新生兒窒息后腦損傷外周血S100β、GFAP的變化及臨床意義

陳 俊，嚴 爭，劉 凡

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院兒科，福建 福州 350009)

新生兒窒息是圍產(chǎn)期常見疾病，也是新生兒科收治主要病種之一，新生兒窒息后腦損傷可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥、殘疾，甚至死亡[1-5]。因此，早期預(yù)測新生兒腦損傷顯得尤為重要。近年來，國內(nèi)新生兒腦損傷的診斷和評估仍主要依據(jù)腦電圖、頭顱影像學(xué)檢查(MRI或CT)、顱腦彩色超聲等，但這些手段存在滯后性，重癥、需呼吸機輔助呼吸、生命體征不穩(wěn)定、不宜搬動者無法及時行頭顱MRI或CT檢查，且CT輻射量大、不能床旁檢查；顱腦彩色超聲可床旁檢查，但對矢狀旁區(qū)損傷不敏感；近些年新興起的新生兒振幅整合腦電圖(amplitude integrated electroencephalogram,aEEG)檢查便捷、經(jīng)濟，可床旁長時間監(jiān)測腦功能，但許多基層醫(yī)院尚未配備此類設(shè)備，從而錯過最佳治療時間窗，遺留腦癱或精神發(fā)育遲緩等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[6-7]。新生兒腦損傷受多種因素影響，近年來研究提出的有鈣結(jié)合蛋白S100β、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、血清腦鈉肽、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)等。S100β水平與缺氧缺血性腦病、腦白質(zhì)損傷等具有相關(guān)性，且與窒息程度呈正相關(guān)[8-10]；中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者體液中GFAP水平增高，GFAP水平可作為判斷腦損傷病情的特異性標志物。S100β、GFAP都屬于神經(jīng)特異性蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)以及發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的作用。目前國內(nèi)S100β、GFAP檢測對新生兒腦損傷預(yù)測意義的研究報道尚少。本研究通過檢測不同程度窒息新生兒血清中S100β、GFAP水平的變化，以期為早期預(yù)測腦損傷提供新思路和觀點，減少新生兒腦損傷的不良結(jié)局。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年3—10月于我院出生的新生兒100例。其中，輕度窒息新生兒(輕度窒息組)38例、重度窒息新生兒(重度窒息組)16例、無窒息史及心血管系統(tǒng)疾病的正常新生兒(對照組)46例。輕度窒息組男性20例，女性18例，胎齡(37.5±2.5)周，出生體重(2 806±319)g；剖宮產(chǎn)18例，順產(chǎn)20例；入院日齡0.5～1.5 d；重度窒息組男性8例，女性8例，胎齡(37.6±2.1)周，出生體重(2 799±290)g；剖宮產(chǎn)6例，順產(chǎn)10例；入院日齡0.5～1 d；對照組男性23例，女性23例，胎齡(38.2±1.2)周，出生體重(2 810±291)g；剖宮產(chǎn)31例，順產(chǎn)15例；入院日齡0.5～3 d。3組新生兒性別、胎齡、出生體重、分娩方式、日齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究符合倫理學(xué)標準，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準通過，所有家屬均知情同意并簽署知情同意書。

納入標準：孕母無并發(fā)癥或內(nèi)科疾病，新生兒性別不限。排除標準：先天性畸形、先天性腦發(fā)育異常、顱內(nèi)感染、有嚴重并發(fā)癥等新生兒。

1.2診斷標準 窒息診斷標準及分度參照2016年新生兒窒息診斷的專家共識[11]，①產(chǎn)前有可能導(dǎo)致窒息的高危因素；②1 min或5 min Apgar評分<7分，仍未建立有效自主呼吸；③臍動脈血氣分析pH<7.15；④排除其他引起低阿氏評分的病因。②～④為必要條件，①為參考指標。根據(jù)“雙軌制”窒息分度標準：①輕度窒息，1 min或5 min阿氏評分<7分，臍動脈血氣分析pH<7.2；②重度窒息，1 min或5 min阿氏評分<5分，臍動脈血氣分析pH<7.0。

