎂水平對(duì)鎘脅迫下西洋參幼苗葉綠素含量的影響

由圖6 可知，鎘脅迫可顯著降低西洋參幼苗葉綠素a 及葉綠素a+b 的含量，分別較CK 降低了12.03%和10.23%；葉綠素b 含量雖然有所降低，但各組之間差異不顯著。隨著供鎂水平的提高，葉綠素a 及葉綠素a+b 的含量也隨之升高，但與Cd 差異不顯著，且CM2、CM3 與CK 差異也不顯著。

圖6 提高供鎂水平對(duì)鎘脅迫下西洋參幼苗葉綠素含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.6 Influence of increased magnesium supply level on chlorophyll content of Panax quinquefolium seedlings under cadmium stress(mean±SD)

2.6 提高供鎂水平對(duì)鎘脅迫下西洋參幼苗熒光參數(shù)的影響

圖7 提高供鎂水平對(duì)鎘脅迫下西洋參幼苗熒光參數(shù)的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.7 Influence of increased magnesium supply level on fluorescence parameters of Panax quaeneas seedlings under cadmium stress(mean±SD)

由圖7 可知，鎘脅迫下Fv/Fm、Y（II）和ETR 參數(shù)顯著降低，分別較CK 降低了21.82%、33.92%和34.82%，Y（NPQ）顯著上升，較CK 升高了38.20%。隨著供鎂水平的提高，F(xiàn)v/Fm、Y（II）和ETR 均呈上升趨勢(shì)，在Mg2+濃度為5 mmol L-1時(shí)增幅最顯著，分別較Cd 升高了18.02%、14.20%和18.42%；隨著供鎂水平的提高Y（NPQ）呈降低趨勢(shì)，在Mg2+濃度為5 mmol L-1時(shí)降幅最顯著，較Cd 降低了23.11%。但實(shí)驗(yàn)組CM2 與CM3 的各參數(shù)差異不顯著。

3 討論

鎂對(duì)植物的逆境生理至關(guān)重要，適當(dāng)增加鎂元素的用量可顯著增強(qiáng)植物抵御外界脅迫的能力，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在水稻[12]、藥用菊花[13]和柑橘[14]上均已證明適當(dāng)?shù)卦黾渔V水平，可顯著提高植株的抗逆能力。在30mol L-1的鎘脅迫條件下，西洋參幼苗體內(nèi)O2-產(chǎn)生速率加快，導(dǎo)致單線態(tài)氧、H2O2 等氧化分子積累，引起膜脂過氧化，細(xì)胞膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)重要的物質(zhì)大量外滲、外界的有毒物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)新陳代謝發(fā)生紊亂，西洋參幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制。本試驗(yàn)中，提高M(jìn)g2+的用量，西洋參幼苗的根系活力會(huì)得到提高。增加適量鎂能維持細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性，可降低質(zhì)膜的透性，減少細(xì)胞內(nèi)的外滲物，為細(xì)胞抵御不良外界環(huán)境提供了良好的生理基礎(chǔ)[15]，有效提高了西洋參幼苗受到鎘脅迫時(shí)的根系活力。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，外源鎂抑制了西洋參幼苗根系中的Cd2+向地上部運(yùn)輸及各部位鎘含量的積累，對(duì)地上部鎘毒害的緩解作用大于根系，這可能是因?yàn)殒V提高了植物螯合態(tài)合成酶的活性，植物螯合態(tài)合成酶在細(xì)胞質(zhì)中聚合形成植物螯合肽（phytochelatin,PC）[16]，PC具有很強(qiáng)的重金屬親和力，與西洋參幼苗從根部中吸收的Cd2+螯合后形成無毒的化合物Cd-S4-complex[17]，這些化合物隨即被轉(zhuǎn)運(yùn)到西洋參幼苗根系細(xì)胞液泡中,并且在其他酶的作用下被排出細(xì)胞外，從而降低了西洋參幼苗細(xì)胞內(nèi)游離的Cd2+濃度，且防止了對(duì)Cd2+敏感酶變性失活[18]。通過圖4 可知隨著供鎂水平的提高，西洋參各部位的鎘含量降低，這可能是因?yàn)镃d2+、Mg2+同為二價(jià)陽離子，提高供鎂水平，即增加了根系周圍的Mg2+的量，這可能與降低了Cd2+通過根系Mg2+通道進(jìn)入植物體內(nèi)的概率有關(guān)。

