同步分離培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞和枯否細(xì)胞的方法研究

陳峰杰

河南護理職業(yè)學(xué)院，河南 安陽 455000

肝星狀細(xì)胞與枯否細(xì)胞作為肝內(nèi)重要的非實質(zhì)性細(xì)胞，也是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，有促進肝纖維化進程的作用?；罨腍SCs是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞和核心環(huán)節(jié)[1]，可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并分泌多種受體，生成大量細(xì)胞外基質(zhì)，促進肝纖維化進程。KCs 可通過分泌的多種細(xì)胞因子，促使HSCs活化，參與肝纖維化過程。由于體內(nèi)環(huán)節(jié)復(fù)雜多變，容易受神經(jīng)、體液等多因素的影響，體外提取培養(yǎng)原代HSCs與KCs就顯得尤為重要?，F(xiàn)實中HSCs僅僅占肝非實質(zhì)細(xì)胞總數(shù)20～30%[2]，KCs僅占25～40%[3]，KCs和HSCs的形態(tài)、密度與其它肝非實質(zhì)細(xì)胞非常接近，一直以來同步提取大鼠原代KCs和HSCs較難。自1982年Knook[4]報道提取肝星狀細(xì)胞方法后，國內(nèi)相繼報道了多種改良的分離與提取方法[5-8]，但多數(shù)報道中的提取方法為單一細(xì)胞的分離培養(yǎng)[9-10]，多數(shù)方法存在分離過程繁瑣，成本高，細(xì)胞得率與純度低等問題。因此，建立簡便經(jīng)濟的大鼠原代HSCs與KCs同步分離培養(yǎng)方法，是研究HSCs活化、肝纖維化發(fā)生機制的前提與基礎(chǔ)性工作。

1 材 料

1.1實驗動物 SD大鼠，清潔級，體重400-450g，購自山西醫(yī)科大學(xué)動物中心，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2主要試劑 鏈酶蛋白酶、a-SMA抗體購自Sigma公司；Ⅳ型膠原酶購自Invitrogen公司；DNA酶購自北京索萊寶公司；Nycodenz購自Axis-Shield Pocoslo公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；RPMI1640購自美國HyClone公司；胎牛血清購自杭州四季青；Desmin抗體、武漢博士德公司的SABC免疫組織細(xì)胞化學(xué)試劑盒。

1.3主要儀器 Milli-Q Biocel超純水系統(tǒng)、Jouan IGO-150 CO2培養(yǎng)箱、生物倒置顯微鏡。

2 方 法

2.1大鼠門靜脈插管，鏈酶蛋白酶及膠原酶液原位灌注 SD大鼠，禁食12h后乙醚吸入麻醉，固定大鼠并用碘伏消毒腹部皮膚，呈“U”型剪開腹部，充分暴露肝臟、肝門靜脈，肝門靜脈插管并牢固固定導(dǎo)管，39℃前灌注液，20mL/min，灌注12-15min，剪開大鼠下腔靜脈，灌注的同時按摩灌注不良處，肝臟變白時游離肝臟。40℃鏈酶蛋白酶，5mL/min，灌注 25min，之后灌注37℃Ⅳ型膠原蛋白酶液，10mL/min，30min。

2.2密度梯度離心，制備混合細(xì)胞懸液 將循環(huán)灌注后的肝臟，移入超凈工作臺，去除表面被膜，加4mL DNA酶液和振蕩液，200-250次/min，37℃搖床恒溫振蕩30min。加入20mLDMEM液，過濾細(xì)胞懸液并收集上清液，10-15℃，1700r /min，離心5min。洗滌3次的細(xì)胞懸液中加入DMEM液，沿管底依次緩慢加入10.387%Nycodenz和18.8%的Nycodenz密度梯度液，10℃，20000r/min，離心25min。離心后可見在同一離心管中，因密度不同，原先的細(xì)胞懸液中出現(xiàn)明顯分層，HSCs與KCs位于細(xì)胞懸液的不同層面。

2.3HSCs與KCs同步分離純化 依據(jù)細(xì)胞分層情況，平頭針依次吸取位于不同層面的HSCs與KCs。DMEM 10-15℃，2000 r/min，5min離心洗滌HSCs三次，20%胎牛血清DMEM懸浮HSCs，用RPMI 1640 10-15℃，2000 r/min，5min離心洗滌KCs三次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640懸浮KCs。

2.4臺盼蘭拒染實驗判定細(xì)胞得率與活率 取10μL細(xì)胞懸液與10μL臺盼蘭充分重復(fù)吹打混勻，取10ul加到計數(shù)板凹槽，鏡下計數(shù)活細(xì)胞，臺盼蘭著色者為死細(xì)胞，未著色者為活細(xì)胞，計算細(xì)胞得率和活率。細(xì)胞懸液標(biāo)本測定2次，取兩次均值。

