融合“通路-靶點(diǎn)-活性成分”探討藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制與初證＊

趙凰宏，詹向紅，馬 振，關(guān)東升，韓冠先，楊 柳，雷勵(lì)飛，曹鈺珂

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 濟(jì)南 250355；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450000；3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)文獻(xiàn)與文化研究院 濟(jì)南 250355；4. 河南省中醫(yī)院 鄭州 450000；5. 洛陽市中醫(yī)院 洛陽 471000）

新型冠狀病毒肺炎（2019-nCoV），簡(jiǎn)稱新冠肺炎，于2019 年12 月在武漢被首次報(bào)道,之后200 多個(gè)國(guó)家相繼發(fā)現(xiàn)確診病例，截至到2020年4月4日，世界累計(jì)報(bào)告的確診病例超過1195969 例，死亡人數(shù)大于64445，其傳播力之強(qiáng)、致死率之高引發(fā)了全世界的關(guān)注。根據(jù)現(xiàn)有的臨床研究，發(fā)熱、咳嗽、疲勞、呼吸急促和胸部CT 異常是該病的常見癥狀，但是部分患者在感染病毒的中后期會(huì)因免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子等急劇增多而引發(fā)炎癥風(fēng)暴，可在短時(shí)間內(nèi)造成組織水腫、高熱、充血或損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）及多器官功能衰竭等危重癥，甚至導(dǎo)致死亡[1,2]。目前根據(jù)中國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局的數(shù)據(jù)，2019-nCoV 的病死率約為4%。因此，亟需尋求治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴思路和方法。

中醫(yī)將該病歸于“濕毒疫”范疇，并結(jié)合重癥肺炎的高熱喘促、譫語神昏、惡心不食、發(fā)斑吐血等熱證病理表現(xiàn)，認(rèn)為濕熱證為新冠肺炎炎癥風(fēng)暴期的主要證型。藿樸夏苓湯始載于《醫(yī)原·濕氣論》，全方苦溫與辛溫相配、化濕、利濕、燥濕并用，注重調(diào)肺并兼顧它臟。故根據(jù)葉天士“濕去熱孤”的理念，該方可作為治療“濕熱證”的有效方劑[3]。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，藿樸夏苓湯能夠通過抑制TNF-α、IL-6 等炎癥因子顯示出良好的抗炎、調(diào)節(jié)免疫效果[4,5]，而根據(jù)最新的文獻(xiàn)報(bào)道TNF-α、IL-6 等可能是參與此次新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6-7]。此外，近年來臨床研究結(jié)果顯示，藿樸夏苓湯除了治療治療胃炎、急性眼結(jié)膜炎[8]、乙型腦炎[9]等炎癥疾病外，也被廣泛用于感冒[10]、肺部感染[11]、咳嗽[11]、間質(zhì)性肺病[12]等肺系疾病得治療，在改善炎癥風(fēng)暴期常見的高熱[9]、譫語神昏[9]、水腫[3]、嘔吐不食[13]等癥狀以及皮膚紅腫、發(fā)疹的病變[14]方面療效確切。自疫情暴發(fā)以來，上海、河南、廣東、四川、甘肅等地將藿樸夏苓湯用于新冠肺炎的治療，并取得了良好的效果[15,16]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在生物信息學(xué)、計(jì)算生物學(xué)及高通量組學(xué)等多學(xué)科融合的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”[17-18]，直觀的揭示中藥成分、靶點(diǎn)、疾病之間復(fù)雜的生物學(xué)關(guān)系[19]，促進(jìn)了中藥研究從“單一靶標(biāo)、單一藥物”向“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)、多成分藥物”模式的轉(zhuǎn)變[20]，這不僅為中醫(yī)學(xué)從基于經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)榛谧C據(jù)的醫(yī)學(xué)提供新的途徑，也為當(dāng)前的藥效物質(zhì)、作用機(jī)制探查以及方劑配伍規(guī)律改進(jìn)等藥物研究提供了策略[21,22]。因此，本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)和主要化合物成分進(jìn)行探尋，并闡述其作用機(jī)制，為拓展中醫(yī)藥防治2019-nCoV以及新藥開發(fā)提供思路和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 藿樸夏苓湯的四氣五味與藥物歸經(jīng)