新生兒腦損傷，主要包括新生兒缺氧缺血性腦病、早產(chǎn)兒腦損傷(腦室周圍-腦室內(nèi)出血、腦室周圍白質(zhì)軟化)。參照2015年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會新生兒學(xué)組制定的新生兒缺氧缺血性腦病診斷標準、2012年中國醫(yī)師協(xié)會新生兒專業(yè)委員會早產(chǎn)兒腦損傷診斷與防治專家共識，①有可引起腦損傷的高危因素；②神經(jīng)系統(tǒng)異常臨床表現(xiàn)；③影像學(xué)檢查；④腦功能監(jiān)測；⑤除外其他原因引起的腦損害。54例窒息新生兒中18例出生后出現(xiàn)易激惹、肌張力高、抖動、昏迷、抽搐等表現(xiàn)，生后3～5 d行頭顱MRI、頭顱CT或顱腦彩色超聲檢查,其中發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)出血和(或)新生兒缺氧缺血性腦病18例(輕度窒息10例,重度窒息8例)。分為腦損傷組18例、非腦損傷組36例。

1.3指標標測 所有新生兒在出生后4 h內(nèi)取外周靜脈血2～3 mL，采血時避免溶血。采用雙抗二步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測S100β和GFAP水平。往包被微孔中依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，用TMB顯色，TMB在過氧化物酶及酸的作用下先后轉(zhuǎn)化為藍色、黃色。用酶標儀在450 nm波長測定吸光度，計算樣品水平。試劑盒均由福建省艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心提供。所有操作均由同一人嚴格按照試劑盒步驟執(zhí)行。

窒息新生兒3 d后進行20項行為神經(jīng)測查方法(neonatal behavioral neurological assessment,NBNA)，分為行為能力(6項)、被動肌張力(4項)、主動肌張力(4項)、原始反射(3項)、一般估價(3項)5個部分。每項評分分3個分度：0分、1分、2分，滿分40分，35分以下為異常。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman法，影響因素確定采用二元Logistic回歸分析，采用ROC曲線分析S100β、GFAP對評估新生兒腦損傷的診斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組新生兒血清S100β、GFAP檢測比較 輕度窒息組、重度窒息組S100β水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；輕度窒息組與重度窒息組S100β水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，3組GFAP水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組S100β、GFAP水平比較Table 1 Comparison of S100β and GFAP contents among three groups

2.2腦損傷組和非腦損傷組S100β、GFAP水平及NBNA評分比較 腦損傷組S100β水平明顯高于非腦損傷組，NBNA評分低于非腦損傷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；腦損傷組與非腦損傷組GFAP水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 腦損傷組與非腦損傷組S100β、GFAP水平及NBNA評分比較Table 2 Comparison of S100β, GFAP and NBNA score between the brain injury group and the non-brain injury group in asphyxia newborn

2.3S100β、GFAP與NBNA評分相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，S100β水平與NBNA評分呈負相關(guān)(rs=-0.306,P<0.05)，GFAP水平與NBNA評分無相關(guān)(rs=0.032,P>0.05)。

2.4Logistic回歸分析 以顱腦損傷(否=0，是=1)為因變量，以S100β(連續(xù)型變量)、GFAP(連續(xù)型變量)為自變量，進行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，S100β是新生兒腦損傷的影響因素(P<0.05)。見表3。

2.5S100β、GFAP對評估腦損傷的價值分析 繪制ROC曲線(圖1)，S100β評估腦損傷的AUC=0.755(95%CI：0.603～0.907)，根據(jù)約登指數(shù)0.556，找出陽性臨界值為1.595 μg/L，其診斷敏感度為77.8%，特異度為77.8%。GFAP的ROC曲線的AUC=0.488(95%CI：0.315～0.660)，根據(jù)約登指數(shù)0.139，找出陽性臨界值為3.120 μg/L，其診斷敏感度為16.7%，特異度為97.2%。見表4。

