不同程度單純性先天性上瞼下垂患者提上瞼肌的病理研究

羅彥竹 黎冬平 周娜 李俊萍 王育紅

1中南大學(xué)愛爾眼科學(xué)院，長沙 410015；2武漢愛爾眼科醫(yī)院漢口醫(yī)院眼科 430021

上瞼下垂指平視前方時，上眼瞼遮蓋角膜上緣的范圍超過2 mm[1]。單純性先天性上瞼下垂(simple congenital ptosis，SCP)是臨床上常見的一種上瞼下垂亞型，不僅影響患者的美觀，還可能導(dǎo)致視覺及心理發(fā)育障礙[2-5]。研究表明，SCP可能有多種發(fā)病機(jī)制，大多數(shù)病例是由于提上瞼肌或動眼神經(jīng)核的發(fā)育不良所致，少數(shù)病例是由于提上瞼肌內(nèi)外角以及上方的節(jié)制韌帶過緊，或是眶隔纖維化，從而限制了提上瞼肌的活動[6-10]。也有研究提出SCP提上瞼肌的病理學(xué)改變應(yīng)歸納為營養(yǎng)不良而非發(fā)育不良[11-12]，故關(guān)于SCP的發(fā)病機(jī)制仍無定論。在進(jìn)行病理學(xué)觀察時，某些提上瞼肌標(biāo)本中可能無法觀察到骨骼肌纖維，反而可以觀察到較多的平滑肌纖維，這類肌纖維在過去往往被認(rèn)為是Müller肌[13]。但Alshehri等[14]觀察到SCP患者的Müller肌呈萎縮性改變，肌肉中的平滑肌數(shù)目明顯少于腱膜性上瞼下垂患者。有研究發(fā)現(xiàn)，正常人的提上瞼肌腱膜中也含有少量獨立的平滑肌纖維，并且免疫組織化學(xué)檢測提示α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)在這些肌纖維中呈陽性表達(dá)[15-16]。以上研究表明將SCP患者提上瞼肌標(biāo)本中的平滑肌纖維完全視為Müller肌的觀點可能并不準(zhǔn)確。鑒于此，本研究擬通過光學(xué)顯微鏡觀察SCP患者提上瞼肌中的骨骼肌纖維，為肌肉病理學(xué)的分類提供更多證據(jù)；并通過平滑肌標(biāo)志性蛋白的免疫組織化學(xué)檢測和肌細(xì)胞的透射電子顯微鏡觀察等方法，對患者提上瞼肌中的平滑肌纖維進(jìn)行定性研究，探討SCP的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1取材及組織來源 收集2018年8月至2019年10月于武漢愛爾眼科醫(yī)院漢口醫(yī)院行提上瞼肌縮短術(shù)的SCP患者68例102眼的提上瞼肌標(biāo)本作為觀察組，其中男48例，女20例；年齡2～36歲，中位數(shù)年齡為7.50歲；單側(cè)上瞼下垂患者34例，雙側(cè)上瞼下垂患者34例。同時選取武漢市紅十字會愛爾眼庫提供的8名正常供體的新鮮提上瞼肌腱膜和肌腹組織作為對照組，其中男5名，女3名；年齡55～70歲，中位數(shù)年齡為63.5歲。參照《上瞼下垂診治專家共識》[1]，上瞼下垂的診斷標(biāo)準(zhǔn)為患者平視前方，抵消額肌力量后，上瞼緣遮蓋角膜上緣的范圍大于2 mm。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)明確診斷為SCP，且擬接受手術(shù)治療的患者；(2)患者依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他類型的先天性上瞼下垂或后天性上瞼下垂患者；(2)重癥肌無力、進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良等全身骨骼肌疾病合并有局部上瞼下垂表現(xiàn)者；(3)既往有眼瞼外傷史、手術(shù)史者；(4)提上瞼肌肌力差，需聯(lián)合筋膜鞘手術(shù)或額肌懸吊術(shù)的患者。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)簽署中國人體器官捐獻(xiàn)志愿登記卡，供者家屬知情同意；(2)死亡時間不超過12 h。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有眼瞼外傷史、手術(shù)史者；(2)患者死亡前即有明確的上瞼下垂表現(xiàn)。參照上眼瞼遮蓋角膜的范圍將所有觀察組標(biāo)本分為遮蓋范圍≤4 mm組35眼、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組30眼和遮蓋范圍>6 mm組37眼，觀察組提上瞼肌標(biāo)本的臨床特征見表1。所有患者均接受提上瞼肌縮短術(shù)，術(shù)中取材時盡可能剔除Müller肌，將靠近肌腹部的提上瞼肌標(biāo)本用于病理學(xué)研究。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，研究方案經(jīng)武漢愛爾眼科醫(yī)院漢口醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(批文號：HKAIER2018IRB-005-01)，所有患者及其法定監(jiān)護(hù)人了解治療方法和取材目的并自愿簽署知情同意書。