歷代有關(guān)藿樸夏苓湯的出處、組成等問題頗有爭(zhēng)議，本研究通過“中國(guó)知網(wǎng)”、“萬方”等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到2001年以來有關(guān)藿樸夏苓湯的157篇參考文獻(xiàn)，其中，有88 篇認(rèn)為該方出自《醫(yī)原·濕氣論》，占比高達(dá)56.1%，然后依次是《感證揖要》《濕溫時(shí)疫治療法》《重訂廣溫?zé)嵴摗返龋@與近現(xiàn)代的研究成果相似[14]。故根據(jù)《醫(yī)原·濕氣論》“濕氣彌漫，本無形質(zhì)，宜用體輕而味辛淡者治之，辛如杏仁、蔻仁、半夏、厚樸、藿梗，淡如薏苡仁、通草、茯苓、豬苓、澤瀉之類”的記載，將該方涉及的10味藥物按照《中華藥典》進(jìn)行藥名校正（校正后：廣藿香、厚樸、半夏、茯苓、苦杏仁、薏苡仁、豆蔻、豬苓、通草、澤瀉），然后從《中藥大辭典》中獲取藿樸夏苓湯各味藥的藥性與歸經(jīng)，并通過網(wǎng)絡(luò)圖展現(xiàn)。

1.2 藿樸夏苓湯有效成分篩選及“藥物組成-活性成分-對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

中藥飲片須通過吸收、分布、生物轉(zhuǎn)化、儲(chǔ)存以及排泄等一系列的ADME 過程才能對(duì)靶器官和組織發(fā)揮作用，口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）、藥物半衰期（HL）和藥物對(duì)小腸細(xì)胞的穿透性（Caco-2）等是中藥成分ADME 的可靠檢測(cè)指標(biāo)[23]。本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行藿樸夏苓湯藥物成分查詢，并按照OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18、Caco-2 ≥ -0.4 以及 HL ≥ 4 h 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選[24]，獲取該復(fù)方的有效化合物成分，對(duì)于未檢索到的中藥，則通過BATMAN-TCM、TCMID 進(jìn)行補(bǔ)充，并按照上述標(biāo)準(zhǔn)納入。然后在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中，將所有有效化合物成分中涉及與人相關(guān)靶點(diǎn)蛋白的官方名稱檢索出來，并將靶蛋白、相應(yīng)的效化合物成分以及藥物組成輸入Cytoscape 3.7.1，構(gòu)建“藥物組成-活性成分-對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 藿樸夏苓湯“關(guān)鍵靶標(biāo)-器官組織”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用STRING 平臺(tái)獲得藿樸夏苓湯靶蛋白的相互作用文件，借助Cytoscape3.7.1 中的CytoNCN 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯Y選出關(guān)鍵靶標(biāo)，并通過BioGPS 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，獲取關(guān)鍵靶標(biāo)的臟器組織分布，構(gòu)建“關(guān)鍵靶標(biāo)-器官組織”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 新冠肺炎炎癥風(fēng)暴靶蛋白獲取及“藥物-疾病”靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用在線數(shù)據(jù)平臺(tái)GeneCards 收集與“novel coronavirus pneumonia”、“inflammatory storm”相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白，獲取二者的靶點(diǎn)交集基因—新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的靶蛋白。然后將獲得的交集蛋白與1.2 得到的藿樸夏苓湯的靶基因再次取交集，得到藿樸夏苓湯干預(yù)新冠肺炎免疫炎癥的“藥物-疾病”基因。將得到的“藥物-疾病”基因輸入STRING，獲取基因相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO富集分析與KEGG通路分析

運(yùn)用 R3.6.2 的 BiocManager、DOSE、ClusterProfiler、Enrichplot 等插件對(duì)1.4 得到的“藥物-疾病”基因進(jìn)行GO 富集和 KEGG 通路分析，并以P＜ 0.05 作為篩選條件。

1.6 構(gòu)建藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的“通路-靶點(diǎn)-活性成分”網(wǎng)絡(luò)

將富集到的藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的KEGG 通路及涉及的關(guān)鍵基因、有效化合物成分一并輸入Cytoscape3.7.1 軟件，構(gòu)建“通路-靶點(diǎn)-活性成分”網(wǎng)絡(luò)。

