益腎健脾瀉濁中藥對(duì)慢性腎臟病妊娠大鼠腎臟NLRP3/caspase-1/IL-1β信號(hào)通路及細(xì)胞焦亡的影響＊

馮桃花，劉文康，武 寧，何 珍，徐賀鵬，周文平，梁文杰，2，許慶友，2，王 箏，2，王香婷，2＊＊

（1. 河北中醫(yī)學(xué)院 石家莊 050091；2. 河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石家莊 050091；3. 河北省中醫(yī)院 石家莊 050000）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）流行病學(xué)研究表明，女性CKD 患病率急劇增加，CKD 影響約3%的孕婦[1]。2018 年世界腎臟日“關(guān)注腎臟病，關(guān)注女性健康”的主題提示女性腎臟健康已經(jīng)成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。由于孕期腎臟血流動(dòng)力學(xué)以及自身免疫功能的改變使得腎臟處于高灌注、高凝和高濾過狀態(tài)，導(dǎo)致原有的腎臟病復(fù)發(fā)或加重[2-4]。有研究顯示，妊娠前腎功能較差的婦女在妊娠期間血肌酐和腎小球?yàn)V過率異常更顯著，蛋白尿、高血壓都會(huì)增加腎衰的風(fēng)險(xiǎn)[5]。相比較CKD 1-2期的患者，CKD 3-5期患者早產(chǎn)率、剖宮產(chǎn)率、5 min 新生兒評(píng)分和新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房住院率顯著增加[6]，妊娠成為CKD 發(fā)生發(fā)展的重要因素。前期研究發(fā)現(xiàn)，妊娠誘導(dǎo)大鼠醛固酮分泌增多[7]，誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程[8]，同時(shí)觀察到腎小球大量巨噬細(xì)胞聚集。在此基礎(chǔ)上，本課題研究妊娠加重腎臟損傷的可能機(jī)制誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NLRP3 炎癥小體活化，炎性介質(zhì)釋放，加重腎臟損傷。同時(shí)闡述以“脾腎虧虛，濁毒內(nèi)蘊(yùn)”為病機(jī)，以NF-κB/NLRP3/caspase-1/IL-1β為路徑，給予醛固酮受體阻斷劑及益腎健脾瀉濁中藥治療,探討益腎健脾瀉濁中藥對(duì)慢性妊娠腎病腎臟的保護(hù)作用以及對(duì)腎臟細(xì)胞焦亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及用藥

雌性Wistar大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，其中雌性未經(jīng)產(chǎn)大鼠90 只，雄性大鼠20只，8周齡，體質(zhì)量（160±20）g。依普利酮購于美國輝瑞制藥有限公司（生產(chǎn)批號(hào)024306），規(guī)格50 mg/片。益腎健脾瀉濁中藥藥物組成：黃芪20 g，當(dāng)歸5 g，白芍12 g，山藥15 g，桑寄生12 g，山茱萸15 g，土茯苓20 g，澤瀉15 g，運(yùn)用神威藥業(yè)免煎中藥配方顆粒(生產(chǎn)批號(hào)17103061，17102361，17091411，17062111，17052714，17081151，17061251，17032651），將藥物混勻煎煮15 min，配成混懸液。

1.2 主要試劑與儀器

NF-κB p65 抗 體（servicebio 公 司 ，生 產(chǎn) 批 號(hào)181905）；NLRP3 抗體（novus 公司，生產(chǎn)批號(hào) IMG-6665A）；Caspase-1 抗體（proteintech 公司，生產(chǎn)批號(hào)00019089）；IL-1β抗 體（abcam 公 司 ，生 產(chǎn) 批 號(hào)309542-23）；GAPDH 抗體（bioworlde 公司，生產(chǎn)批號(hào)54162）；TUNEL 試 劑 盒（Eterlife 公 司 ，生 產(chǎn) 批 號(hào)11422200）；Cr 試劑盒貝克（曼庫爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)AUZ3562）；BUN 試劑盒（曼庫爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)AUZ3611）；TP 試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司，生產(chǎn)批號(hào)23227）；ALD試劑盒（天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)RA21810）。小型垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)印槽為Bio-Rad公司產(chǎn)品；病理圖文分析系統(tǒng)DP7 2CCD，顯微照相儀、BX53 顯微鏡產(chǎn)于 Olympus 公司；γ-放射免疫計(jì)數(shù)器FJ-2021，西安二六二廠。

