基于網(wǎng)絡藥理學對黃連抗結(jié)直腸癌作用機制的分析＊

王與菲，張海婧，吳練秋

（中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室 北京 100050）

黃連是一味古老的抗菌藥物，主要功能為清熱燥濕、瀉火解毒。近年來黃連素藥效逐漸被挖掘，并已西藥化，其在治療心律失常、降血糖、降血脂、抗血小板聚集[1]及抗腫瘤[2]方面有一定的療效。作為傳統(tǒng)中藥，黃連也因具有治療腹瀉的作用而被廣泛應用于臨床[3-4]，有臨床研究表明，黃連堿對降低結(jié)直腸腺瘤復發(fā)風險安全有效，可作為息肉切除術后化療預防的一種選擇[5]，它具有多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用的藥理學特點[6]。黃連及其有效成分小檗堿和黃連堿等已被證實具有一定的抗結(jié)直腸癌作用[7-10]，通過誘導結(jié)腸癌細胞G0/G1 期細胞周期阻滯而抑制細胞增殖[11]，同時可誘導多種腫瘤細胞凋亡，如結(jié)腸癌細胞[12]、卵巢癌細胞[13]等。

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）約占全世界每年診斷出的所有癌癥和癌癥相關死疾病的10%[14]。它是女性第二常見的癌癥，男性第三常見的癌癥。CRC發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，特別是在經(jīng)濟發(fā)達國家發(fā)病率最高[15]，近年來我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率也逐年升高。結(jié)直腸癌屬于常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其惡性程度高、進展快、長期生存率低[16]?？紤]到該疾病晚期才出現(xiàn)癥狀以及傳統(tǒng)的手術療法使CRC 生存預后較差，因此，早期發(fā)現(xiàn)CRC 并發(fā)現(xiàn)治療CRC 的新藥物、提高結(jié)直腸癌的治療效果，是目前中醫(yī)藥領域的重要研究課題。中醫(yī)藥對于結(jié)直腸癌的認識歷史久遠，在整體觀念和辨證論治思想指導下能夠參與結(jié)直腸癌的全程治療[17]，對于控制病情進展、減輕癌癥放化療不良反應、提高患者生存質(zhì)量等方面具有明顯優(yōu)勢，能夠在整體治療過程中起到至關重要的作用[18-19]，中草藥作為在中國臨床常用的補充和替代療法，能有效減少放療、化療帶來的毒副作用，改善患者免疫功能，減少術后復發(fā)及轉(zhuǎn)移[20]。

網(wǎng)絡藥理學利用網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)分析及生物信息學方法來解釋藥物、靶點、信號通路與疾病之間的復雜關系，為研究中藥復方作用機理及臨床研究提供了新思路[21]。結(jié)直腸癌的病理機制復雜，單一基因突變或信號通路的改變無法全面解釋結(jié)直腸癌的發(fā)生機制?；诰W(wǎng)絡藥理學的“藥物-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡，有助于系統(tǒng)揭示黃連通過多成分、多靶點、多途徑抗結(jié)直腸癌的作用機制，本文將采用網(wǎng)絡藥理學分析方法探討黃連抗結(jié)直腸癌的物質(zhì)基礎和作用機制，希冀為臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃連化合物成分篩選

基于中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[22]和中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺（http://www.tcmip.cn）[23]檢索黃連的主要化學成分。同時通過PubMed 文獻[24]分析，對黃連的活性成分進行補充，并利用PubChem 數(shù)據(jù)庫對檢索得到的化合物成分進行結(jié)構(gòu)驗證，獲取化合物簡化分子線性輸入系統(tǒng)（Simplified Molecular Input Line Entry System，SMILES）結(jié)構(gòu)式。

1.2 黃連抗結(jié)直腸癌化合物靶點預測

將檢索得到的黃連中主要化合物的SMILES 導入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch）[25-26]進行反向分子對接，篩選Probability＞0.5 的可能靶點。同時以“colorectal cancer”為關鍵詞，通 過GeneCards（http://www.genecards.org/）[27]和Open Targets（http://www.targetvalidation.org/）[28]數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)直腸癌相關的疾病靶蛋白。將上述數(shù)據(jù)庫獲取的結(jié)直腸癌相關疾病靶點與SwissTargetPrediction 預測得到的黃連主要化合物潛在作用靶點取交集作為黃連治療結(jié)直腸癌的潛在作用靶點進行機制探討。