表1 各組SCP患者提上瞼肌標(biāo)本臨床特征比較[M(Q1,Q3),mm]Table 1 Comparison of clinical features of levator palpebrae superiors musclespecimens among the three groups in SCP patients [M(Q1,Q3),mm]組別眼數(shù)提上瞼肌肌力上瞼遮蓋范圍手術(shù)縮短量遮蓋范圍≤4 mm組3511.00(10.00,13.00)3.00(2.50,3.00)10.00(8.00,14.00)遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm307.00(5.00,8.00)5.00(4.63,5.88)16.00(15.00,24.00)遮蓋范圍>6 mm組373.50(3.00,4.00)7.00(7.00,8.00)24.00(20.00,26.00)H值73.09074.37063.430P值<0.05<0.05<0.05 注:(Kruskal-Wallis H檢驗) SCP:單純性先天性上瞼下垂 Note:(Kruskal-Wallis H test) SCP:simple congenital ptosis

1.1.2主要試劑及儀器 蘇木精-伊紅染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)試劑盒、鼠抗人α-SMA單克隆抗體(BM0002)(武漢博士德生物工程有限公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(5220-0341)(武漢安諾倫生物科技有限公司)。脫水機(jī)、包埋機(jī)、凍臺、組織攤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；烤箱(天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司)；微波爐(廣東格蘭仕微波爐電器有限公司)；水浴鍋(金壇市江南儀器廠)；脫色搖床(北京六一儀器廠)；渦旋混合器(南京天悅電子科技股份有限公司)；正置光學(xué)顯微鏡、成像系統(tǒng)(日本Nikon公司)；鉆石切片刀(瑞士戴通公司)；透射電子顯微鏡(美國FEI公司)。

1.2 方法

1.2.1提上瞼肌取材及石蠟切片的制作 觀察組所有患者術(shù)前均詳細(xì)詢問病史，行常規(guī)眼部及全身檢查，與上瞼下垂相關(guān)的?？茩z查包括上瞼緣遮蓋角膜上緣的范圍、瞼裂大小、提上瞼肌肌力、額肌肌力、Bell征、新斯的明試驗及咀嚼試驗。所有患者均由同一位經(jīng)驗豐富的手術(shù)醫(yī)師行提上瞼肌縮短術(shù)，術(shù)中截取Whitnall韌帶以上的提上瞼肌組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，若縮短的范圍未達(dá)到Whitnall韌帶，則盡可能靠近肌腹端取材，截取組織長度約5 mm。將術(shù)中留取的提上瞼肌標(biāo)本用手術(shù)貼膜覆蓋，盡量減小牽拉、挫傷與擠壓等機(jī)械損傷，使用彎剪快速截取約1 mm×1 mm×1 mm大小的標(biāo)本，于1 min內(nèi)浸入體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定24 h，以備制作透射電子顯微鏡切片。另一部分放置在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中固定，行常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，備用。

