菟絲子提取液質(zhì)量標(biāo)準研究

胡 楊，李先芝，2，劉 洋，林 露，石 豪，毛瓊麗，嚴 玲

（1.勁牌有限公司，湖北大冶 435112；2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北大冶 435112）

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子(Cuscuta australisR.Br.)或菟絲子(Cuscuta chinesisLam.)的干燥成熟種子，表面灰棕色至棕褐色，其味甘性平，歸肝、腎、脾經(jīng)，具有補益肝腎，固精縮尿，安胎，明目之功效[1]。菟絲子作為一種補益類中藥，在我國有著悠久的歷史。已有研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子主要含有黃酮類、生物堿類、氨基酸及多糖類等有效活性成分[2-6]，具有抗衰老，抗氧化，調(diào)節(jié)免疫力，改善生殖系統(tǒng)，預(yù)防骨質(zhì)疏松[7-14]等功效，擁有很高的藥用保健價值，是保健酒用原料之一。

菟絲子提取液是以菟絲子原藥材為原料，以50%食用酒精為提取溶劑，經(jīng)過提取、離心、過濾、濃縮等工序獲取。目前對菟絲子活性成分研究已有報道[15-17]，但對菟絲子提取液的質(zhì)量標(biāo)準研究報道鮮為少見。本文通過建立菟絲子提取液指紋圖譜及其主要活性成分含量的檢測，為合理評價菟絲子提取液質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：10批菟絲子提取液由勁牌公司提供。

對照品：金絲桃苷（批號111521—201708 純度95.1 %）（中國藥品檢定研究院），紫云英苷（批號CFN98733 純度98%）（ChemFaces）。

試劑：甲醇、磷酸（色譜純），95 %乙醇（分析純），水為超純水。

儀器設(shè)備：高效液相色譜儀（賽默飛公司，uLtiMate 3000，美國），電子分析天平（賽多利斯SQP，德國），數(shù)控超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，中國），PURELAB-超純水儀（PURELAB classic UV，英國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菟絲子提取液的指紋圖譜

1.2.1.1 標(biāo)準溶液的制備

分別取對照品金絲桃苷、紫云英苷適量，精密稱定，用50%乙醇配制成每1 mL 中含有金絲桃苷90 μg、紫云英苷25 μg的對照品溶液。

1.2.1.2 菟絲子提取液的制備

菟絲子提取液是由勁牌公司生產(chǎn)車間規(guī)模提取。稱取一定量的菟絲子藥材投入提取容器中，加入8倍量的50%食用酒精，充分提取3次，每次2 h，合并提取液，對提取液進行離心分離，離心后的澄清液依次用陶瓷膜、超濾膜進行分離，最后采用納濾膜進行濃縮，即得菟絲子提取液。

1.2.1.3 供試品溶液的制備

直接吸取菟絲子提取液過0.45 μm 微孔濾膜，過濾，即得。

1.2.1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇（A）-0.1 %磷酸水溶液（B），梯度洗脫見表1；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長360 nm。在此色譜條件下記錄色譜圖。

表1 菟絲子提取液檢測流動相洗脫程序

1.2.2 金絲桃苷、紫云英苷含量檢測

1.2.2.1 色譜條件

同“1.2.1.4”項。

1.2.2.2 對照品溶液的制備

分別取對照品金絲桃苷、紫云英苷適量，精密稱定，制成每毫升含有金絲桃苷595.35 μg、紫云英苷56.2275 μg的對照品溶液母液。

1.2.2.3 菟絲子提取液的制備

制備方法同“1.2.1.2”。

1.2.2.4 供試品溶液的制備

精密量取菟絲子提取液10 mL 至20 mL 的量瓶中，用50%乙醇定容至刻度線，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 菟絲子提取液的指紋圖譜構(gòu)建

2.1.1 精密度試驗

取同一批次的菟絲子提取液適量（編號：S10），按照1.2.1.2 供試品溶液制備方法進行供試品溶液的制備，按照1.2.1.4 色譜條件連續(xù)進樣6 次，以金絲桃苷峰為參照，記錄各個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，9 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值均小于2 %（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗

取同一批次的菟絲子提取液適量（編號：S10），按照1.2.1.2 供試品溶液制備方法進行供試品溶液的制備，按照1.2.1.4 色譜條件分別在0、8 h、10 h、13 h、18 h、24 h 進樣，以金絲桃苷峰為參照，記錄各個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，9 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值均小于2 %（n=6），表明菟絲子提取液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

表2 菟絲子提取液中9個共有峰的相對保留時間和相對峰面積結(jié)果

2.1.3 重復(fù)性試驗

取同一批次的菟絲子提取液6 份（編號：S10），按照1.2.1.2 供試品溶液制備方法進行供試品溶液的制備，按照1.2.1.4 色譜條件進行測定，以金絲桃苷峰（峰6）為參照，記錄各個共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果見表2。9 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值均小于2 %（n=6），表明此方法的重復(fù)性良好。

2.1.4 指紋圖譜共有模式的生成及共有峰的確定

取10批不同批次的菟絲子提取液，按照1.2.1.2供試品溶液制備方法進行供試品溶液的制備，按照1.2.1.4色譜條件進行測定，得到10批菟絲子提取液的色譜圖見圖1，并對得到的樣品色譜圖中各色譜峰進行積分處理，得到樣品疊加圖見圖2。通過與對照品色譜圖比較，9 個色譜峰中6 號峰為金絲桃苷，7號峰為紫云英苷。