1.3 黃連抗結(jié)直腸癌“化合物-靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建及分析

為明確黃連中各活性成分、靶點和疾病之間的關系，將篩選得到的共有靶點與活性化合物對應關系導入Cytoscape 3.8.1 軟件[29]，構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡圖。采用Network Analyzer 工具進行拓撲分析，對黃連抗結(jié)直腸癌的“成分-靶點”網(wǎng)絡的介度（Betweenness centrality，BC）、緊密度（Closeness centrality，CC）以及連接度（Degree）進行研究，遴選關鍵藥效分子和核心靶點。

1.4 黃連抗結(jié)直腸癌靶點蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建及分析

為進一步了解黃連治療結(jié)直腸癌潛在作用靶點的功能和作用機制，將篩選得到的共有靶點導入SRTING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）[30]，物種設定為“Homo sapiens”，對作用靶點進行蛋白互作分析。利用Cytoscape 3.8.1 軟件構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡并采用拓撲學分析各網(wǎng)絡節(jié)點的介度、緊密度以及連接度，遴選黃連治療結(jié)直腸癌的核心蛋白。

1.5 黃連抗結(jié)直腸癌靶點生物功能分析及通路分析

應用R 語言對黃連治療結(jié)直腸癌的靶點進行GO（Gene Ontology）[31-32]分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）[33]信號通路富集分析，探究黃連治療結(jié)直腸癌潛在靶點參與的生物學過程與涉及的信號通路。

2 結(jié)果

2.1 黃連化合物成分篩選及靶點預測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、TCMIP 數(shù)據(jù)庫及PubChem 文獻檢索，得到黃連活性化合物成分62 種。應用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫獲取黃連62 種活性成分對應靶點，對靶點進行查重、剔除無法獲得基因名的蛋白，并與GeneCards 和Open Targets 檢索得到的結(jié)直腸癌疾病相關靶點取交集，最終獲得134 對“化合物-靶點”對應關系，共包含91個靶點。

2.2 黃連治療結(jié)直腸癌“化合物-靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建及分析

將134 個“化合物-靶點”對應關系導入Cytoscape 3.8.1軟件，構(gòu)建黃連活性成分治療結(jié)直腸癌的“成分-靶點”網(wǎng)絡圖（圖1）。綠色代表活性化合物，粉色代表藥物活性成分與疾病相關靶點的共有靶點，134 條連線表示活性成分對共有靶點的作用。

圖1 黃連抗結(jié)直腸癌化學成分-靶點網(wǎng)絡

將“成分-靶點”網(wǎng)絡進行拓撲分析。結(jié)果表明，黃酮醇類類（如槲皮素等）和生物堿類（如小檗堿等）作為關鍵藥效分子可能在黃連治療結(jié)直腸癌過程中發(fā)揮重要作用（表1）。

表1 黃連抗結(jié)直腸癌關鍵藥效分子及拓撲參數(shù)（前10位）

取前10個靶點為核心靶點。結(jié)果顯示，碳酸酐酶（CA12、CA2等）、多巴胺受體2（DRD2）、乙酰膽堿酯酶（ACHE）、溶質(zhì)載體家族6 成員3（SLC6A3）、醛糖還原酶（AKR1B1）等靶點的拓撲參數(shù)較高，可能在黃連治療結(jié)直腸癌的過程中發(fā)揮核心作用（表2）。

2.3 黃連抗結(jié)直腸癌靶點蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建及分析

將共有靶點導入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖（圖2）。拓撲分析結(jié)果顯示，度值較高的靶點包括蛋白激酶B α（AKT1）、表皮生長因子受體（EGFR）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、非受體酪氨酸激酶（SRC）、熱休克蛋白AA1（HSP90AA1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、磷脂酰肌醇-3 激酶調(diào)節(jié)亞基1（PIK3R1）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、血管內(nèi)皮細胞生長因子2（KDR）和微管關聯(lián)蛋白τ（MAPT）（表3）。