1.2.2Masson三色染色法檢測肌纖維面積 將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ溶液各15 min脫蠟，逐級放入無水乙醇、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、85%乙醇各5 min，自來水清洗。將切片放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%重鉻酸鉀溶液中浸泡過夜，水洗；鐵蘇木素染液(鐵蘇木素A液與B液等體積混合)染色3 min，分化，水洗，返藍(lán)，流水沖洗；麗春紅酸性品紅染色5～10 min，漂洗。將切片放入磷鉬酸水溶液浸染1～3 min，苯胺藍(lán)染液染3～6 min。切片用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%冰醋酸分化，連續(xù)快速浸入2缸無水乙醇洗掉醋酸和部分水，并浸入第3缸無水乙醇中徹底脫水5 min，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。每張Masson染色切片于40倍光學(xué)顯微鏡下任意選取3個視野拍照，采用ImageJ 1.52a圖像分析軟件分別計算圖像中膠原纖維及骨骼肌纖維面積，分別除以組織總面積，將結(jié)果取平均值進(jìn)而得出每個標(biāo)本的膠原纖維面積比及骨骼肌纖維面積比。膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色。骨骼肌纖維呈長柱形，肌細(xì)胞內(nèi)含多個細(xì)胞核，位于肌膜的下方；平滑肌纖維呈長梭形，肌細(xì)胞內(nèi)含單個呈長橢圓形或桿狀的細(xì)胞核，位于細(xì)胞中央。染色結(jié)果由2位病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲讀片，結(jié)果不一致則共同討論決定。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色法測定標(biāo)本中α-SMA表達(dá) 將石蠟切片置于65 ℃烘箱中烘片2 h，常規(guī)脫蠟至水，置于EDTA修復(fù)液中微波修復(fù)；冷卻后磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗15 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%牛血清白蛋白封閉30 min，加入50 μl鼠抗人α-SMA單克隆抗體(1∶ 100)，4 ℃過夜孵育；PBS沖洗，加入50 μl HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(1∶ 100)，常溫孵育50 min;PBS沖洗，加50 μl DAB溶液顯色；顯色完全后水洗，蘇木素復(fù)染，體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇分化，水洗，返藍(lán)，脫水，透明封片。每張免疫組織化學(xué)染色切片于光學(xué)顯微鏡下任意選取3個視野拍照，染色結(jié)果由2位病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲讀片，結(jié)果不一致則共同討論決定。采用ImageJ 1.52a圖像分析軟件計算α-SMA的積分吸光度(integrated absorbance，IA)值。

1.2.4透射電子顯微鏡下觀察標(biāo)本組織的超微結(jié)構(gòu) 采用簡單隨機(jī)抽樣方法選取17個(對照組2個，遮蓋范圍≤4 mm組、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組、遮蓋范圍>6 mm組各5個)提上瞼肌標(biāo)本行透射電子顯微鏡檢查。將所取組織加入0.1 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min；0.1 mol/L PBS(pH 7.4)配置的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定液室溫(20 ℃)固定2 h，0.1 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗。將組織放入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中梯度脫水，每次15 min；丙酮和812包埋劑等體積混合液滲透過夜，純812包埋劑滲透過夜，60 ℃聚合48 h。使用切片機(jī)將組織縱向切為60～80 nm超薄切片，鈾鉛雙染色(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%醋酸鈾飽和水溶液和枸櫞酸鉛各染色15 min)，室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察并采集圖像，由2位病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲讀片，結(jié)果不一致則共同討論決定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用Shapiro-Wilk檢驗分析所有計量資料的正態(tài)性，提上瞼肌肌力、上瞼遮蓋范圍、手術(shù)縮短量、膠原纖維和骨骼肌纖維面積比、α-SMA的IA值均不符合正態(tài)分布，以M(Q1，Q3)表示。遮蓋范圍≤4 mm組、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組、遮蓋范圍>6 mm組和對照組各檢測指標(biāo)總體差異比較采用Kruskal-WallisH檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。組間兩兩比較采用Bonferroni法，調(diào)整檢驗水準(zhǔn)α'=0.05/6=0.008 3。

2 結(jié)果

2.1 各組提上瞼肌標(biāo)本的組織病理學(xué)表現(xiàn)