表3 S100β、GFAP對腦損傷影響的二元Logistic回歸分析Table 3 Binary Logistic regression analysis of effects of S100β and GFAP on brain injury

表4 S100β、GFAP水平對評估腦損傷的價值分析Table 4 Value analysis of S100β and GFAP Levels in evaluation of brain injury

圖1 腦損傷窒息新生兒S100β、GFAP檢測的ROC曲線分析

3 討 論

新生兒腦損傷臨床多隱匿或不典型，表現(xiàn)為易激惹、抖動、嗜睡、肌張力增高或低下、抽搐等，嚴重者可遺留腦癱、運動姿勢發(fā)育異常、智力低下、認知障礙、癲癇、視聽感官障礙等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。因新生兒腦損傷早期缺乏典型的臨床表征，且相關(guān)輔助檢查，如顱腦MRI/CT/彩色超聲、腦電圖等存在檢查滯后性，且相當(dāng)一部分基層醫(yī)院配備不完善，故對臨床醫(yī)生來說，疾病早期檢測腦損傷標記物有利于腦損傷的判斷。

近年來，S100β在圍產(chǎn)兒腦損傷中的應(yīng)用和研究得到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。S100是從牛腦組織中分離出來的一種亞細胞組分，是能與鈣相結(jié)合的蛋白[12]。S100β蛋白是其主要成分之一，主要集中于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細胞(astrocytes,AS)、垂體前葉細胞[13]，并在非神經(jīng)細胞中少量表達。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，在許多體液(如腦脊液、血液、尿液、羊水)中均可測得。雖然腦外組織中存在S100β，但血液S100β主要還是來自于血腦脊液屏障破壞后腦脊液S100β的外滲[14-15]。Winter等[16]提出，S100β穿透性較強，新生兒血腦屏障薄弱。腦損傷發(fā)生時，AS細胞的細胞膜被破壞，釋放S100β進入腦脊液，經(jīng)血腦屏障進入血液，血清S100β水平快速升高[17]。研究表明，腦損傷可引起腦脊液和血清S100β水平顯著升高[18-19]。因S100β蛋白在多種體液中可測得，采集標本方便，對腦損傷診斷的敏感度及特異度均較高，故具有早期診斷價值。

本研究結(jié)果顯示，輕度窒息組和重度窒息組S100β水平高于對照組；腦損傷組S100β水平高于非腦損傷組；Spearman相關(guān)分析顯示，S100β水平與NBNA評分呈負相關(guān)；回歸分析顯示，S100β是新生兒腦損傷的影響因素，S100β高一個單位患兒出現(xiàn)腦損傷的可能性高14.43倍；S100β預(yù)測腦損傷的陽性臨界值為1.595 μg/L，敏感度為77.8%，特異度為77.8%。受窒息缺氧、缺血的影響，AS發(fā)生異常變化，S100β水平迅速升高，本研究標本均來源于出生4 h內(nèi)外周血，提示在腦損傷早期4 h內(nèi)，血清S100β變化就可被檢測出來，其單獨檢測具有很高的準確度、敏感度及特異度。本研究結(jié)果顯示，輕度窒息組與重度窒息組S100β差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮與S100β半衰期短(2 h左右)及輕微腦損傷者病情不再進展有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，腦損傷組NBNA評分較低，非腦損傷組NBNA評分較高。Spearman相關(guān)分析顯示，S100β水平與NBNA評分呈負相關(guān)，S100β水平越高，NBNA評分越低。若患兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴重，可嚴重影響日后生活質(zhì)量，故外周血S100β早期檢測對新生兒腦損傷的判斷和防治具有十分重要的臨床意義。