表2 黃連抗結(jié)直腸癌關鍵靶點拓撲分析（前10位）

圖2 黃連作用靶點PPI網(wǎng)絡圖

表3 黃連抗結(jié)直腸癌蛋白互作網(wǎng)絡拓撲分析（前10位）

2.4 黃連抗結(jié)直腸癌靶點生物功能分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對黃連化合物作用靶點進行GO 生物過程富集分析，設置閾值P＜0.05。研究相關靶點的生物學過程（Biological Process，BP）、細胞組成（Cellular Component，CC）和 分 子 功 能（Molecular Function，MF），選取P值最小的前10 個條目作圖（圖3）。富集度較高的生物學過程主要涉及細胞對化學壓力的反應、細胞對活性氧的反應、細胞對氧化應激的反應、蛋白激酶B 信號傳導、蛋白質(zhì)自身磷酸化、細胞對藥物的反應。細胞組成中富集度較高的條目主要包括髓鞘、蛋白激酶復合物、轉(zhuǎn)移酶復合物、突觸前膜、管基底等離子體膜、小窩、細胞膜等。同時黃連抗結(jié)直腸癌的作用與碳酸脫水酶的活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、碳氧裂解酶的活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性等分子功能密切相關。

圖3 黃連抗結(jié)直腸癌核心靶點GO功能富集分析

2.5 黃連抗結(jié)直腸癌靶點KEGG通路富集分析

對黃連化合物抗結(jié)直腸癌作用靶點進行KEGG通路富集分析，設置閾值P＜0.05。篩選出前30 條通路（圖4）。排名靠前的主要包括PI3K-AKT信號通路、蛋白聚糖途徑、Ras 信號通路、前列腺癌磷脂酶D 信號通路、Rap1 信號通路、ErbB 信號通路、HIF-1 信號通路、FoxO信號通路、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路、花生四烯酸代謝途徑等。

3 討論

3.1 黃連治療結(jié)直腸癌的有效成分分析

黃連（Coptis chinensis）為毛茛科植物黃連、三角葉黃連或云南黃連的干燥根莖。黃連始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒、抗菌、抗炎等功效。隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，對黃連的藥理研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其對多種癌癥有一定療效[6]。本研究通過對TCMSP和TCMIP數(shù)據(jù)庫及文獻檢索得到黃連活性成分62種。應用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫獲取黃連62 種活性成分對應靶點，并與GeneCards 和Open Target 檢索得到的結(jié)直腸癌疾病相關靶點取交集，最終得到黃連抗結(jié)直腸癌相關靶點91個，提示黃連可能主要通過上述靶點發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的藥理作用。

在獲得黃連有效成分的基礎上，構(gòu)建黃連活性成分-結(jié)直腸癌靶點網(wǎng)絡分析，通過拓撲分析發(fā)現(xiàn)黃酮醇類類（如槲皮素等）和生物堿類（如小檗堿等）作為關鍵藥效分子可能在黃連治療結(jié)直腸癌的過程中發(fā)揮重要作用。文獻報道，黃連活性成分小檗堿能夠抑制拓撲異構(gòu)酶和細胞周期蛋白，活化絲氨酸蛋白酶，誘導細胞色素C釋放，抑制環(huán)氧酶-2活性[34]，對惡性膠質(zhì)瘤C6 細胞的體外增殖具有抑制作用[35]。槲皮素廣泛存在于植物的花、葉和果實中，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗腫瘤、和免疫抑制等藥理學活性[36]。槲皮素還能夠誘導腫瘤細胞凋亡[37]，但對正常細胞無明顯影響[38]。并且槲皮素能夠抗致癌和促癌因子，抑制癌細胞增殖[37,39]。槲皮素還可以通過抗線粒體途徑和激活Caspase 途徑誘導人乳腺癌細胞凋亡，通過EGFR 介導，抑制乳腺腫瘤細胞中MMP9 的分泌而限制腫瘤細胞的侵襲[40]。另有研究表明，槲皮素能夠下調(diào)AKT/mTOR/p70S6K 信號通路，進而抑制腫瘤細胞的生長和血管生成[41]。