1.7 運(yùn)用分子對(duì)接對(duì)1.6得到的主要有效成分進(jìn)行初步驗(yàn)證

從PDB 數(shù)據(jù)下載血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE2：1R42）、2019-nCoV spike glycoprotein（PDB:6VSB）的3D 結(jié)構(gòu)*PDB 格式。運(yùn)用 ChemOffice 軟件、PyMOL 軟件、Auto Dock 軟件完成化合物3D 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化、化合物及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換、配體（NAG）提取與格式轉(zhuǎn)換、蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、加氫等預(yù)處理操作。然后運(yùn)用Vina 進(jìn)行對(duì)接，獲取藿樸夏苓湯主要有效成分治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的證據(jù)支持。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建藿樸夏苓湯復(fù)方藥性與歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖

性味歸經(jīng)是中藥理論的核心內(nèi)容,四氣五味乃“藥之本”，臟腑歸經(jīng)為“藥之用”，在此基礎(chǔ)上形成了中藥復(fù)方的君、臣、佐、使的配伍原則，即通過藥性之四氣五味糾正機(jī)體陰陽失衡狀態(tài)，借助藥物歸經(jīng)發(fā)揮其對(duì)特有臟腑的靶向治療作用，形成整體聯(lián)動(dòng)性、靶向性的調(diào)節(jié)機(jī)制。中醫(yī)認(rèn)為濕為陰邪，熱為陽邪，濕熱互結(jié)，如油入面，兩者難解難分，故治療濕熱之病當(dāng)以分解濕熱為宜，使?jié)袢峁?，熱?shì)自愈。從該復(fù)方各味藥的藥性統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看（圖1），五味涉及苦、甘、辛、淡；四氣以寒、涼、溫、平為主，即本方借助藥性將祛濕解熱寓于樞轉(zhuǎn)氣機(jī)升降之中，苦溫燥濕以啟脾陽、合辛香溫散以醒運(yùn)濕濁，甘淡微寒則能滲濕以通陽，配以甘味之和緩，使苦辛之味并行而不悖、溫涼之氣相反而繼相承，從而達(dá)到氣通則濕散、氣行則濕化、氣暢則濕除的目的。從歸經(jīng)來看（圖1），主要涉及肺、脾、胃等臟腑,并與心、腎、大腸、三焦、膀胱等多個(gè)臟腑關(guān)系密切，表明人體“水精四布，五經(jīng)并行”的津液有序代謝環(huán)境是由多臟腑共同參與完成的，其中“肺主治節(jié)”和“脾主運(yùn)化”的調(diào)節(jié)作用最為突出。

圖1 藿樸夏苓湯的藥物藥性和歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖（參照《中藥大辭典》）

2.2 構(gòu)建藿樸夏苓湯的“藥物組成-活性成分-對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

TCMSP[25]、BATMAN-TCM[26]和 TCMID[27]數(shù)據(jù)庫(kù)等均是基于國(guó)內(nèi)外多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)間的共享資源（包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)等）來預(yù)測(cè)中藥分子藥理機(jī)制的1 個(gè)重要且常用工具，在篩選多個(gè)中藥及相關(guān)成分靶點(diǎn)或疾病通路等信息方面具有一定的可靠性（表1）。本研究按照OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18、Caco-2 ≥ -0.4、HL ≥4 h 的ADME 主要標(biāo)準(zhǔn)，共檢索出藿樸夏苓湯的有效化合物成分共53個(gè)（圖2），包括半夏9個(gè)，豆蔻10個(gè)，茯苓 5 個(gè)，廣藿香 6 個(gè)，厚樸 1 個(gè)，苦杏仁 10 個(gè)，通草 2 個(gè)，薏苡仁 6 個(gè)，澤瀉 7 個(gè)，豬苓 7 個(gè)。其中，植物甾醇（Stigmastero）為半夏、苦杏仁、薏苡仁所共有，豆甾醇（Sitosterol）為苦杏仁、通草、薏苡仁、澤瀉所共有,槲皮素（Quercetin）為豆蔻、廣藿香所共有，（E）-11-二十烯酸（Gondoic acid）為半夏、苦杏仁所共有，麥角甾--7,22E-二烯-3-酮（Ergosta-7，22E-dien-3beta-ol）為豬苓和茯苓所共有成分，化合物CLR為苦杏仁和薏苡仁的共有成分，啤酒甾醇(Cerevisterol）為茯苓和豬苓的共有成分，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分的協(xié)同治療作用。通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)，共檢索出與上述53 個(gè)有效成分對(duì)應(yīng)的210個(gè)靶基因，通過統(tǒng)計(jì)我們發(fā)現(xiàn)，這些有效化合物成分和靶基因共發(fā)生606 個(gè)相互作用關(guān)系，即每個(gè)化合物成分平均作用11.4 個(gè)靶基因，每個(gè)靶基因平均聯(lián)系2.88 個(gè)化合物，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病多成分、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制。

