川芎嗪對(duì)支氣管上皮細(xì)胞ORMDL3表達(dá)影響

[摘要]目的 探討川芎嗪對(duì)哮喘易感基因血清類黏蛋白1樣蛋白3（ORMDL3）表達(dá)的影響。方法 應(yīng)用IL-4+IL-13刺激人支氣管上皮（HBE）細(xì)胞ORMDL3過表達(dá)，以不同濃度的川芎嗪（200、300、400、500、600、700、800 μg/L）干預(yù)72 h，選取干預(yù)作用最明顯的川芎嗪濃度。以IL-4+IL-13培養(yǎng)的HBE細(xì)胞作為模型組，以干預(yù)作用最明顯的川芎嗪濃度干預(yù)IL-4+IL-13培養(yǎng)HBE細(xì)胞作為治療組，PBS培養(yǎng)HBE細(xì)胞作為空白組。應(yīng)用RT-PCR方法分別檢測(cè)3組ORMDL3 mRNA表達(dá)，Western blot方法、免疫組化法檢測(cè)ORMDL3蛋白表達(dá)。結(jié)果 400 μg/L濃度的川芎嗪干預(yù)作用最明顯。治療組、空白組、模型組ORMDL3 mRNA表達(dá)比較差異有顯著性（F=176.45，Plt;0.01），治療組表達(dá)最低。模型組、治療組ORMDL3蛋白表達(dá)較空白組升高，治療組較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.48、91.56，Plt;0.01）。結(jié)論 川芎嗪可通過下調(diào)HBE細(xì)胞ORMDL3基因表達(dá)，改善哮喘病人氣道重塑。

[關(guān)鍵詞]哮喘;血清類黏蛋白;川芎嗪

[中圖分類號(hào)]R287.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]2096-5532（2021）02-0276-04

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of ligustrazine on the expression of the asthma susceptibility gene orosomucoid 1-like protein 3 （ORMDL3） in serum. "Methods Human bronchial epithelial cells （HBECs） were stimulated by interleukin-4 （IL-4） and interleukin-13 （IL-13） to induce the overexpression of ORMDL3， and ligustrazine at different concentrations （200， 300， 400， 500， 600， 700， and 800 μg/L） was used for intervention for 72 h to screen out the concentration of ligustrazine with the most significant intervention effect. HBECs cultured with IL-4+IL-13 were selected as model group; HBECs cultured with ligustrazine at the concentration with the most significant intervention effect were selected as treatment group; HBECs cultured with phosphate-buffered saline were selected as blank group. RT-PCR was used to measure the mRNA expression of ORMDL3， and Western blot and immunohistochemistry were used to measure the protein expression of ORMDL3. "Results Ligustrazine at the concentration of 400 μg/L had the most significant intervention effect. There was a significant difference in the mRNA expression of ORMDL3 between the treatment group， the blank group， and the model group （F=176.45，Plt;0.01）， and the treatment group had the lowest expression of ORMDL3. The model group and the treatment group had significantly higher protein expression of ORMDL3 than the blank group， and the treatment group had significantly lower expression than the model group （F=23.48，91.56;Plt;0.01）. "Conclusion Ligustrazine can improve airway remodeling in asthmatic patients by downregulating ORMDL3 gene expression in HBECs.

[KEY WORDS]asthma; orosomucoid; tetramethylpyrazine

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病。哮喘慢性氣道炎癥最終導(dǎo)致氣道的持續(xù)性損傷而致氣道結(jié)構(gòu)異常，即氣道重塑。氣道重塑是哮喘的重要病理特征，顯著影響哮喘的預(yù)后。哮喘的發(fā)生發(fā)展與遺傳因素和環(huán)境因素有關(guān)，其中哮喘易感基因發(fā)揮重要作用。血清類黏蛋白1樣蛋白3（ORMDL3）基因是一種哮喘關(guān)聯(lián)基因，與哮喘氣道重塑的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。吸入布地奈德可以減少ORMDL3表達(dá)，并減輕氣道重塑的嚴(yán)重程度，二者有明顯相關(guān)性[2]。然而，長(zhǎng)期大劑量使用糖皮質(zhì)激素會(huì)產(chǎn)生較大副作用，誘發(fā)或加重感染，抑制機(jī)體的免疫功能 [3-4]。川芎嗪為中藥川芎主要有效成分，是一種應(yīng)用廣泛的中藥活性成分，臨床用于治療冠狀動(dòng)脈疾病、缺血性腦血管疾病以及腫瘤等[5]。有研究表明，川芎嗪具有多種生物活性，如抗氧化活性、對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞損傷等[6]，川芎嗪還能抑制成纖維細(xì)胞合成膠原纖維[7]。還有研究顯示，川芎嗪有影響哮喘病人氣道重塑的能力[8]。然而其作用機(jī)制尚未闡明。本研究旨在觀察川芎嗪對(duì)ORMDL3表達(dá)影響，為早期防治哮喘氣道重塑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人支氣管上皮（HBE）細(xì)胞（上海博古生物科技有限公司，CBNumber：CB35771380）;南美胎牛血清（FBS，維森特生物技術(shù)有限公司）;Trizol （上海普飛公司）;四甲基吡嗪（美國(guó)Sigma公司）;Primer、二甲基亞砜（DMSO）、MTT（上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司）;RNase Inhibitor （Promega公司）;SYBR Master Mixture（TAKARA）;oligo dT （生工生物工程（上海）有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HBE細(xì)胞加入RPMI-1640培養(yǎng)液（含體積分?jǐn)?shù)0.10的FBS，10 000 kU/L青霉素、10 g/L鏈霉素）中，置于培養(yǎng)箱（37 ℃，含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2）中培養(yǎng)，隔天換液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%表面面積時(shí)傳代。

