圈養(yǎng)華南虎血液生化指標正常參考值初步研究*

任小冬 黃 勉 李石洲 雷勝橋 虞堅頤 劉力軍

（1.廣東粵北華南虎省級自然保護區(qū)管理處，廣東 韶關 512023；2.廣州動物園，廣東 廣州 510070；3.上海動物園，上海200335）

華南虎Panthera tigris amoyensis 為我國特有的虎亞種，野外已多年未發(fā)現(xiàn)其蹤跡，現(xiàn)存圈養(yǎng)華南虎均為上世紀五六十年代捕獲的6 只華南虎的后代[1]。目前，國內(nèi)外對家禽及實驗動物的血液生理生化指標值的研究較多，對虎的血液生化指標研究較少。血液對于維持動物機體正常生命活動具有極其重要的意義，血液指標能客觀地反映動物機體的生理機能與代謝狀況，動物生理生化指標的測定是保種育種的基礎性工作[2]。國內(nèi)華南虎血液生化指標相關研究僅介紹了均值及方差，也未研究其正常參考值。由于生化技術的進步,生理生化研究與遺傳學研究的結合,血液生化指標已廣泛用于家畜家禽輔助選擇的遺傳標記。目前可查資料的華南虎血液生化指標的項目不全，且不同研究者提供的數(shù)據(jù)各有差異，這給華南虎的疾病診斷和健康評估帶來一定影響。正常值參考范圍也叫醫(yī)學參考值范圍是指“正常”人或動物的生理、生化指標等數(shù)據(jù)大多數(shù)個體值的波動范圍[3]。血液生化指標的正常參考值是華南虎疾病防治和健康評估的重要參考內(nèi)容。本研究從國內(nèi)僅存約160 只華南虎中選取部分健康的華南虎作為研究對象采集血樣檢測，同時收集到1995 年至2004 年間部分華南虎體檢生化報告，對華南虎血液生化各項指標進行研究，初步形成華南虎血液生化指標的正常參考范圍，為華南虎飼養(yǎng)管理、疾病防治和保育繁殖等提供科學依據(jù)，促進華南虎種群健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇國內(nèi)人工圈養(yǎng)的健康華南虎，2014—2016 年共采集到36 只華南虎血樣，樣本信息見表1，有效樣本34 份，無效樣本2 份，經(jīng)檢測得到血液生化報告34 份，其中成年虎18 份，幼年虎16 份，雌性15 份，雄性,19 份。由于華南虎數(shù)量稀少，血液樣本采集十分困難，為擴大研究范圍，從廣州動物園和上海動物園收集到31 份華南虎的血液生化檢測報告，檢驗時間為1995—2004 年。綜合本項目采集的樣本數(shù)據(jù)，共得到65 份血液生化數(shù)據(jù)（表2）。

表1 采集樣本信息Tab. 1 Sample information

1.2 采集方法

本次采集血液樣本時要求華南虎需空腹12 h以上，13 頭成年虎使用舒泰+多咪靜的復合麻醉采血，5 頭成年虎用治療夾籠控制后在后肢或尾部采血，幼年虎捕捉后強制在其后肢靜脈采血。華南虎血樣使用肝素鋰抗凝管保存，血樣采集后需要輕輕搖勻抗凝管至少5 次，讓血樣與抗凝劑混勻，并在15 min 到4 h 內(nèi)測試，最佳測試時間為30 min 到2 h 內(nèi)。如生化檢測不能在4 h 內(nèi)完成，則需要分離血漿后2-8℃密封保存和運輸，距采血時間最長不超過48 h,否則作為無效樣本處理。檢測時血漿樣本需清晰、無溶血現(xiàn)象方為有效樣本。

本文共得到華南虎血液生化指標38 項指標數(shù)據(jù)，其中檢測組34 個樣本共測得25 項指標，包括血糖、總膽固醇、甘油三酯、血淀粉酶、總蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、血清尿酸、肌酸肌酶、乳酸脫氫酶、血清肌酐、血清尿素、鉀、鈉、氯、鈣、無機磷；收集組31 個樣本共收集到32 項指標，除檢測組上述指標，還有13 項指標有數(shù)據(jù)錄入，本文一并納入計算其正常值范圍，這13 項指標包括高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白A1 測定、脂蛋白a 測定、載脂蛋白B 測定、膽堿酯酶、鎂、超敏C 反應蛋白、肌紅蛋白、糖化血清蛋白、肌酸肌酶-MB 同工酶、α- 羥丁酸脫氫酶和肌鈣蛋白T 定量。