圖4 黃連抗結(jié)直腸癌核心靶點KEGG通路分析

3.2 黃連治療結(jié)直腸癌的有效靶標

在獲得共有靶點的基礎上，進行PPI 分析發(fā)現(xiàn)，AKT1、EGFR、PTGS2、SRC、MMP9 等作為關鍵靶點可能在黃連治療結(jié)直腸癌的過程中發(fā)揮重要作用。AKT也被稱為蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB），PI3K 是作用于生長因子信號通路的一種重要調(diào)節(jié)蛋白，刺激酪氨酸激酶生長因子受體可以激活PI3K，進而激活下游AKT。PI3K/AKT 信號通路與腫瘤細胞的生長、增殖、生存、凋亡、代謝以及腫瘤耐藥和腫瘤免疫逃逸密切 相 關[42]。激 活PI3K 可 使 下 游AKT 在Ser473 和Thr308 磷酸化生成p-AKT。有研究表明，結(jié)直腸癌組織中PI3K 和AKT 的表達明顯高于正常組織。p-AKT在結(jié)直腸癌中的表達水平明顯高于腺瘤，且p-AKT 和結(jié)直腸癌的分期、術前血清癌胚抗原的水平明顯相關[43]。另外，在腫瘤細胞中MMP9 能夠破壞細胞膜屏障，導致細胞浸潤、游走能力增強。腫瘤轉(zhuǎn)移主要依靠其血管不斷生成，在腫瘤組織中，高表達的MMP9參與血管的生成，使得腫瘤細胞更加容易轉(zhuǎn)移到周圍正常組織中，引起產(chǎn)生腫瘤的轉(zhuǎn)移[44]。

碳酸酐酶（Carbonic anhydrases，CAs)是鋅金屬酶的一個大家族，它催化二氧化碳的可逆水化，維持pH的穩(wěn)態(tài)[45]。缺氧和細胞外酸中毒是侵襲性實體腫瘤的病理生理特征，細胞內(nèi)pH 的調(diào)節(jié)對于維持腫瘤細胞在該微環(huán)境中的代謝和增殖至關重要[46]。這表明CAs在許多類型的癌癥中有重要作用。有文獻表明，CA1在結(jié)直腸癌中表達降低[47]，核轉(zhuǎn)錄因子IC（Nuclear factor IC，NFIC）是CA1 的上游因子[47]，這意味著NFIC可以通過調(diào)控CA1 的功能在治療結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用。碳酸酐酶9（Carbonic anhydrases，CA9）是收到缺氧誘導因子（Hypoxia-inducing factor，HIF）調(diào)控最強烈的蛋白之一，參與了氫離子濃度指數(shù)（Hydrogen ion concentration，pH）的調(diào)控[48]。CA9-ko 在缺氧條件下顯著抑制腫瘤細胞的生長。異種移植瘤實驗顯示CA9-ko 可以顯著降低腫瘤的體積大小[49]。CA12 的顯著誘導發(fā)生在Na+/H+交換泵（Na+/H+exchanger isoform-1，NHE1）/CA9-dko 腫瘤中，表明這是一種彌補pH 調(diào)節(jié)蛋白損失以維持生長的潛在手段。CA9 被認為是一種可誘導缺氧的蛋白，研究表明，CA9 的表達與結(jié)直腸癌的發(fā)生和侵襲有關，控制細胞內(nèi)外的pH 值，導致不良預后。在結(jié)直腸癌中，CA2 的表達可能被抑制，而CA9 可能表達上調(diào)，并且CA9 在晚期結(jié)腸炎相關結(jié)腸 癌（Ulcerative colitis-associated colorectal cancer，UCCA）中表達顯著升高[50]。

AKT1 基因的多態(tài)性會影響癌細胞的新輔助化療的敏感性[51]，有研究顯示，p53/miR-374b/AKT1 信號在人結(jié)腸癌細胞HCT116 的凋亡中發(fā)揮重要作用，可以應對博來霉素（Bleomycin，BLM）誘導的DNA 損傷[52]，這意味著調(diào)控這些因素可能提高結(jié)直腸癌細胞對化療的敏感性。在結(jié)直腸癌患者體內(nèi)，AKT1 的高表達水平與生存率顯著相關[53]。敲除AKT1 可顯著抑制結(jié)腸癌細胞遷移和侵襲，在體內(nèi)外結(jié)腸癌中顯著增加上皮鈣粘蛋白（Epithelial cadherin，E-cadherin）表達，降低 神 經(jīng) 鈣 粘 蛋 白（Neural-cadherin，N-cadherin）、phospho(p)-AKT1、磷酸化糖原合酶激酶3β（Phosphoglycogen synthase kinase-3β，p-GSK-3β）和Snail 的表達。因此，AKT1 可能是結(jié)腸癌細胞的關鍵調(diào)控因子，也是該疾病的潛在治療靶點[54]。