2.1.5 10批菟絲子提取液指紋圖相似度評價（表3）

圖1 混合對照品（A）色譜圖與菟絲子提取液（B）指紋圖譜共有模式

將10 批不同批次的菟絲子提取液高效液相指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，進行色譜峰匹配以及相似度的分析，并采用中位數(shù)法生成共有模式對照圖譜。結(jié)果顯示，10批次的菟絲子提取液樣品的指紋圖譜的相似度在0.95以上，說明不同批次的菟絲子提取液具有良好的一致性。

2.2 金絲桃苷、紫云英苷含量檢測

2.2.1 線性關(guān)系考察

將金絲桃苷對照品溶液母液分別吸取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2 mL 至10 mL 量瓶中，將紫云英苷對照品溶液母液分別吸取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、3 mL 至10 mL 量瓶中，制成5 個不同濃度水平的對照品混合溶液，精密吸取5 個不同濃度的對照品混合溶液10 μL，注入液相色譜，得到各濃度的各色譜峰的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準曲線，得出線性關(guān)系及范圍。金絲桃苷線性關(guān)系回歸方程Y=0.4009X+0.0386（R2=0.9999），線性范圍為11.907～119.07 μg/mL；紫云英苷線性關(guān)系回歸方程Y=0.3550X+0.0205（R2=1.0000），線性范圍3.7485～56.2275 μg/mL。

圖2 10批菟絲子提取液的HPLC指紋圖譜疊加圖

表3 10批菟絲子提取液的HPLC指紋圖譜相似度評價

2.2.2 精密度試驗

取同一批次的菟絲子提取液（編號：S10），按照1.2.2.3 供試品溶液制備方法制備供試品，按1.2.2.1色譜條件進行連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。金絲桃苷、紫云英苷峰面積的RSD 分別為0.27 %、0.57 %（n=6），表明該儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗

取同一批次的菟絲子提取液6 份（編號：S10），按照1.2.2.3 供試品溶液制備方法制備供試品，按1.2.2.1 色譜條件進行測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，金絲桃苷、紫云英苷峰面積的RSD 為0.67 %、0.95%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一批次供試品溶液（編號：S10），按1.2.2.1色譜條件分別于0、11 h、13 h、19 h、22 h、28 h進樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，金絲桃苷、紫云英苷峰面積的RSD 分別為0.64%、0.57%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置28 h穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率

精密量取已知含量的同一批次的菟絲子提取液（編號：S10）5 mL 至20 mL 量瓶中，共9 份，分別按照提取液中金絲桃苷、紫云英苷含量的50 %、100 %、150 %共3 個水平加入對照品適量，按“1.2.1.2”制備方法進行樣品制備，按照1.2.2.1 色譜條件進行測定，金絲桃苷、紫云英苷加標(biāo)回收率結(jié)果見表4。

由表4 可知，金絲桃苷的加標(biāo)回收率范圍為91.51 %～99.92 %，平均回收率為95.03 %；紫云英苷加標(biāo)回收率范圍為94.57 %～101.61 %，平均回收率為98.81%，RSD值分別為3.72%、3.20%。

表4 菟絲子提取液中金絲桃苷、紫云英苷的加標(biāo)回收率(n=9)

2.2.6 含量測定

精密吸取對照品溶液10 μL，菟絲子提取液供試品溶液10 μL，按照1.2.2.1 色譜條件測定，帶入線性方程計算金絲桃苷及紫云英苷的含量，見表5。

表5 10批菟絲子提取液檢測結(jié)果

由表5 可知，10 批菟絲子提取液中金絲桃苷含量范圍為75.5806～106.3686 μg/mL，平均含量為87.5463 μg/mL，紫云英苷含量范圍為14.4058～27.1888 μg/mL，平均含量為20.1103 μg/mL。在這10 批菟絲子提取液中金絲桃苷與紫云英苷含量存在著差異，可能造成的原因為藥材本身的差異性。張燕麗等[3]研究了不同產(chǎn)地菟絲子中6 種主要活性成分含量，其中內(nèi)蒙古地區(qū)種植的菟絲子中金絲桃苷和紫云英苷的含量最高。

3 討論

在預(yù)實驗中，對金絲桃苷、紫云英苷對照品在190～400 nm 范圍內(nèi)進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)金絲桃苷、紫云英苷在360 nm 處均有較大的吸收峰，且在此波長下各成分之間的干擾較小，基線平穩(wěn)，故選擇360 nm作為檢測波長。

本文通過HPLC 法研究了菟絲子提取液指紋圖譜及金絲桃苷、紫云英苷2 種活性成分的含量，研究結(jié)果顯示，10批菟絲子提取液指紋圖譜相似度高于0.95，表明這10批菟絲子提取液具有良好的一致性，其中金絲桃苷平均含量為87.5463 μg/mL，紫云英苷平均含量為20.1103 μg/mL，加標(biāo)回收率在91.51%～101.61%之間，RSD 值在3.20%～3.72%之間，表明該方法準確度高，穩(wěn)定性好，能夠很好的用于菟絲子提取液指紋圖譜及金絲桃苷、紫云英苷的含量測定，為菟絲子提取液的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。