光學(xué)顯微鏡下觀察可見，對照組標(biāo)本的肌腹部為排列整齊、連接緊密的骨骼肌纖維，肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整且有清晰的橫紋，細(xì)胞核位于周邊，肌細(xì)胞間結(jié)締組織分布均勻且稀疏。觀察組102個標(biāo)本中共有18個標(biāo)本(遮蓋范圍≤4 mm組10個、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組6個、遮蓋范圍>6 mm組2個)檢測到骨骼肌纖維，遮蓋范圍≤4 mm組8個標(biāo)本中僅含有纖維結(jié)締組織而無肌纖維。與對照組相比，觀察組標(biāo)本中肌纖維數(shù)量均明顯減少，細(xì)胞間質(zhì)中膠原纖維及脂肪組織增生，部分骨骼肌細(xì)胞橫紋消失，肌內(nèi)膜不完整(圖1)。遮蓋范圍>6 mm組與遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組骨骼肌纖維病理改變相似。對照組、遮蓋范圍≤4 mm組、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組與遮蓋范圍>6 mm組標(biāo)本的膠原纖維面積比分別為16.03%(14.85%，17.18%)、35.87%(26.75%，45.14%)、25.33%(23.10%，29.53%)和31.37%(25.72%，34.27%)，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=37.488，P<0.05)，其中遮蓋范圍≤4 mm組、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組的膠原纖維面積比明顯高于對照組，遮蓋范圍≤4 mm組標(biāo)本的膠原纖維面積比明顯高于遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組標(biāo)本，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.008 3)。對照組、遮蓋范圍≤4 mm組、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組和遮蓋范圍>6 mm組標(biāo)本的骨骼肌纖維面積比分別為43.74%(40.47%，48.37%)、0.00%(0.00%，11.98%)、0.00%(0.00%，0.00%)和0.00%(0.00%，0.00%)，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=45.336，P<0.05)，其中對照組標(biāo)本的骨骼肌纖維面積比明顯高于遮蓋范圍≤4 mm組、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.008 3)，遮蓋范圍≤4 mm組標(biāo)本骨骼肌纖維面積比高于遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組，但3個組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P≥0.008 3)(圖2)。

圖1 各組提上瞼肌標(biāo)本中骨骼肌纖維的組織病理學(xué)表現(xiàn)(Masson ×40，標(biāo)尺=500 μm) A：對照組標(biāo)本的肌腹部含有豐富的骨骼肌纖維(黑色箭頭) B：遮蓋范圍≤4 mm組標(biāo)本中無肌纖維分布，僅觀察到膠原纖維和血管(黑色箭頭) C：遮蓋范圍≤4 mm組標(biāo)本骨骼肌纖維數(shù)量減少，排列稀疏，部分肌纖維橫紋消失，肌內(nèi)膜不完整(黑色箭頭) D：遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組標(biāo)本中骨骼肌纖維數(shù)量減少，走行紊亂，部分肌纖維橫紋消失、肌內(nèi)膜不完整(黑色箭頭)，細(xì)胞間質(zhì)中膠原纖維及脂肪組織大量增生(★)，部分標(biāo)本中可同時觀察到梭狀的平滑肌纖維(黃色箭頭)Figure 1 Histopathological manifestations of skeletal muscle fibers in levator palpebrae superiors muscle specimens of each group(Masson ×40,bar=500 μm) A:The muscle belly of specimens in the control group was rich in skeletal muscle fibers (black arrow) B:No muscle fiber was found in specimens of coverage ≤4 mm group,only collagen fibers and blood vessels (black arrows) were observed C:In specimens of coverage ≤4 mm group,the skeletal muscle fibers in the specimens were reduced and sparsely arranged;the striation of some muscle fibers disappeared;the endomysium (black arrow) was incomplete D:In specimens of coverage >4 mm to ≤6 mm group,the skeletal muscle fibers were reduced and disordered;the striation of some muscle fiber disappeared,and the endomysium (black arrow) was incomplete;collagen fibers and adipose tissue (★) in the intercellular substance were proliferated;spindle-shaped smooth muscle fibers (yellow arrow) were found in some specimens

圖2 各組提上瞼肌中膠原纖維面積比及骨骼肌纖維面積比的比較 與對照組比較，aP<0.008 3；與遮蓋范圍≤4 mm組比較，bP<0.008 3(Kruskal-Wallis H檢驗，Bonferroni校正法，n=6) A：各組膠原纖維面積比 B：各組骨骼肌纖維面積比 1：對照組；2：遮蓋范圍≤4 mm組；3：遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組；4：遮蓋范圍>6 mm組Figure 2 Comparison of collagen fiber area ratio and skeletal muscle fiber area ratio in levator palpebrae superiors muscle specimens among various groups Compared with the control group,aP<0.008 3;compared with the coverage ≤4 mm group,bP<0.008 3 (Kruskal-Wallis H test,Bonferroni correction, n=6) A：Collagen fiber area ratio among various groups B:Skeletal muscle fiber area ratio among various groups 1:Control group;2:Coverage ≤4 mm group;3:Coverage >4 mm to ≤6 mm group;4:Coverage >6 mm group