表1 藿樸夏苓湯“有效成分—靶點(diǎn)”信息表

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

2.3 構(gòu)建藿樸夏苓湯“關(guān)鍵靶標(biāo)-器官組織”網(wǎng)絡(luò)

將藿樸夏苓湯作用的靶點(diǎn)蛋白輸入STRING，物種限定為“Homo sapiens”，探尋靶基因相互間的作用關(guān)系。除去TDRD7、DCAF5、DIO1、LYZL1等游離基因后，將STRING 生成的靶標(biāo)相互作用文件通過Cytoscape3.7.1 中的CytoNCN 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，發(fā)現(xiàn)有79 個(gè)基因滿足度（Degree，DC）、接近中心度（Betweeness，BC）、介度中心度（Closeness，CC）等拓?fù)鋮?shù)值大于中位數(shù)（參考值：degree=26，betweeness=75.063，closeness=0.5），這些基因可能是藿樸夏苓湯發(fā)揮藥效的關(guān)鍵靶點(diǎn)[28]（表1）。BioGPS 是一個(gè)聚集分布式基因注釋資源的中心基因入口，是當(dāng)前研究者常用于基因信息表達(dá)的可靠定位工具[29]。現(xiàn)將上述獲得關(guān)鍵基因?qū)雽?dǎo)入BioGPS，以獲取每個(gè)基因表達(dá)最多的前6 個(gè)器官組織。然后將結(jié)果輸入Cytoscape 3.7.1 構(gòu)建“關(guān)鍵靶點(diǎn)-器官組織”網(wǎng)絡(luò)圖，并參照Degree 值設(shè)定器官組織圖形大小，即器官組織圖形越大則涉及表達(dá)的關(guān)鍵基因數(shù)量就越多。由圖可見，藿樸夏苓湯主要通過作用肺臟、心臟、胰臟、支氣管上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝臟等臟器的關(guān)鍵基因發(fā)揮治療作用，這與前面通過藥物歸經(jīng)獲得的藿樸夏苓湯“整體觀念”指導(dǎo)下多臟腑調(diào)控防治疾病的結(jié)論相符。此外，值得注意的是，BioGPS 關(guān)鍵基因信息定位雖未涉及脾臟，但卻在與脾臟密切相關(guān)的CD33+Myeloid、CD34+、CD14+Monocytes、CD56+NKCells 等免疫細(xì)胞中高頻表達(dá)，這不僅從免疫角度驗(yàn)證了該復(fù)方“調(diào)脾”作用下“培土生金”治療新冠肺炎的理念，更重要的是表明了藿樸夏苓湯參與免疫調(diào)節(jié)的重要作用，從而為治療炎癥風(fēng)暴可行性提供生物學(xué)證據(jù)。

圖2 藿樸夏苓湯的“藥物-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

圖3 藿樸夏苓湯“關(guān)鍵靶標(biāo)-器官組織”網(wǎng)絡(luò)

圖4 “藿樸夏苓湯-新冠肺炎-炎癥風(fēng)暴”韋恩圖 圖5 藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 構(gòu)建藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

通 過 GeneCards 收 集 與“novel coronavirus pneumonia”“inflammatory storm”相關(guān)的 259 個(gè)、251 個(gè)靶點(diǎn)蛋白，將二者取交集得到50 個(gè)靶點(diǎn)，然后將交集靶點(diǎn)與藿樸夏苓湯的關(guān)鍵基因再次取交集，得到該復(fù)方治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的基因14個(gè)。將得到的“藥物-疾病”基因輸入STING，限定物種為“Homo sapiens”，得到藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴14個(gè)靶基因相互間的作用關(guān)系文件，然后輸入Cytoscape3.7.1，使其可視化，如圖5 所示，該網(wǎng)絡(luò)共有有14個(gè)節(jié)點(diǎn)、51條邊。