GFAP是AS細胞骨架蛋白的特有成分，是其特征性標記物[20]。AS細胞死亡后，透過血腦屏障進入血液，與神經(jīng)系統(tǒng)損傷及修復(fù)有關(guān)[21]。潘奇峰[22]研究發(fā)現(xiàn)，新生兒缺氧缺血性腦病、腦室周圍白質(zhì)軟化疾病與AS細胞數(shù)量增多有密切關(guān)系。在缺氧缺血條件下，AS細胞從靜息態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)，通過神經(jīng)生長因子、5-羥色胺受體等調(diào)控后分泌GFAP入血，使血中AS細胞增多，以穩(wěn)定缺血組織形態(tài)的完整。中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷或炎癥后，GFAP 表達增加，其體液濃度是評估AS細胞增多癥、AS細胞激活的重要手段，可間接反映腦損傷的程度，神經(jīng)損傷越嚴重，濃度越高[23]。本研究結(jié)果顯示，對照組、輕度窒息組、重度窒息組GFAP差異無統(tǒng)計學(xué)意義；GFAP與NBNA無相關(guān)性；GFAP預(yù)測腦損傷的敏感度為16.7%，特異度為97.2%。高玉松等[20]研究表明，顱腦損傷后1 h血清GFAP升高，20 h到達峰值，隨著受損AS細胞數(shù)量衰亡、釋放GFAP逐漸減少，釋放入血的GFAP逐漸減少，若顱腦損傷12～24 h內(nèi)檢測GFAP正常者可排除腦損傷。張麗勇等[24]研究大鼠原發(fā)性腦干損傷模型，結(jié)果表明，腦干損傷30 min后，GFAP開始增加，損傷后48 h達到峰值并開始降低，GFAP表達具有明顯規(guī)律性。本研究GFAP的檢測結(jié)果表示敏感度低，但特異性高，單獨檢測預(yù)測腦損傷準確性不高，考慮以下幾點：①本研究標本于出生后4 h內(nèi)采集，窒息缺氧、缺血早期，AS細胞尚未凋亡，分泌GFAP不足，采集標本時外周血中GFAP尚未達峰值，陽性檢出率低，提示此類窒息缺氧的新生兒，可考慮出生后12～24 h，一般不超過2 d，再采集GFAP檢測，本研究結(jié)果對于臨床醫(yī)生關(guān)于采集時間的選擇具有一定臨床意義；②中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時，GFAP從損傷的AS細胞中溢出，經(jīng)過細胞間隙，透過血腦屏障進入血液，從而外周血GFAP水平升高，外周血GFAP的檢出時間相對于腦脊液來說，前者滯后于后者，提示臨床醫(yī)生，在窒息缺氧早期，若能采集腦脊液進行GFAP檢測，可能會提高敏感度；③通過ROC曲線分析，GAFP檢測敏感度低，陽性檢出率低，但其特異度高，若能檢測到濃度升高，有一定臨床意義；④樣本量少，仍需在日后此類研究中擴展樣本量，進一步增加數(shù)據(jù)準確度。

綜上所述, 血清S100β是一種高敏感度、高特異度、高準確度的腦損傷生化標志物，有助于新生兒窒息的診斷和判斷新生兒窒息后的腦部進展和結(jié)局,為預(yù)測新生兒腦損傷提供了客觀依據(jù)。GFAP在生后4 h內(nèi)檢測準確性低，但對腦損傷的特異度高，不建議太早檢測。S100β、GFAP均為腦損傷血清學(xué)標志物，在采集時間上，臨床醫(yī)生要考慮其動態(tài)變化規(guī)律，選擇適宜的采集時間，以提高診斷的準確性，為早期預(yù)測新生兒腦細胞代謝異常提供客觀依據(jù)。但由于本研究的時間及樣本量有限，可能與實際有一定的偏差，且未能跟蹤隨訪進一步研究。因此有待更大樣本量及長期隨訪研究來證實。