1.3 研究設備和方法

主要儀器和耗材有：美國IDEXX Catalyst Dx 動物專用全自動生化分析儀；配套試劑片（IDEXX Catalyst Dx 專用試劑片）；真空采血管—抗凝劑（肝素鋰）、一次性采血器；電動推剪、刮毛刀等。因華南虎分布在全國各地，采集血液后有效保存時間較短，空運受到限制，其他運輸方式都無法確保血樣及時送達實驗室。因此，本項目分別在上海動物園、廣州動物園設立血液生化實驗室。秉著使試驗的誤差最小化原則，兩家實驗室均使用同一品牌、同一型號的儀器對樣本進行檢測。該生化分析儀使用干式試劑片生化技術，該技術采用過濾層去除雜質，可以獲得可靠準確的結果。首先將樣本加入擴散層頂端，被檢測樣本滴注到擴散層表面，擴散層使樣本均勻分配，過濾層將會過濾干擾因素，在試劑層試劑和樣本產(chǎn)生反應，測試層對樣本進行光譜分析，光學測試反應后的樣本，在支持層通過對光學界面掃描得出檢測結果。

1.4 統(tǒng)計和計算方法

利用SPSS 20 軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計算正常參考值最基本的方法有正態(tài)分布法和百分位數(shù)法。百分位數(shù)法適合于任何分布類型的資料，故在實際中最為常用；正態(tài)分布法要求資料必須服從或近似服從正態(tài)分布，缺點是適用范圍較窄，不適合偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)資料。表3 給出了兩種方法90%、95%、99%3 種概率作為參考區(qū)間的計算公式[3]。

表2 總樣本分組統(tǒng)計Tab. 2 Statistical table of total sample grouping

2 結果與分析

2.1 統(tǒng)計結果和正常值范圍

經(jīng)過篩選統(tǒng)計共有合格的血液生化檢驗報告65 份，其中34 份為此次研究項目采集的有效樣本，檢驗時間為2014—2017 年。另外31 份血液生化檢驗報告為上海動物園和廣州動物園提供，檢驗時間為1995—2004 年?？偟鞍住⒖偰懠t素、血清肌酐、血清尿酸、葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯等主要項目的數(shù)據(jù)達到50 個以上，具備一定的統(tǒng)計學意義。綜合考量華南虎種群數(shù)量和本次實驗的實際情況后，認為95%的概率范圍能較好地兼顧可信度和精確度，故本文中的醫(yī)學參考值范圍取95 %的概率為正常值參考區(qū)間。

本文共得到華南虎血液生化38 項指標數(shù)據(jù)，由于其中部分收集項指標數(shù)據(jù)量較少，如膽堿酯酶僅有13 個數(shù)據(jù)，超敏C 反應蛋白僅有11 個數(shù)據(jù)，肌紅蛋白和肌鈣蛋白T 定量都只有12 個數(shù)據(jù)，本文所得的正常值范圍僅為現(xiàn)有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計計算結果。

2.1.1 肝、腎功能的正常值范圍和統(tǒng)計參數(shù) 在血液生化指標中肝、腎功能各項指標具有重要作用，血漿中肝、腎功能指標中多項指標的漸進顯著性（雙側）P <0.05,其指標值不符合正態(tài)分布，這部分指標的正常值范圍采用百分位數(shù)法計算得出，華南虎部分肝、腎功能指標的正常值范圍和統(tǒng)計參數(shù)見表4。

2.1.2 血糖、血脂及幾種酶的正常值范圍和統(tǒng)計參數(shù) 華南虎血糖、血脂及幾種酶等多項符合正態(tài)分布（P >0.05），但也有部分指標樣本數(shù)較少，統(tǒng)計檢驗不符合正態(tài)分布（P <0.05）,這部分指標的正常值范圍和統(tǒng)計參數(shù)見表5。