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析

將 2.4 得到的“藥物-疾病”基因，按照P＜ 0.05 篩選條件，GO 功能富集到938 個(gè)條目(暫無富集到細(xì)胞組成部分)，包括細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、白細(xì)胞與細(xì)胞粘附的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)的正調(diào)控、單核細(xì)胞趨化性等908 條生物過程以及細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸激酶活性、趨化因子活性等30 條分子功能。KEGG 通路分析富集到130 條通路，主要有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染、甲型流感、IL-17 信號(hào)通路、炎性腸?。↖BD）、PI3K-Akt 信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化、非小細(xì)胞肺癌、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用等通路關(guān)系密切?，F(xiàn)按照P值選取與藿樸夏苓湯藥物成分作用靶點(diǎn)最為密切的 GO 富集分析（BP、MF 各 20 條）和KEGG通路結(jié)果（20條），并使其可視化（圖6、圖7）。

2.6 構(gòu)建藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的“通路-靶點(diǎn)-活性成分”網(wǎng)絡(luò)

按照P值從小到大的順序，從富集到的藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的KEGG 通路中選取前20條，并將其與涉及的關(guān)鍵基因、有效化合物成分一并輸入Cytoscape3.7.1軟件，構(gòu)建“通路-靶點(diǎn)-活性成分”網(wǎng)絡(luò)（圖5）。所有通路、靶標(biāo)、成分的圖形大小參照Degree 值設(shè)置，即圖形越大則在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要。因此，Quercetin、Luteolin、Irisolidone 以及 RELA、CALM1、IL6、IL1B 等可能是藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的核心成分與靶標(biāo)。

2.7 藿樸夏苓湯活性化合物成分治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的分子對(duì)接結(jié)果

圖6 GO富集結(jié)果

圖7 KEGG通路富集結(jié)果

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ（ACE2）受體是SARS-CoV（2002）宿主細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)并進(jìn)行病毒復(fù)制所必須的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可作為S 蛋白的功能性受體[30]。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2（2019）與SARS-CoV（2002）相比，具有更強(qiáng)的與ACE2 受體相互結(jié)合的作用力[31]。近期的研究結(jié)果也表明ACE2可能參與是新冠肺炎炎癥風(fēng)暴發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[32]。因此，本研究將藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的主要化合物成分與ACE2 受體（PDB:1R42）、2019-nCoV 尖 峰 糖 蛋 白（2019-nCoV spike glycoprotein，基于Jason S.McLellan 團(tuán)隊(duì)提供的新型冠狀病毒表面S蛋白的近原子結(jié)構(gòu)PDB：6VSB）[33]進(jìn)行對(duì)接，評(píng)價(jià)并驗(yàn)證其臨床應(yīng)用的可行性。一般認(rèn)為配體與受體的結(jié)合能越低則構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性越大。有文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合能小于0 則預(yù)示著配體和受體可以自由結(jié)合[34]。將2.5 中前20 條通路涉及的藿樸夏苓湯治療新型冠狀肺炎炎癥風(fēng)暴的有效活性化合物與 ACE2 受體、2019-nCoV spike glycoprotein 進(jìn)行分子對(duì)接，其結(jié)果如下表2、圖9。其均能夠與ACE2受體自由結(jié)合，且具有與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道新冠肺炎常用的藥物如利巴韋林（-7.4 kcal·mol-1）、利托那韋（-6.1 kcal·mol-1）、法匹拉韋（-5.5 kcal·mol-1）相近或更好的結(jié)合能，這表明藿樸夏苓湯活性成分對(duì)治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴有效，為新藥的開發(fā)提供了思路。