對照組提上瞼肌腱膜標(biāo)本中主要為纖維結(jié)締組織，含有少量稀疏分布的平滑肌纖維，肌纖維呈梭狀，無橫紋結(jié)構(gòu)，單個細(xì)胞核位于中央。觀察組標(biāo)本中共有78個標(biāo)本(遮蓋范圍≤4 mm組17個、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組26個、遮蓋范圍>6 mm組35個)檢測到平滑肌纖維，遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組有2個標(biāo)本同時觀察到骨骼肌和平滑肌纖維。觀察組標(biāo)本平滑肌纖維數(shù)量多于對照組，排列較紊亂，著色程度深淺不一，細(xì)胞間質(zhì)可觀察到膠原纖維和脂肪組織增生，3個組標(biāo)本的平滑肌纖維數(shù)量、膠原纖維和脂肪組織的增生程度存在差異(圖3)。

圖3 各組提上瞼肌中平滑肌纖維組織病理學(xué)表現(xiàn)(Masson ×40，標(biāo)尺=500 μm) A：對照組的提上瞼肌腱膜含有豐富的膠原纖維(★)和少量平滑肌纖維(黃色箭頭) B：遮蓋范圍≤4 mm組標(biāo)本中觀察到稀疏分布的平滑肌纖維(黃色箭頭)和血管(黑色箭頭) C：遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組標(biāo)本中觀察到較多的平滑肌纖維(黃色箭頭)，細(xì)胞間質(zhì)中可見較多的膠原纖維和脂肪組織增生(★) D：遮蓋范圍>6 mm組標(biāo)本中觀察到大量平滑肌纖維(黃色箭頭)，細(xì)胞間質(zhì)中可見大量膠原纖維和脂肪組織增生(★)Figure 3 Histopathological manifestations of smooth muscle fibers in levator palpebrae superiors muscle specimens of each group(Masson ×40,bar=500 μm) A：Levator aponeurosis of the control group contained abundant collagen fibers (★) and a small amount of smooth muscle fibers (yellow arrows) B：Sparsely distributed smooth muscle fibers (yellow arrows) and blood vessels (black arrows) were found in specimens of the coverage ≤4 mm group C:More smooth muscle fibers (yellow arrows),collagen fibers and adipose tissue hyperplasia (★) were found in specimens of the coverage >4 mm to ≤6 mm group D:Abundant smooth muscle fibers (yellow arrows),collagen fibers and adipose tissue hyperplasia (★) were found in specimens of the coverage >6 mm group

2.2 各組提上瞼肌標(biāo)本中α-SMA表達(dá)情況比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，α-SMA在提上瞼肌的平滑肌和血管平滑肌中均有陽性表達(dá)，對照組和遮蓋范圍≤4 mm組標(biāo)本中可見少量的α-SMA陽性表達(dá)，遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組和遮蓋范圍>6 mm組標(biāo)本中α-SMA陽性表達(dá)面積明顯多于對照組和遮蓋范圍≤4 mm組(圖4)。各組提上瞼肌標(biāo)本中α-SMA的IA值總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=60.573，P<0.05)。遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組和遮蓋范圍>6 mm組的IA值明顯大于對照組和遮蓋范圍≤4 mm組，遮蓋范圍>6 mm組標(biāo)本的IA值明顯大于遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.008 3)(表2)。

圖4 各組提上瞼肌標(biāo)本中α-SMA的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×40，標(biāo)尺=500 μm) 遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組和遮蓋范圍>6 mm組提上瞼肌的平滑肌纖維(黃色箭頭)和血管平滑肌纖維(黑色箭頭)中α-SMA的陽性表達(dá)面積明顯多于對照組和遮蓋范圍≤4 mm組 A：對照組 B：遮蓋范圍≤4 mm組 C：遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組 D：遮蓋范圍>6 mm組Figure 4 Immunohistochemical staining results of α-SMA in levator palpebrae superiors muscle specimens in each group (×40,bar=500 μm) Positive expression area of α-SMA in smooth muscle fibers (yellow arrow) and vascular smooth muscle fibers (black arrow) in the coverage >4 mm to ≤6 mm group and coverage ≥6 mm group were significantly larger than that in the control group and coverage ≤4 mm group A:Control group B:Coverage ≤4 mm group C:Coverage >4 mm to ≤6 mm group D:Coverage >6 mm group