1.2.2 藥物作用時(shí)間選擇 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HBE細(xì)胞接種于 96 孔板，每孔加入 1×104 個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用含有體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。另設(shè)空白組、對(duì)照組（加入相應(yīng)體積的PBS）。每組設(shè) 6個(gè)平行復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入MTT溶液，培養(yǎng)箱孵育4 h。離心去上清后加入DMSO溶液，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm 波長(zhǎng)處吸光度（A）值。計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活細(xì)胞率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。

1.2.3 川芎嗪濃度選擇及實(shí)驗(yàn)分組 以100 μg/L的IL-4+IL-13培養(yǎng)的HBE細(xì)胞為模型組，分別加入不同濃度的川芎嗪（200、300、400、500、600、700、800 μg/L）作用72 h，觀察川芎嗪對(duì)IL-4+IL-13誘導(dǎo)HBE細(xì)胞ORMDL3 mRNA干預(yù)作用。以作用最明顯的川芎嗪濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度，將實(shí)驗(yàn)濃度的川芎嗪加入100 μg/L IL-4+IL-13培養(yǎng)HBE細(xì)胞作為治療組，以100 μg/L IL-4+IL-13培養(yǎng)HBE細(xì)胞為模型組，以PBS培養(yǎng)HBE細(xì)胞作為空白組。3組培養(yǎng)時(shí)間均為72 h。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 RT-PCR方法檢測(cè)ORMDL3 mRNA表達(dá)

取各組培養(yǎng)后的HBE細(xì)胞，采用Trizol法提取mRNA，按照RT-PCR試劑盒說明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用RT-PCR方法檢測(cè)ORMDL3 mRNA表達(dá)。所用引物及其序列見表1。反應(yīng)體系20 μL，內(nèi)含：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μL，上下游引物共5 μL，SYBR Green 10 μL。以GAPDH為內(nèi)參照。反應(yīng)條件為：95 ℃，預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán);95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán);95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，95 ℃、5～10 min，1個(gè)循環(huán)。

1.3.2 Western blot方法檢測(cè)ORMDL3蛋白表達(dá)

取培養(yǎng)后的各組細(xì)胞，加入200 μg/L的RIPA裂解液，在冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min。取上清液，行SDS-PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入50 g/L脫脂奶粉，室溫封閉2 h。加入兔抗人ORMDL3抗體（1∶200稀釋），4 ℃冰箱過夜，室溫下TBST洗膜3次，加入1∶5 000稀釋的羊抗兔二抗，常溫孵育2 h;TBST室溫下洗膜3次，光化學(xué)法顯影，用Image J軟件掃描各條帶灰度值，以β-action（1∶200稀釋）為內(nèi)參照，以各條帶灰度值/內(nèi)參照灰度值表示ORMDL3蛋白表達(dá)。

1.3.3 免疫組化檢測(cè)ORMDL3蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，制作細(xì)胞爬片。血清封閉，PBS漂洗，向切片上分別滴加ORMDL3抗體（Abcam107639，1∶200稀釋）孵育過夜，PBS漂洗，二抗孵育，DAB顯色。光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞棕色著色為ORMDL3蛋白陽性表達(dá)。應(yīng)用Image J軟件計(jì)算ORMDL3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料結(jié)果用x2±s表示。數(shù)據(jù)間比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊則進(jìn)行方差分析， 若方差不齊則進(jìn)行Welch’s分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞存活率及不同藥物濃度組ORMDL3 mRNA表達(dá)比較

培養(yǎng)24、48、72 h細(xì)胞存活率分別為（90.13±1.96）%、（94.51±1.91）%、（97.22±1.91）%，各時(shí)間比較差異有顯著性（n=6，F(xiàn)=20.60，Plt;0.05），培養(yǎng)72 h細(xì)胞存活率最高。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以72 h為藥物培養(yǎng)時(shí)間。200、300、400、500、600、700、800 μg/L濃度的川芎嗪作用HBE細(xì)胞72 h，其ORMDL3 mRNA表達(dá)分別為2.472±0.178、0.763±0.058、0.823±0.142、0.994±0.059、0.978±0.038、1.084±0.079、0.947±0.036，各組比較差異有顯著性（n=6，F(xiàn)=5.34，Plt;0.05）。400 μg/L川芎嗪對(duì)IL-4+IL-13誘導(dǎo)HBE細(xì)胞血清ORMDL3 mRNA表達(dá)的干預(yù)作用最明顯。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以400 μg/L為川芎嗪藥物濃度。