3 結(jié)語

中醫(yī)認(rèn)為濕毒外邪入侵首傷肺衛(wèi)，繼而損及脾土，致使中焦脾胃氣機(jī)升降失調(diào)、津液代謝異常。病至中后期，或病及子臟加重肺失宣肅而水道失調(diào)，或傷及腎臟而損其主水的功能，最終導(dǎo)致內(nèi)外濕邪膠濁而熱毒驟生，漫灼臟腑、筋肉，出現(xiàn)熱、痰、喘以及神智異常等典型癥狀，正如清代王士雄云:“熱得濕而愈熾，濕得熱而愈橫……濕熱兩合，其病重而速”。調(diào)查研究顯示，新冠肺炎中后期，免疫功能失調(diào)下細(xì)胞因子的異常升高和免疫細(xì)胞的過度活化，除導(dǎo)致高熱外，肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞彌漫性損傷也能產(chǎn)生大量滲出液的聚集而阻塞氣道[35]。影像學(xué)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)重癥期患者雙肺呈彌漫性病變，雙側(cè)胸腔開始出現(xiàn)積液[36]。因此，針對(duì)新冠肺炎炎癥風(fēng)暴期的濕熱膠著之證，葉天士提出的“濕去熱孤”之法[3]，強(qiáng)調(diào)濕熱證治療應(yīng)以“治濕為本”。從藿樸夏苓湯組方的藥性和規(guī)律來看，該方在治肺的同時(shí)，兼顧心氣布散于表、腎之氣化與膀胱蒸化水液等功能，并重視運(yùn)用化濕、燥濕、利濕以健運(yùn)脾胃、補(bǔ)益正氣，體現(xiàn)了整體觀念指導(dǎo)下“驅(qū)濕邪而不傷正”的方藥辨治思路。從藿樸夏苓湯“關(guān)鍵靶點(diǎn)—器官組織”網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示來看，藿樸夏苓湯有效成分除主要作用肺、支氣管上皮細(xì)胞等臟腑組織外，其在脾參與調(diào)節(jié)的CD33+Myeloid、CD34+、CD14+Monocytes、CD56+NKCells 等免疫細(xì)胞中也呈現(xiàn)高頻表達(dá)，而這些細(xì)胞在此次新冠肺炎的炎癥風(fēng)暴中是產(chǎn)生IL-6和其他炎癥因子的主要部位[37]。

圖8 藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的“通路-靶點(diǎn)-活性成分”網(wǎng)絡(luò)

表2 藿樸夏苓湯活性化合物成分治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的分子與ACE2、2019-nCoV spike glycoprotein 對(duì)接結(jié)果

圖9 基于“通路-靶點(diǎn)-活性成分”的“核心成分與ACE2、與2019-nCoV spike glycoprotein 對(duì)接結(jié)果圖

本研究融合“通路-靶點(diǎn)-活性成分”后，發(fā)現(xiàn)藿樸夏苓湯中潛在治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的核心基因包括 RELA、CALM1、IL6、IL4、IL2、PRKCB、PRKCA 、IL1B、CDK4、CCL2、CXCL10、EGFR 等。其中，RELA調(diào)控抗中性粒細(xì)胞的凋亡，該蛋白活化不僅可導(dǎo)致促炎因子IL-17 上調(diào)，還能削弱KLF-2 的抑制促炎因子表達(dá)[38]。近期臨床報(bào)告顯示新冠肺炎危重癥感染者易患的ARDS，其機(jī)制可能與炎癥風(fēng)暴密切相關(guān)[39]，而在肺血管內(nèi)皮上高度表達(dá)的鈣調(diào)蛋白CALMI 和上皮生長(zhǎng)因子受體EFGR 則可能影響人的肺內(nèi)皮Ca2+信號(hào)小體-對(duì)肺動(dòng)脈高壓的影響而引發(fā)ARDS[40]。IL6、IL4、IL2 是作用于白細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的細(xì)胞因子，CCL2 和CXCL10 為常見的炎癥趨化因子，其在傳遞信息、介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化以及炎癥反應(yīng)中均具有重要作用。有報(bào)道顯示，與輕癥患者相比，重癥新冠肺炎患者的血漿中IL2，IL6，IL4 升高，炎癥反應(yīng)更劇烈[41,42]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CXCL10 被抗體中和后，肺水腫、炎性介質(zhì)釋放以及炎癥細(xì)胞聚集明顯緩解，預(yù)示著CXCL10 在炎癥風(fēng)暴中的促進(jìn)作用[43]。ROSE 等人的研究也證實(shí)CCL2 能夠募集炎癥細(xì)胞，并刺激其產(chǎn)生炎癥因子，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和Th2 極化而促炎[44]。此外，現(xiàn)代研究還發(fā)現(xiàn)CDK4 和PKC 家族的PRKCB、PRKCA 可通過影響細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)運(yùn)輸以及磷酸化過程的重要環(huán)節(jié)，為病毒復(fù)制和炎癥物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)提供條件[45-47]。綜上，藿樸夏苓湯可能通過細(xì)胞對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、白細(xì)胞與細(xì)胞粘附的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)的正調(diào)控、單核細(xì)胞趨化性等多途徑、多靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的目的，這與我們富集的結(jié)果相合。