2.1.3 生化指標中幾種離子含量的正常值范圍和統(tǒng)計參數(shù) 血液中各種微量離子的含量能反映華南虎身體機能狀況，其中，鈉離子、氯離子和鈣離子含量的漸進顯著性（雙側）P <0.05，拒絕原假設，即不符合正態(tài)分布。生化指標中幾種離子含量的正常值范圍和統(tǒng)計參數(shù)見表6。

表3 醫(yī)學參考值范圍的正態(tài)分布法和百分位數(shù)法計算公式[3]Tab. 3 Formulas of normal distribution method and percentile method for calculating the range of medical reference values

2.1.4 幾項離散度較大指標的正常值范圍和統(tǒng)計參數(shù) 項目中得到的華南虎生化指標中有幾項指標的標準差大于或2 到3 倍于均值，數(shù)據(jù)離散度較大，且正態(tài)性檢驗顯示這部分項目漸進顯著性（雙側）P <0.05，拒絕原假設，即不符合正態(tài)分布。因此，這幾項指標的正常值范圍采用百分位數(shù)法進行計算，其正常值范圍和統(tǒng)計參數(shù)見表7。

2.2 差異性分析

大量資料顯示，血液生化值受品系、性別、年齡、營養(yǎng)因素的影響，這些因素的微小變化都會引起測定值的變化[4]。因此研究華南虎血液生化指標正常值應當進行年齡、性別等因素的差異性分析。差異性分析需要分組后首先進行正態(tài)性檢驗，當符合正態(tài)分布時，才能進行獨立樣本t 檢驗—即差異性檢驗。當分組后的正態(tài)性檢驗不符合正態(tài)分布時，無法進行獨立樣本t 檢驗，即無法判斷該分組因素對數(shù)據(jù)的差異性。由于本文涉及項目較多，在此僅以血糖為例介紹性別分組和年齡分組兩種分組情況下生化指標的差異分析方法。

表4 華南虎血液生化指標中肝、腎功能的正常值范圍Tab. 4 Normal range of liver and kidney function in blood biochemical indexes of Panthera tigris amoyensis

表5 華南虎生化指標中血糖、血脂及幾種酶等的正常值范圍Tab. 5 Normal ranges of blood sugar, lipid and several enzymes in biochemical indexes of Panthera tigris amoyensis

2.2.1 以血糖為例雌雄兩組的差異性分析 血糖按性別分組后雌雄比例為26:39，因為雌性兩組是兩個相互獨立的，因此我們選擇獨立樣本的t 檢驗方法處理結果均值之間的差異是否顯著進行檢驗，表8 是按性別分組后血糖指標的統(tǒng)計量，雌性均值（7.510 8 mmol/L）明顯高于雄性均值（6.976 1 mmol/L）。

表9 給出了t 檢驗結果，首先做方差齊性檢驗，本例中F = 0.485，P =0.492 > 0.05，故應選擇“假設方差相等”一行的結果進行顯著差異性分析；雙側 P = 0.031 < 0.05,故應拒絕原假設，由于0.05 > P > 0.01，所以性別對血糖指標影響的差異性較為顯著。

根據(jù)上述方法分別對華南虎各項生化指標按性別分組進行正態(tài)性檢驗，當符合正態(tài)分布時用獨立樣本t 檢驗進行差異性分析，其中樣本數(shù)少于20 和離散度較大的生化指標分組后不符合正態(tài)分布，無法進行差異性分析。獨立樣本t 檢驗結果顯示血糖(GLU)、鉀(K)、鈣(C)、磷(PHOS)、球蛋白(GLB)、白球比(A/G)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉肽酶(GGT)、肌酐(CREA)、尿素(UREA)的雙側P<0.05，拒絕原假設，即這幾項指標受性別影響較為顯著；其他指標的雙側P>0.05，接受原假設，即這部分指標雌雄間差異不顯著。

表6 華南虎生化指標中幾種離子含量的正常值范圍Tab. 6 Normal ranges of ion contents in biochemical indices of Panthera tigris amoyensis