表2 各組患者提上瞼肌標(biāo)本中α-SMA的IA值比較[M(Q1,Q3)]Table 2 Comparison of the IA value of α-SMA in levatorpalpebrae superiors muscle specimens among the four groups[M(Q1,Q3)]組別眼數(shù)IA值對照組85 543.03(4 867.67,8 312.02)遮蓋范圍≤4 mm組177 195.28(5 935.69,14 058.29)遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組2655 584.18(33 861.88,80 419.32)ab遮蓋范圍>6 mm組35166 507.76(119 121.95,187 890.86)abcH值60.573P值<0.05 注:與對照組比較,aP<0.008 3;與遮蓋范圍≤4 mm組比較,bP<0.008 3;與遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組比較,cP<0.008 3(Kruskal-Wallis H檢驗,Bonferroni校正法) α-SMA:α-平滑肌肌動蛋白;IA:積分吸光度 Note:Compared with the control group,aP<0.008 3;compared with the coverage ≤4 mm group,bP<0.008 3;compared with the coverage >4 mmto ≤6 mm group,cP<0.008 3 (Kruskal-Wallis H test,Bonferroni correction) α-SMA:α-smooth muscle actin;IA:integrated absorbance

2.3 觀察組提上瞼肌標(biāo)本中平滑肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察

透射電子顯微鏡下觀察到10個標(biāo)本(遮蓋范圍≤4 mm組1個、遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組4個、遮蓋范圍>6 mm組5個)中的平滑肌細(xì)胞呈長梭狀，細(xì)胞核較大，位于細(xì)胞中心，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的細(xì)胞器，部分線粒體損傷，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量排列紊亂的肌絲，未見明顯的密斑及密體結(jié)構(gòu)，肌細(xì)胞膜表面可見大量膠原纖維附著，細(xì)胞外基質(zhì)中觀察到異常細(xì)胞外物質(zhì)分布(圖5)。其余7個標(biāo)本未見平滑肌細(xì)胞，僅觀察到膠原纖維。

圖5 SCP患者提上瞼肌標(biāo)本中平滑肌細(xì)胞的透射電子顯微鏡觀察 A：視野內(nèi)為縱切面的平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的細(xì)胞器，細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)著色較深(紅色箭頭)；部分線粒體損傷，線粒體脊壞死、溶解，線粒體內(nèi)可見因溶解形成的空泡(黃色箭頭)(×1 700，標(biāo)尺=4 μm) B：視野內(nèi)為縱切面的平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞膜表面附著有膠原纖維(黃色箭頭)，細(xì)胞間質(zhì)可見大量排列紊亂的膠原纖維(★)(×2 500，標(biāo)尺=2 μm) C：視野內(nèi)為橫切面的平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量排列紊亂的肌絲，可見異常著色物質(zhì)(紅色箭頭)(×2 500，標(biāo)尺=2 μm) D：細(xì)胞外基質(zhì)中可見異常著色物質(zhì)(★)(×1 700，標(biāo)尺=4 μm)Figure 5 Smooth muscle cells in the levator palpebrae superiors muscle specimens of the SCP patients observed by transmission electron microscopy A:The longitudinal section of smooth muscle cells was showed.The cytoplasm contained abundant organelles.The heterochromatin staining (red arrow) in the nucleus was deep;some mitochondria were damaged with necrotic and dissolved mitochondrial ridges,and visible vacuoles (yellow arrows) caused by dissolution (×1 700,bar=4 μm) B：The longitudinal section of smooth muscle cells was presented.Collagen fibers (yellow arrows) were attached to the cell membrane surface.A large number of disordered collagen fibers (★) were found in the intercellular substance (×2 500,bar=2 μm) C：The transverse section of smooth muscle cells was displayed.Abundant and disordered myofilaments,and abnormally stained substances (red arrow) were found in the cytoplasm (×2 500,bar=2 μm) D:Abnormally stained substances (★) was found in the extracellular matrix (×1 700,bar=4 μm)