2 方法

2.1 模型建立及動(dòng)物分組

在前期實(shí)驗(yàn)中，慢性腎臟病動(dòng)物模型主要參考Truong LD[9]等所寫文獻(xiàn)通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)制備[10],并觀察UUO 術(shù)后 1、2、4、8、12 周大鼠腎臟病理變化及血肌酐、尿素氮變化。結(jié)果顯示：損傷至4 周，腎臟病理為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，細(xì)胞增殖，腎功能無變化；損傷至8周，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎功能改變；12周大鼠血肌酐、尿素氮變化明顯。研究顯示，能否順利妊娠與腎損傷程度相關(guān)，CKD1-2期，Scr ＜ 1.4 mg?dL-1，血壓控制良好者，妊娠后GFR 變化不明顯；CKD3-5期，Scr ＞ 1.4 mg?dL-1患者，高血壓和先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)顯著增高，甚者導(dǎo)致腎衰竭。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，首先，UUO 術(shù)后56天Scr與CKD3-5期腎臟損傷Scr值相符；其次，根據(jù)大鼠2.5-3年壽命，折算人類壽命80歲，大鼠56天大約為人類4-5年，符合慢性腎病病程（參考秦川主編的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》）。綜上，我們選擇UUO 術(shù)后56 天復(fù)制慢性腎病模型，同時(shí)進(jìn)行妊娠，復(fù)制CKD妊娠模型。

雌性Wistar 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為6組：正常妊娠組（SP）、單側(cè)輸尿管結(jié)扎組（UUO）、UUO+ 妊娠組（UP）、UUO+ 妊娠 + 依普利酮組（EPL）、UUO+妊娠 +益腎健脾瀉濁方（TCM），每組各15 只；另取15 只作為對(duì)照組（Sham）。UUO 組采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)復(fù)制慢性腎病模型，UUO 術(shù)后，EPL 組大鼠給予依普利酮100 mg?（kg?天）-1灌胃，TCM 組大鼠給予益腎健脾瀉濁中藥 3.11 g?（kg?天）-1（臨床上按成人換算劑量轉(zhuǎn)換系數(shù)6.25/114 g/天）灌胃。同時(shí)，Sham組給予相同體積的生理鹽水。慢性腎病模型制備后8周，妊娠組及治療組大鼠陰道涂片，動(dòng)情前期、動(dòng)情期進(jìn)行合籠，記錄陰栓脫落為妊娠第1天，妊娠第19 天處死母鼠。實(shí)驗(yàn)過程中，UUO 組因感染死亡 2 只，EPL 組死亡 1 只，UP 組死亡 1 只，因流產(chǎn)TCM組死亡1只，動(dòng)物造模成功85只。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)及方法

對(duì)照組及其他分組大鼠妊娠第18天最后1次灌胃后禁食并將其放入代謝籠，收集24 h尿液，1500 r?min-1離心5 min 分裝，凍存至-20℃，用于檢測(cè)24 h 尿蛋白。次日10%水合氯醛0.04 mL?g-1體重腹腔注射麻醉后，股動(dòng)脈取血，將血液收集到無菌管中，室溫靜置20 min，4℃和8000 r?min-1條件下離心10 min，取上層血清后-4℃存儲(chǔ)，用于檢測(cè)血清醛固酮、血肌酐、尿素氮。摘取雙側(cè)腎臟，對(duì)比拍照后，將健側(cè)腎臟浸入4%多聚甲醛 48 h，用于病理學(xué) HE、Masson、TUNEL 及免疫組化染色，部分腎組織-70℃保存行蛋白檢測(cè)。

2.2.1 腎臟組織病理染色

石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟3 × 15 min，梯度濃度乙醇進(jìn)行水化，進(jìn)行蘇木精-曙紅染色、Masson 三色染色，觀察腎組織病理變化及評(píng)估纖維化水平。

2.2.2 各組大鼠醛固酮表達(dá)情況

檢測(cè)各組大鼠的血清醛固酮及腎腎組織醛固酮含量，按照檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.2.3 各組大鼠腎功能、24 h尿蛋白定量

按照血清檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐（Scr）的水平，尿素酶-谷氨酸脫氫酶法測(cè)定尿素氮（BUN）水平，使用BCA 法進(jìn)行24 h尿蛋白定量測(cè)量。