表7 幾項離散度較大指標的正常值范圍和統(tǒng)計參數(shù)Tab. 7 Normal ranges of ion contents in biochemical indices of Panthera tigris amoyensis

2.2.2 以血糖為例幼齡組和成年組的差異性分析 血糖指標按年齡分組后幼齡組和成年組比例為23:42，因為幼齡組和成年組是兩個相互獨立的，因此利用獨立樣本的t 檢驗方法對均值之間的差異是否顯著進行檢驗，表10 是按年齡分組后血糖指標的統(tǒng)計量，幼齡組均值(7.174 5 mmol/L)與成年組均值(7.198 5 mmol/L)相差不大。

表11 給出了t 檢驗結果，首先做方差齊性檢驗，本例中F = 0.0.103,P =0.751 > 0.05,故應選擇“假設方差相等”一行的結果進行顯著差異性分析；雙側P 值= 0.086 > 0.05,故應接受原假設，所以幼齡組和成年組的血糖指標差異不顯著。

根據(jù)上述方法分別對華南虎各項生化指標幼齡組和成年組分組進行正態(tài)性檢驗，當符合正態(tài)分布時用獨立樣本t 檢驗進行差異性分析，其中樣本數(shù)少于20 和離散度較大的生化指標分組后不符合正態(tài)分布，無法進行差異性分析。獨立樣本t 檢驗結果顯示全部生化指標的雙側P>0.05，接受原假設，即華南虎血液生化指標幼齡組與成年組差異不顯著。

3 結論與討論

3.1 本文檢測和收集血液生化指標共達38 項，得到較全面的華南虎血液生化指標數(shù)據(jù)，與同類技術論文的方法比較見表12。

3.2 血液生理生化指標受品種品系、性別、年齡、營養(yǎng)因素的影響，這些因素的微小變化都會引起測定值的變化[4]，華南虎的血常規(guī)和生化研究中，很多影響因素難以控制，如遺傳、營養(yǎng)、飼養(yǎng)條件等都不能做到相同。華南虎現(xiàn)全球僅存活160只左右，可供研究的樣本量極少，所以我們把外觀、行為等較正常且無明顯病癥的華南虎都暫認為其是正常的。因此，在本文中影響被研究指標主要的可控制因素達到相同或基本相同就認為是同質,本文假設所有參加統(tǒng)計的華南虎都是在同質的條件下進行的。在本文所述研究中，通過人員培訓、控制檢測條件等措施，來減少檢測誤差。

3.3 由于華南虎血樣采集條件和部分報告檢測方法不同，少部分指標離散度較大，這可能是多種因素共同造成。限于華南虎分散于全國各地，實驗研究難度極大，本文僅對造成統(tǒng)計結果異常的個別原因做出推測。如統(tǒng)計檢驗結果顯示肌酸激酶（CK）、肌酸肌酶-MB 同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）等指標數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，得到的數(shù)據(jù)標準差是均值的一倍至三倍，離散度較大，根據(jù)經(jīng)驗這種情況可能與華南虎血樣采集時的應激程度有關。應激是指機體受到體內(nèi)外非特異有害因子（應激源）的刺激所表現(xiàn)的防御反應（應激反應）和機體障礙[5]。因此，應激對華南虎血液生化指標的影響仍需作進一步研究。

表8 血糖指標按性別分組的統(tǒng)計量Tab. 8 Statistics of blood glucose indexes grouped by gender

表9 血糖指標按性別分組的t 檢驗結果Tab. 9 T test results of blood glucose indexes grouped by gender

表10 血糖指標按年齡分組的統(tǒng)計量Tab. 10 Statistics of blood glucose indexes grouped by age

表11 血糖指標按年齡分組的t 檢驗結果Tab. 11 T test results of blood glucose indexes grouped by age

表12 同類技術論文所用儀器和方法的比較Tab. 12 Comparison of instruments and methods used in similar technical papers