3 討論

對SCP患者的提上瞼肌標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)觀察是研究其發(fā)病機(jī)制的主要方法。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，觀察組骨骼肌纖維的病理改變?yōu)榧M紋消失、數(shù)量減少及走行紊亂，并伴隨有纖維組織和脂肪組織增生，與既往研究報道一致[1,7-8,10]。由于不同下垂程度患者術(shù)中的提上瞼肌縮短量有較大差異，遮蓋范圍≤4 mm組標(biāo)本僅含有少量的提上瞼肌肌腹部組織，而遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組標(biāo)本中含有的肌肉組織普遍多于遮蓋范圍≤4 mm組，但遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組標(biāo)本的骨骼肌纖維面積比低于遮蓋范圍≤4 mm組，SCP患者提上瞼肌中骨骼肌纖維的減少程度與上瞼下垂的嚴(yán)重程度相關(guān)，與既往研究結(jié)果相符[7-8]。在不同程度SCP患者的提上瞼肌標(biāo)本中，我們觀察到遮蓋范圍≤4 mm組標(biāo)本纖維化程度最高，這可能是因為其標(biāo)本中含有較多的提上瞼肌腱膜組織，而腱膜組織富含膠原纖維。研究表明，提上瞼肌在Whitnall韌帶附近逐漸移行為腱膜組織，在顯微鏡下可以觀察到骨骼肌纖維逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槟z原纖維[15]。本研究中遮蓋范圍≤4 mm組部分標(biāo)本中不含肌纖維而僅含纖維結(jié)締組織，術(shù)中提上瞼肌縮短量普遍小于10 mm，這表明靠近上瞼板的提上瞼肌腱膜組織中不含骨骼肌纖維。此外，在SCP患者3個組標(biāo)本中均未觀察到再生肌纖維、萎縮性肌纖維和炎性細(xì)胞浸潤等骨骼肌營養(yǎng)不良的特征性病理改變。從臨床表現(xiàn)來看，SCP患者的上瞼下垂癥狀大多自出生起即被發(fā)現(xiàn)，并且無明顯的進(jìn)行性加重，這與骨骼肌營養(yǎng)不良的典型臨床表現(xiàn)不符[17]，因此本研究結(jié)果支持SCP的發(fā)病機(jī)制為骨骼肌發(fā)育不全。

本研究的創(chuàng)新點在于觀察到SCP患者的提上瞼肌中含有平滑肌細(xì)胞，這類肌細(xì)胞是位于提上瞼肌肌腹部而非Müller肌中。Müller肌是上眼瞼的平滑肌，其從瞼板上10～14 mm處、提上瞼肌的下側(cè)發(fā)出，與提上瞼肌腱膜共同附著于上瞼板，形成提上瞼肌腱膜-Müller肌復(fù)合體[18]。在提上瞼肌縮短術(shù)中獲得的標(biāo)本可能是該復(fù)合體[13]。因此同時觀察到骨骼肌和平滑肌時，平滑肌常被視為Müller肌，然而，Müller肌位于上瞼板和Whitnall韌帶之間，其與提上瞼肌腱膜連接疏松而與結(jié)膜連接緊密，術(shù)者沿著腱膜后間隙能夠盡可能將其與提上瞼肌分離[19-20]。本研究在取材時發(fā)現(xiàn)，遮蓋范圍≤4 mm組患者術(shù)中提上瞼肌的分離范圍大多位于Whitnall韌帶之下，因此其標(biāo)本可能混有少量Müller肌。但在遮蓋范圍>4 mm患者的手術(shù)中，提上瞼肌分離的位置往往在Whitnall韌帶之上，取材時基本不會截取到Müller肌，因此按照理論來說，遮蓋范圍>4 mm患者標(biāo)本中應(yīng)幾乎不含有平滑肌纖維。但本研究中遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組大部分標(biāo)本中仍可觀察到較多平滑肌纖維，這表明遮蓋范圍>4 mm患者提上瞼肌中含有平滑肌細(xì)胞。Alshehri等[14]研究發(fā)現(xiàn)，SCP患者M(jìn)üller肌中的平滑肌纖維數(shù)量減少，Müller肌呈纖維化改變，其病理特征與本研究遮蓋范圍>4 mm～≤6 mm組及遮蓋范圍>6 mm組標(biāo)本中平滑肌纖維增多的病理特征并不相符，這也進(jìn)一步證實了本研究的觀點。