2.2.4 腎臟組織TUNEL染色

腎臟組織切片后經(jīng)二甲苯脫蠟，酒精梯度水化，消除內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸緩沖液微波高火力1 min 進(jìn)行破膜，孵育20%牛血清室溫30 min 封閉組織，加入反應(yīng)液（Enzy∶Lable=1∶9），陽性對(duì)照組只加入Lable，37℃孵育 60 min，PBS 清洗，滴加過氧化物酶（POD）37℃孵育 60 min，PBS 浸洗；鏡下觀察 DAB 顯色，呈現(xiàn)淺黃色底色清水終止反應(yīng)，蒸餾水沖洗5 min，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水透明封片；光鏡下觀察細(xì)胞核呈棕黃色為陽性表達(dá)，隨機(jī)觀察鏡下（×400）不重復(fù)的20個(gè)視野，由焦亡細(xì)胞與總腎細(xì)胞的比率來計(jì)算腎細(xì)胞焦亡水平。

2.2.5 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎組織NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)

切片，二甲苯10 min 脫蠟，梯度酒精脫水，加入3%過氧化氫15 min 以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，浸泡在枸櫞酸緩沖液中，微波爐高火力20 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫冷卻，PBS清洗后用山羊血清10 min處理以減少非特異性結(jié)合。將切片與一抗NF-κB p65（1∶500）、NLRP3（1∶2 00）、Caspase-1（1∶200）、IL-1β（1∶100）在4℃過夜；用酶標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物進(jìn)行二抗孵育，37℃孵育 15 min，PBS 清洗，滴加 SABC 復(fù)合物，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核；酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；鏡下觀察細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色深染為陽性表達(dá)。

2.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)腎組織NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)

稱量等量腎臟組織，采用4：1 比例加入裂解液裂解組織蛋白及蛋白酶抑制劑，在冰上剪碎組織，微波粉粹儀進(jìn)行勻漿后靜止30 min，4℃，8000 r?min-1離心10 min，靜置15 min，提取上清并采用4∶1 比例加入蛋白緩沖液，煮蛋白5min 后進(jìn)行分裝并置-80℃凍存。起始以20 ug 蛋白進(jìn)行上樣，90-120 V 電泳，半干轉(zhuǎn)膜25 min，室溫5%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗鼠一抗NF-κBp65（1∶500）、NLRP3（1∶1000）、Caspase-1（1∶500）、IL-1β（1∶1000），同時(shí)用 GAPDH（1∶20000）作為內(nèi)參校正。4℃孵育過夜或室溫孵育2 h，TBST 清洗8 min*3 次，室溫孵育羊抗兔二抗（1∶20000）2 h，TBST清 洗 8 min*3 次 ，TBS 清 洗 1 次 。 使 用 Image studio Ver5.2系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示連續(xù)變量，符合正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇單因素方差分析，采用單因素方差分析SNK 法比較6組間差異。不符合正態(tài)檢驗(yàn)條件采用秩和檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane、Dunnett T3方法統(tǒng)計(jì)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變

Sham 組腎小管形態(tài)正常，觀察到微量炎癥細(xì)胞。SP組病理炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加。UUO、UP組出現(xiàn)嚴(yán)重的腎小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞脫落，細(xì)胞腫大，胞核染色質(zhì)濃縮，染色質(zhì)邊集或細(xì)胞核消失，腎間質(zhì)大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管形態(tài)不完整。兩組相比較，UP 病理改變明顯。與UP組比較，EPL、TCM組病理損傷減輕（圖1）。

圖1 依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織病理形態(tài)改變（×400）

Masson 三色染色顯示，與 Sham 組對(duì)比，UUO 組腎小管間質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)纖維化明顯，UP 組進(jìn)一步加重，通過EPL、TCM治療后腎纖維化明顯減少。

3.2 各組大鼠醛固酮含量測(cè)定

血清醛固酮及腎組織醛固酮含量評(píng)估鹽皮質(zhì)激素受體活化情況，與Sham 組相比SP有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；UUO組醛固酮顯著增加（P＜0.05），UP組較UUO 組表達(dá)明顯（P＜0.05），兩給藥組醛固酮含量顯著下降（P＜0.05）。腎組織醛固酮檢測(cè)結(jié)果顯示，較Sham 組比較，SP 組表達(dá)增加，UP 組與 UUO 組比較顯著增加（P＜ 0.05），兩給藥組均顯著下調(diào)（P＜ 0.05），組間無明顯差異（表1、圖2）。