3.4 由于華南虎血液生化指標的研究較少，本文將兩篇華南虎血液指標相關論文中的數(shù)據(jù)進行部分比對。張錫然[6]于1993 年在《獸類學報》發(fā)表《東北虎和華南虎血象及血液生化指標測定》中部分項目的均值和范圍分別為總蛋白61.7(56.0-68.0) g/L、白蛋白33.6(31.0-36.0) g/L、球蛋白28.1(22.0-33.0) g/L、肌酐70.47(55.0-89.0) μmol/ L、氯118.57(114-126)mmol/L、鈉143.21(140-147) mmol/L、鉀4.53(4.3-5.0)mmol/L、鈣2.78(2.6-3.0) mmol/L、磷2.70(2.50-3.13)mmol/L、堿性磷酸酶108.88(76-125) U/L。與本文所得結果有一定的差別，可能是檢測方法、儀器、華南虎飼養(yǎng)條件等因素有關。凌銘德等[7]于1998 年在《動物學報》發(fā)表的《華南虎血液及生物化學某些指標的測定》中大部分項目與本文統(tǒng)計結果相近。但本文中乳酸脫氫酶的均值和范圍243.66(8.67-1827)U/L 明顯高于凌銘德報道的(8.67-95.81U/L)，造成這種差異可能為采集樣本時虎的應激程度不同造成，與應激程度有關的可能還有肌酸激酶、肌酸激酶-MB 同工酶、α- 羥丁酸脫氫酶等幾項指標，具體影響機制有待于進一步研究。

3.5 為研究華南虎與其他虎亞種在血液生化各項指標之間有無差異，本文對比了幾篇論文中的孟加拉虎Panthera tigris tigris 和東北虎Panthera tigris altaica 的生化指標數(shù)據(jù)。張錫然等[6]發(fā)表的東北虎部分生化指標的均值和范圍為：總蛋白61.2(50.0-73.0) g/L、白蛋白36.0(28.0-49.0) g/L、球蛋白26.2(20.0-32.0) g/L、肌酐120.48(61.8-221.0)μmol/L 與本文差別較大，其發(fā)表的離子類指標如鈉145.57(136-157) mmol/L、 氯116.08(105-124)mmol/L、鉀4.18(3.3-5.3) mmol/L、鈣2.78(2.5-3.0)mmol/L、磷2.82(1.68-4.09)mmol/L 與本文所得結果差別不大。阿布力孜· 阿布力米提等[8]發(fā)表文章中東北虎和孟加拉白虎的總蛋白、總膽紅素、肌酐、肌酸激酶、淀粉酶的均值均小于本文所得均值；甘油三酯、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶的均值均大于本文所得均值；其α- 羥丁酸脫氫酶的均值對比本文均值結果顯示為東北虎小于華南虎，但華南虎小于孟加拉白虎；其報道的鈣、磷、鎂離子含量同本文所得結果近似，所以東北虎和孟加拉白虎的各項生化指標均與華南虎存在不同程度差別。Shrivatav 等[9]報道的孟加拉虎部分生化指標參數(shù)的范圍和平均值為：總蛋白質(3.7-8.7)、(6.40±1.88) mg/dL，白蛋白(2.1-4.6)、(3.50±0.99)mg/dL，總膽紅素(0.4-3.2)、(1.90±1.21) mg/dL，肌酐(1.6-4.6)、(2.90±1.03) mg/dL 等，其總蛋白、白蛋白的范圍和參數(shù)與本文結果近似；雖然其總膽紅素、肌酐的均值明顯高于本文所得結果，但總膽紅素、肌酐的范圍與本文所得結果有部分重疊。

由此發(fā)現(xiàn)，華南虎與其他虎亞種血液生化各項指標存在一定差別。華南虎血液生化指標正常參考值范圍不同于其他虎亞種，建立華南虎血液生化指標正常值對華南虎的飼養(yǎng)管理、疾病診治預防和保育繁殖研究工作有積極意義。

致謝本文血液檢測工作由上海動物園和廣州動物園完成；上海、廣州、蘇州、南昌動物園提供華南虎血液標本；上海動物園袁耀華和桂劍鋒、蘇州動物園李林翔、廣州動物園彭仕明和單芬、韶關華南虎繁育研究基地李秋明等同志參與部分工作，特此表示感謝。