2.5細(xì)胞培養(yǎng) 剛分離的HSCs與KCs分別按2.5×105/mL、1×106/mL密度接種，每孔加1mL細(xì)胞懸液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6h后吸棄KCs培養(yǎng)基，換成10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液。48h后吸棄HSCs培養(yǎng)基，換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每2-3d更換一次HSCs與KCs的培養(yǎng)液。

2.6細(xì)胞鑒定 使用Desmin及a-SMA抗體免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定原代培養(yǎng)7d的HSCs，SABC法免疫細(xì)胞化學(xué)染色。原代培養(yǎng)48h的KCs印度墨汁吞噬實驗驗證細(xì)胞吞噬能力，免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定KCs內(nèi)溶菌酶表達(dá)情況。

3 結(jié) 果

3.1細(xì)胞形態(tài)觀察 鏡下可見，剛分離的HSCs可呈圓形、橢圓形，胞質(zhì)內(nèi)富含脂滴，折光性強，。24h后多數(shù)的HSCs貼壁。48h后少數(shù)HSCs伸出偽足，呈星形或多邊形。培養(yǎng)5d后的HSCs呈星形，細(xì)胞相互融合成片狀。7d 后HSCs內(nèi)脂滴消失，多數(shù)細(xì)胞呈星形，部分融合呈片狀。培養(yǎng)14d 的HSCs，細(xì)胞完全伸展，呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，胞質(zhì)內(nèi)有細(xì)胞骨架。新分離的KCs呈圓球形，大小均勻一致。4-6h后呈扁圓形，大部分細(xì)胞貼壁，少量伸出突起。24h后的KCs體積增大明顯，外觀呈圓形、三角形或星形。48h后KCs胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，核呈腎形。72h的KCs開始伸出偽足。培養(yǎng)7d的KCs完全伸展，甚至呈梭形。

3.2免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定所得細(xì)胞 a-SMA與Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，可觀察到HSCs的胞漿呈棕黃色(見圖1)。溶菌酶免疫細(xì)胞化學(xué)染色后的KCs呈陽性，胞質(zhì)內(nèi)沉積的棕黃色顆粒清晰可見(見圖2)，表明本實驗成功同步分離培養(yǎng)了HSCs與KCs。靜止期與活化的肝星狀細(xì)胞均表達(dá)Desmin，僅活化的HSCs表達(dá)a-SMA。

3.3墨汁吞噬實驗來鑒定KCs吞噬能力 KCs以RPMI1640培養(yǎng)48h后，用少量印度墨汁加入KCs進行吞噬實驗驗證KCs吞噬能力。鏡下可見，KCs體積增大，胞質(zhì)內(nèi)大量碳素墨汁顆粒圍繞在細(xì)胞核周圍，表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞KCs具有吞噬活性。

4 討 論

本實驗使用酶原位灌注消化和密度梯度離心相結(jié)合的兩步法。通過離體灌流鏈霉蛋白酶去除肝臟實質(zhì)性細(xì)胞即肝細(xì)胞、Ⅳ型膠原酶去除膠原纖維，提高細(xì)胞得率和純度。HSCs與KCs密度有一定交叉，密度梯度離心液的選取和配置尤為關(guān)鍵。經(jīng)過對比，本實驗使用的密度分離介質(zhì)為 Nycodenz，具有性質(zhì)穩(wěn)定，配制簡單、價格適中的優(yōu)勢。10.387%與18.8%Nycodenz密度梯度離心后HSCs與KCs位于細(xì)胞懸液不同層次，細(xì)胞分離界面清晰，通過一次實驗即可同步分離上述兩種原代細(xì)胞。而且提取的原代細(xì)胞與體內(nèi)差異較小，可以很大程度反映細(xì)胞在體狀態(tài)。

本實驗所建立的HSCs和KCs同步分離培養(yǎng)方法，簡便經(jīng)濟，又無需特殊設(shè)備和昂貴試劑，分離培養(yǎng)的原代HSCs與KCs生物學(xué)性狀良好，細(xì)胞得率、活率和純度高，達(dá)到后續(xù)實驗要求。該方法對于研究HSCs、KCs的生物學(xué)行為，KCs分泌細(xì)胞因子對于HSCs的作用及肝纖維化機制的研究奠定了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，值得推廣和廣泛使用。

圖1 培養(yǎng)7天的HSCs desmin免疫細(xì)胞染色(DAB顯色，×400)

圖2 KCs培養(yǎng)48h后溶菌酶免疫細(xì)胞化學(xué)(DAB顯色，×400)