植物在受到鎘脅迫后，細(xì)胞膜透性增加、合成代謝能力下降、線粒體形態(tài)改變，同時(shí)SOD、POD 和過氧化氫酶（CAT）等保護(hù)性酶的活性降低，清除自由基及過氧化物的能力減弱[19]；同時(shí)，活性氧自由基傷害加重，膜脂過氧化程度增強(qiáng)也會(huì)引起膜脂過氧化產(chǎn)物MDA 含量的增加[20]。本試驗(yàn)中，西洋參幼苗葉片在30mol L-1的鎘脅迫條件下POD、SOD 和CAT 活性顯著升高、MDA 含量顯著降低，表明鎘脅迫導(dǎo)致西洋參幼苗植株的脂質(zhì)過氧化水平增加，對(duì)西洋參植株造成了過氧化傷害。與單獨(dú)鎘脅迫處理相比，增加Mg2+供應(yīng)顯著提高了鎘脅迫下西洋參幼苗葉片中POD、SOD 和CAT 活性，并降低了MDA 含量，這可能是因?yàn)橹参矬w內(nèi)活性氧的清除由某些酶系統(tǒng)及抗氧化物質(zhì)來完成，隨著外源鎂的增加，致葉片中的鎂含量增加，鎂通過提高酶及抗氧化物質(zhì)的活性，達(dá)到提高POD、SOD 和CAT 的活性及降低MDA 含量的效果。

重金屬對(duì)植物生長(zhǎng)和代謝的影響是多方面的，其中對(duì)光合作用的抑制尤為顯著，葉綠素含量的高低直接影響植物光合作用水平[21]。本試驗(yàn)中，西洋參幼苗葉片的光合色素含量在鎘脅迫下顯著下降，隨著鎂的加入得到緩解，與生物量變化規(guī)律相似，這是因?yàn)殒V是構(gòu)成葉綠素分子的中心元素，隨著外源鎂的加入，葉片中的鎂含量增加，進(jìn)而促進(jìn)葉綠素的合成[22]。且葉綠素a 比葉綠素b 對(duì)Cd2+更加敏感，這是因?yàn)镃d2+會(huì)使類胡蘿卜素等捕光色素復(fù)合體受損，破壞葉綠素酶系統(tǒng)，阻礙葉綠素a 的合成，導(dǎo)致光合系統(tǒng)Ⅱ比光合系統(tǒng)Ⅰ更敏感，進(jìn)而表現(xiàn)出葉綠素a 比葉綠素b 變化得更為顯著[23]。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)反應(yīng)光合機(jī)構(gòu)對(duì)光能吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化的能力，對(duì)逆境反應(yīng)十分敏感[24]。在鎘脅迫下，西洋參幼苗的PSII 潛在活性Fv/Fm、Y（II）及相對(duì)電子傳遞速率顯著降低、非光化學(xué)淬滅系數(shù)Y（NPQ）顯著升高，這表明葉片受到了嚴(yán)重的光抑制，造成葉片的量子產(chǎn)量降低、電子傳遞減緩，進(jìn)而降低光合速率[25]，在加入外源鎂后，F(xiàn)v/Fm、Y（II）及相對(duì)電子傳遞速率顯著升高，說明鎂可緩解鎘脅迫對(duì)光合機(jī)構(gòu)的破壞，但當(dāng)Mg2+濃度為5 mmol L-1時(shí)，較4 mmol L-1增幅并不顯著，說明對(duì)于緩解西洋參幼苗鎘毒脅迫，鎂的用量不需要過高；非光化學(xué)淬滅系數(shù)Y（NPQ）顯著降低，這說明植株受到的脅迫有所緩解，但CM3 較CM2 差異不顯著，又進(jìn)一步說明了緩解西洋參幼苗鎘毒脅迫，鎂的用量不可過高。

4 結(jié)論