2.2 各組ORMDL3 mRNA表達(dá)比較

空白組、模型組、治療組ORMDL3 mRNA表達(dá)分別為0.947±0.036、1.000±0.0371、0.763±0.058，各組ORMDL3 mRNA比較差異有顯著性（n=6，F(xiàn)=176.45，Plt;0.01）。

2.3 各組ORMDL3蛋白表達(dá)比較

Western blot及免疫組化檢測(cè)結(jié)果均顯示，模型組、治療組ORMDL3蛋白表達(dá)較空白組升高，治療組較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.48、91.56，Plt;0.01）。見表2和圖1、2。

3 討 論

哮喘病因?yàn)樘怠⑻?、瘀，痰瘀互結(jié)是哮喘發(fā)作期的主要病機(jī)，治療應(yīng)以治痰活血并重?！蹲x醫(yī)隨筆》云：“痰為血類，停痰與瘀血同治?！碧迫荽ā堆C論》說：“須知痰水之壅，由瘀血使然，但去瘀血?jiǎng)t痰水自消。”哮喘的病機(jī)是“內(nèi)有壅塞之氣，外有非時(shí)之感，膈有膠固之痰。”臨床研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于哮喘發(fā)作期及緩解期的寒哮、熱哮證，川芎都有顯著的療效[9]。哮喘病兒久病正氣不足，伏痰內(nèi)生，氣虛血瘀，故痰瘀互結(jié)是哮喘的主要病因病機(jī)。血瘀證貫穿于哮喘的始終。《本草綱目》有云：“川芎者，血中之氣藥?！贝ㄜ盒翜叵阍?，走而不守，既能行散，上達(dá)巔頂;又入血分，下行可達(dá)血海，為血中之氣藥，能通達(dá)氣血，活血祛瘀之功效顯著。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，哮喘屬于多基因遺傳病，由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用而形成。ORMDL3基因位于17號(hào)染色體上，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，編碼1個(gè)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜蛋白，可以通過調(diào)節(jié)Ca2+濃度導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)，為哮喘炎性反應(yīng)發(fā)生的內(nèi)源性誘因[10]。哮喘的一個(gè)重要的病理特點(diǎn)是氣道重塑。氣道重塑可發(fā)生于成人及兒童哮喘病人，而ORMDL3基因高表達(dá)的兒童哮喘可能會(huì)加速早期氣道重塑的進(jìn)程[11]。既往研究已顯示，ORMDL3過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型可出現(xiàn)氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應(yīng)性和IgE水平升高[12]。

川芎嗪是川芎生物堿的主要成分之一，在我國(guó)被用于改善血液循環(huán)及緩解疼痛至少有2 000年的歷史。川芎嗪（化學(xué)名稱四甲基吡嗪）是自中藥川芎分離提純出來的一種酰胺生物堿，是一種鈣離子拮抗劑，可影響器官血液流變學(xué)參數(shù)，有擴(kuò)張血管、減輕炎癥、抗脂質(zhì)過氧化、抑制鈣超載、減輕纖維化、抑制血小板聚集等作用。另外，川芎嗪還有降低氣道高反應(yīng)、改善氣道炎癥、調(diào)節(jié)免疫等作用[13-14]。

研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪對(duì)過敏性炎癥反應(yīng)和氣道重塑具有抑制作用[16-17]。哮喘發(fā)病的主要機(jī)制是慢性氣道炎癥，而持續(xù)的慢性氣道炎癥可以引起氣道重塑。已有研究表明，HBE細(xì)胞在過敏原和細(xì)胞因子（IL-4和IL-13）刺激下可誘導(dǎo)ORMDL3表達(dá)[15];ORMDL3可通過激活ERK1/2/MMP-9信號(hào)通路影響哮喘氣道炎癥和氣道重塑進(jìn)展[16-18]。本研究應(yīng)用IL-4+IL-13誘導(dǎo)HBE細(xì)胞ORMDL3過表達(dá)作為哮喘細(xì)胞模型，探討川芎嗪對(duì)氣道重塑的影響。結(jié)果顯示，IL-4、IL-13可誘導(dǎo)HBE細(xì)胞ORMDL3 mRNA過表達(dá)，400 μg/L濃度川芎嗪作用72 h可顯著降低IL-4+IL-13誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞ORMDL3 mRNA和蛋白表達(dá)，說明川芎嗪可以抑制哮喘氣道炎癥和氣道重塑。其機(jī)制可能為：川芎嗪是一種鈣離子拮抗劑，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)，從而減輕氣道炎癥反應(yīng)，影響氣道重塑進(jìn)程。其具體機(jī)制需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，川芎嗪可能通過阻斷IL-4+IL-13誘導(dǎo)所致HBE細(xì)胞ORMDL3蛋白過表達(dá)，在一定程度上改善哮喘氣道重塑。本文研究結(jié)果為川芎嗪治療哮喘及其機(jī)制研究提供依據(jù)。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）