使用抗表皮生長因子受體（Anti-epidermal growth factor receptor，anti-EGFR）抗體治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（Metastatic colorectal cancer，mCRC）可以改善患者預后，特別是針對預測性生物標志物選擇缺乏RAS 突變的患者[55]。治療mCRC 患者唯一確定的生物標志物就是腫瘤RAS 突變狀態(tài)，這是抗EGFR 治療的陰性預測標志物[56]。西妥昔單抗和帕尼單抗都是針對EGFR 的胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，該結(jié)構(gòu)域阻斷配體結(jié)合并抑制下游RAS-RAF-MEK-ERK 信號通路，從而治療野生型RAS轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌[57]。

PTGS2 產(chǎn)生炎癥介質(zhì)前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2），并促進結(jié)直腸癌的發(fā)展。在結(jié)直腸癌患者中，PTGS2 表達可能會增加腫瘤復發(fā)風險，并且和較差的特異性結(jié)直腸癌生存期有關，但與總生存期無關[58]。

SRC 在超過80%的結(jié)直腸癌患者中異常過表達和激活，SNX10（Sorting nexin 10）在人結(jié)直腸癌組織中的顯著下調(diào)，上調(diào)SNX10 的表達來調(diào)控SRC-STAT3和SRC-CTNNB1 信號通路的活性[59]。有文獻表明，SRC 是Cten 信號通路中一個新的重要的功能靶點，Cten 蛋白在轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定SRC 促進結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[60]。因此，SRC 可能成為未來發(fā)展的潛在治療靶點。

3.3 黃連治療結(jié)直腸癌的關鍵通路分析

GO分析及KEGG通路富集結(jié)果顯示，共有靶點主要富集在PI3K-AKT 信號通路、蛋白聚糖途徑、Ras 信號通路、前列腺癌磷脂酶D 信號通路、Rap1信號通路、ErbB 信 號 通 路、HIF-1 信 號 通 路、FoxO 信 號 通 路、VEGF信號通路、花生四烯酸代謝途徑等多條通路中。

PI3K/AKT/mTOR 通路與結(jié)直腸癌發(fā)展密切相關，并且mTOR 通路成分在結(jié)直腸癌中過表達[61]。PI3K/Akt/mTOR 信號在結(jié)腸上皮細胞中發(fā)揮重要作用，它調(diào)節(jié)細胞對葡萄糖和各種氨基酸的反應，以及對各種細胞外信號的反應。研究證實Akt通過抑制不同亞型Akt1 和Akt2 在結(jié)腸癌中的作用，從而降低腫瘤的生長[62]。PI3K/mTOR通路的抑制劑已成功用于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的治療，例如，南蛇藤醇通過PI3K/AKT 信號通路抑制MMP3 和MMP7，抑制結(jié)直腸癌細胞增殖和遷移[63]，有研究證實，在結(jié)腸癌的異種移植小鼠模型中，過表達二型肌苷單磷酸脫氫酶（Inosine monophosphate dehydrogenase type II，IMPDH2）可通過激活PI3K/AKT/mTOR 通路促進G1/S 期細胞周期轉(zhuǎn)變，促進細胞侵襲、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelialmesenchymal transition，EMT），加速裸鼠異種移植瘤的生長，在結(jié)直腸癌細胞和組織中，IMPDH2 在mRNA 和蛋白水平均上調(diào)，與CRC 患者生存差顯著相關[64]，使該通路成為臨床癌癥治療的一個有前景的靶點。PI3K/AKT/mTOR 信號通路與結(jié)腸癌細胞的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥和干細胞特性有關[65]，從而使該通路成為藥物治療的首選靶點。在各種臨床前和臨床模型中，各種天然和合成分子被證明可以抑制結(jié)腸癌，這些抑制劑作為臨床抗癌藥物的潛力。