研究顯示，提上瞼肌中的骨骼肌細(xì)胞是由眶周間充質(zhì)細(xì)胞分化而來，Müller肌中平滑肌細(xì)胞的來源尚存爭議，但有研究推測其也可能來源于眶周間充質(zhì)細(xì)胞，表明二者在組織學(xué)上可能具有同源性[21-23]。在正常人提上瞼肌和Müller肌的連續(xù)組織切片上可以觀察到骨骼肌和平滑肌細(xì)胞在一定區(qū)域內(nèi)互相交織在一起，解剖學(xué)上該區(qū)域大致定位在Whitnall韌帶附近[24]。正常人的這2種肌細(xì)胞為發(fā)育正常的骨骼肌與平滑肌細(xì)胞，而本研究在SCP患者Whitnall韌帶以上的提上瞼肌組織中觀察到的平滑肌細(xì)胞不具有一般平滑肌細(xì)胞所特有的密斑、密體等結(jié)構(gòu)，細(xì)胞質(zhì)中肌絲排列紊亂，部分細(xì)胞器出現(xiàn)損傷，但免疫組織化學(xué)染色顯示α-SMA在該細(xì)胞內(nèi)呈陽性表達(dá)，證明了其為平滑肌源性，因此稱之為異常的平滑肌細(xì)胞。胚胎學(xué)研究表明，提上瞼肌、上直肌和上斜肌均由上中胚層復(fù)合體形成，提上瞼肌在胚胎發(fā)育的第16周與上直肌分離后進(jìn)一步發(fā)育[11,19]。提上瞼肌中骨骼肌細(xì)胞的發(fā)育受肌肉神經(jīng)分布和多種信號通路的調(diào)節(jié)，其在胚胎發(fā)育至分娩后6個月期間對內(nèi)部因素的改變都十分敏感[21]。由于平滑肌的神經(jīng)支配、分化調(diào)節(jié)因子及信號傳導(dǎo)通路均與骨骼肌有較大差異[25-26]，因此本研究認(rèn)為這類異常的平滑肌細(xì)胞可能會直接或間接影響提上瞼肌，尤其是提上瞼肌前部的骨骼肌發(fā)育過程，與骨骼肌纖維數(shù)量減少相關(guān)，這可以解釋為何其他研究在影像學(xué)上觀察到患者提上瞼肌前部的病理改變更加嚴(yán)重[27]。目前尚不清楚是何種因素導(dǎo)致了SCP患者的提上瞼肌中平滑肌細(xì)胞異常，具體的分子病理學(xué)機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明，SCP的發(fā)病機(jī)制可能不僅是提上瞼肌中骨骼肌纖維的病變，還涉及到提上瞼肌中平滑肌纖維的病理改變，這為SCP的基礎(chǔ)研究提供了新的思路。

本研究仍存在一定的局限性。由于目前暫無合適的方法獲取到同年齡段的正常標(biāo)本進(jìn)行病理觀察，本研究中對照組標(biāo)本均來自于遺體捐獻(xiàn)者，人群以50歲以上的中老年人為主，與觀察組年齡不匹配。SCP患者提上瞼肌的病理改變與年齡的相關(guān)性目前尚存爭議[8-9,11]，后續(xù)的研究需選取相同下垂程度的不同年齡段患者，進(jìn)一步探討這些病理改變與年齡的相關(guān)性。盡管本研究中所有手術(shù)均由同一位經(jīng)驗豐富的眼整形科醫(yī)生進(jìn)行，并遵循靠近提上瞼肌肌腹部取材的原則，然而不同下垂程度患者的取材部位仍然存在差異，故在進(jìn)行病理分析時，需將病理標(biāo)本的觀察結(jié)果與其取材部位相結(jié)合，以便更合理地探討SCP的發(fā)病機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

志謝武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院病理科劉蓓、亢銘淇醫(yī)師參與本研究的病理閱片，透射電子顯微鏡的檢查結(jié)果由中國科學(xué)院武漢病毒研究所提供

作者貢獻(xiàn)聲明羅彥竹：采集數(shù)據(jù)，研究實施，參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋，統(tǒng)計分析，論文撰寫；黎冬平、王育紅：醞釀和設(shè)計實驗，分析數(shù)據(jù)，對文章的知識性內(nèi)容作批判性審閱，提供經(jīng)費；周娜、李俊萍：采集數(shù)據(jù)、分析數(shù)據(jù)，修改論文關(guān)鍵性結(jié)果和結(jié)論