現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 通過與器官組織的ACE2 受體結(jié)合而侵入人體，并且除了增加患者的病毒載量外，被病原體標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞（如肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞等）也會(huì)成為宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊的目標(biāo)，從而引發(fā)促炎反應(yīng)甚至更嚴(yán)重的器官水腫，這似乎意味著ACE2 可能是新冠肺炎炎癥風(fēng)暴機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)之一[32]。事實(shí)上，ACE2已被證實(shí)不僅可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)反應(yīng)，而且可以直接促進(jìn)血管重構(gòu)和預(yù)防與肺損傷有關(guān)的肺炎和分流，補(bǔ)充重組ACE2 可改善炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肺功能受損，對(duì)炎癥風(fēng)暴期急性肺損傷具有保護(hù)作用[48,49]。因此，尋求干預(yù)ACE2 介導(dǎo)SARS-CoV-2 的有效藥物，是新冠肺炎炎癥風(fēng)暴研究的方向。本研究將藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的核心成分槲皮素、木犀草素、黃芩素、利卡靈A 以及卡維丁等與ACE2受體以及ACE2 主要結(jié)合的2019-nCoV 尖峰糖蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，其結(jié)果顯示，這些核心成分均具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。其次，相繼有研究發(fā)現(xiàn)ADAM17 能夠?qū)CE2 的細(xì)胞質(zhì)尾部予以調(diào)控[50]；TMPRSS2 具有誘導(dǎo) ACE2 的進(jìn)行胞內(nèi)裂解[51]；Cathepsin 可以激活 SARS-S 進(jìn)而發(fā)生與ACE2 作用[52]，因此，我們認(rèn)為這些靶標(biāo)與 ACE2 協(xié)同介導(dǎo)了病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過程。而現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果證實(shí)，基于通路-靶點(diǎn)-活性成分得到的核心化合物成分，如槲皮素[53]、木犀草素[54]、黃芩素[55]、beta-谷甾醇[56]等可在一定程度上干預(yù)TMPRSS2、ADAM17、Cathepsin B/L 等蛋白酶的表達(dá)，進(jìn)而利于發(fā)揮抗炎作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)ACE2 受體除了在肺上皮細(xì)胞表達(dá)外，心、腎、內(nèi)皮、腸道器官組織也可表達(dá)[57,58]。從關(guān)鍵靶點(diǎn)作用的器官組織來看，藿樸夏苓湯涉及肺、支氣管上皮細(xì)胞、心、腎以及與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)的脾臟等多個(gè)臟器組織，可有效作用ACE2 受體，也為該方治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴可行性提供支持。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)分析了藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的分子基礎(chǔ)，揭示了藿樸夏苓湯抑制炎癥因子風(fēng)暴多成分、多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路的潛在作用機(jī)制，并對(duì)主要化合物成分進(jìn)行預(yù)測(cè)，為后續(xù)深入研究和新藥開發(fā)提供思路。但因TCMSP、BATMAN-TCM、TCMID 等數(shù)據(jù)庫(kù)中提供大部分活性化合物及作用靶點(diǎn)往往源于不同實(shí)驗(yàn)條件，并且受到研究熱點(diǎn)傾向性、資源共享受限的影響，使其準(zhǔn)確性、完整性等受到限制[59,60]。此外，中藥湯劑主要是口服給藥形式，那么藥物成分在體內(nèi)要經(jīng)過吸收、分布、代謝、排泄等生物過程才能發(fā)生作用，故需將中藥網(wǎng)絡(luò)藥理與藥物動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)進(jìn)行結(jié)合[61]。但當(dāng)前數(shù)據(jù)庫(kù)中活性化合物ADME 性質(zhì)以及類藥性等指標(biāo)預(yù)測(cè)所基于的數(shù)據(jù)庫(kù)資源不僅有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也有體外實(shí)驗(yàn)，而體外研究并不能全面反應(yīng)藥物的各種作用，缺乏整體藥物動(dòng)力學(xué)過程，難以全面的對(duì)藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)[62]。因此，藿樸夏苓湯治療新冠肺炎炎癥風(fēng)暴的作用機(jī)制和藥效評(píng)價(jià)需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究與臨床驗(yàn)證。