基于典型突變的分類和最近的轉(zhuǎn)錄組的分類中普遍認為RAS 突變在結(jié)直腸癌的發(fā)病機制中起著核心作用[66]。有研究表明，在76%的原發(fā)性CRC 病變中發(fā)現(xiàn)RAS 突變[67]，RAS 可激活不同信號通路的下游效應器，主要激活PI3K-AKT 信號通路和級聯(lián)組成RAF激酶，它激活促分裂原活化蛋白激酶1（Mitogenactivated protein kinase，MEK1）和MEK2，以及隨后激活細胞外信號調(diào)控激酶1 和2（Extracellular signalregulated kinases，ERK1 和ERK2），促進細胞生存、增殖、入侵和遷移[68-69]。RAS 突變狀態(tài)被用來預測轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者對抗表皮生長因子受體藥物的耐藥性[53]。大約40%的結(jié)腸直腸癌發(fā)生KRAS 突變，在結(jié)直腸細胞惡性轉(zhuǎn)化的早期以及轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的晚期都KRAS 突變都發(fā)揮了關鍵作用[70]，因此，RAS 被認為是診斷和預后人類惡性腫瘤的新的潛在生物標志物。

CRC 患者腫瘤中RAP1 表達較高，RAP1 參與代謝相關通路的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因在細胞粘附和腫瘤進展中發(fā)揮作用[71]。與相鄰正常組織相比，乳腺腫瘤組織中RAP1表達水平顯著升高，提示RAP1可能在腫瘤進展中發(fā)揮作用[72]。數(shù)據(jù)分析還發(fā)現(xiàn)RAP1 的高表達與結(jié)直腸癌的預后不良有關[73]，但是在CRC 放療耐藥中的作用仍是未知的。Rap1 GTP 酶激活蛋白是Rap1活性的負調(diào)節(jié)因子，其下調(diào)與結(jié)直腸癌的預后不良有關，并可能影響腫瘤進展[74]。在結(jié)直腸癌病例中，Rap1GAP表達與MMP-9呈負相關，與E-cadherin呈正相關[75]。Rap1 可能參與CRC 的腫瘤進展，并可能成為結(jié)直腸癌患者預后預測的潛在靶點。

結(jié)直腸癌患者血清中VEGF、MMP-2 的表達與腫瘤浸潤深度、Dukes 分期、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（Colorectal liver metastasis，CLM）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關[76]。在多個結(jié)直腸癌細胞系中，細胞內(nèi)VEGF 和VEGFR1 的缺失強烈抑制了結(jié)直腸癌細胞遷移和侵襲[77]。貝伐珠單抗（Bevacizumab/Avastin）是血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的重組人源化單克隆抗體，2004年首次被食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準作為治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的抗血管生成藥物[78]。有研究表明，CRC 患者門靜脈血清VEGF、MMP-2 水平可作為判斷CRC 預后和預測CLM 的有效指標，VEGF、MMP-2 高表達的患者術后應積極行動脈化療栓塞術（Transhepatic arterial chemoembolization，TACE）治療[76]，以提高生存率。

4 結(jié)語

本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法，通過網(wǎng)絡關系探析藥物和疾病之間的作用關系，探究了黃連抗結(jié)直腸癌的物質(zhì)基礎和作用機制，黃連的結(jié)構(gòu)與我們研究的新化合物844 結(jié)構(gòu)類似，對課題進步一研究具有重要參考價值及指導意義。

綜上所述，黃連中的黃酮醇類類和生物堿類等多成分，可通過多靶點、多通路協(xié)同發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用與我們后期開展的實驗研究結(jié)果相一致。CA1、CA12、CA2、CA9、AKT1、EGFR、PTGS2 和SRC 等可能是其核心治療靶點，PI3K-AKT、Ras、Rap1 和VEGF 等可能是其主要作用通路。在臨床實際應用中，黃連雖然被用于癌癥治療中，但往往僅作為隨證加減輔助用藥來提高患者的免疫水平，其治療癌癥的能力還有待不斷挖掘探索。目前針對黃連治療結(jié)直腸癌相關的基礎研究較少，大多數(shù)研究的關注點在于黃連活性成分對癌疾病治療的作用，但對其發(fā)揮抑癌的具體作用機制尚不明確，并且至今未有系統(tǒng)的網(wǎng)絡藥理學對黃連抗結(jié)直腸癌的有效靶標和相關信號通路進行深入研究分析。為更好應用中草藥來治療癌癥，我們需要對黃連有效成分進行分析，對藥物作用靶點以及藥物是通過哪條信號通路在機體內(nèi)發(fā)揮藥效進行更深入的探究。因此，本文具有一定現(xiàn)實意義與創(chuàng)新性，但是對現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫中進行分析挖掘，一定程度上也存在局限性，需要后期基礎研究和臨床研究進一步驗證，同時希望通過后續(xù)試驗驗證，表明結(jié)果的準確性。