3.3 各組大鼠腎功能及24 h尿蛋白含量

運(yùn)用血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）及24 h尿蛋白評(píng)估腎臟損傷，與Sham 組相比，BUN 及24 h 尿蛋白兩個(gè)指標(biāo)SP 組水平顯著升高（P＜ 0.05），Scr 水平增加，但無明顯差異。UUO 組各腎功能指標(biāo)明顯增加（P＜0.05），表明成功通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)建立慢性腎病模型，與 UUO 組相比，UP 組 Scr、BUN 及 24 h 尿蛋白定量明顯升高（P＜ 0.05），EPL 組和TCM 組BUN、24 h尿蛋白定量顯著下降（P＜0.05），但組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明兩用藥組對(duì)慢性腎病妊娠導(dǎo)致的腎功能損傷有保護(hù)作用（表2、圖3）。

表1 依普利酮及中藥治療改善CKD妊娠大鼠醛固酮含量(,n = 8)

表1 依普利酮及中藥治療改善CKD妊娠大鼠醛固酮含量(,n = 8)

注：與Sham組比較，＃P ＜ 0.05；與SP組比較，▲P ＜ 0.05；與UUO組比較，▽P ＜ 0.05；與UP組相比，*P ＜ 0.05

腎組織醛固酮/（ng?mL-1）0.593±0.126 0.797±0.139 1.007±0.255#▲1.587 ± 0.300#▲▽0.913±0.216#*1.001±0.308#*Group Sham SP UUO UP EPL TCM血清醛固酮/（ng?dL-1）7.625±0.475 8.486±0.549 11.336±0.549#▲12.816 ± 0.785#▲▽10.943±0.621#*11.288±0.514#*

圖2 依普利酮及中藥治療改善CKD妊娠大鼠醛固酮含量

表2 依普利酮及中藥治療改善CKD妊娠大鼠腎功能(,n = 8)

表2 依普利酮及中藥治療改善CKD妊娠大鼠腎功能(,n = 8)

注：與Sham組比較，＃P ＜ 0.05；與SP組比較，▲P ＜ 0.05；與UUO組比較，▽P ＜ 0.05；與UP組相比，*P ＜ 0.05

24 h尿蛋白/（g?24 h-1）1.518±0.578 1.547±0.438#2.433±0.593#▲3.352 ± 0.625#▲▽2.352 ± 0.863#▲*2.435 ± 0.864#▲*Group Sham SP UUO UP EPL TCM尿素氮/（mmol?L-1）6.252±0.993 6.873±0.803#7.705± 0.896▲#8.557 ± 0.723#▲▽7.998±1.055#▲8.299±1.091#▲血肌酐/（μmol?L-1）56.958±5.067 61.716±6.712 65.261±5.489#73.849 ± 5.721#▽▲63.086±11.590*64.811±4.604#*

3.4 TUNEL 染色檢測(cè)各組大鼠腎臟組織細(xì)胞DNA 損傷情況

SP 組較 Sham 組 TUNEL 陽性細(xì)胞表達(dá)增多（P＜0.05）；與 SP 組比較，UP 組 TUNEL 染色的細(xì)胞陽性率明顯升高（P＜0.05），主要位于擴(kuò)張的遠(yuǎn)端小管；與UP組比較，EPL、TCM 組的細(xì)胞陽性率較UP 明顯下降（P＜ 0.05）（表3、圖4）。

3.5 各組大鼠腎臟NF-κB p65表達(dá)情況

Sham 組大鼠腎臟NF-κBp65 在遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中呈弱表達(dá)，與Sham 組比較，SP 組表達(dá)增加；與UUO 組比較，UP組表達(dá)增強(qiáng)（P＜ 0.05）；EPL、TCM 組與UP 組比較表達(dá)范圍及強(qiáng)度均明顯減弱（P＜0.05）（圖5-圖6）。

表3 TUNEL檢測(cè)依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎臟細(xì)胞DNA損傷情況, n = 8

表3 TUNEL檢測(cè)依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎臟細(xì)胞DNA損傷情況, n = 8

注：與Sham組比較，＃P ＜ 0.05；與SP組比較，▲P ＜ 0.05；與UUO組比較，▽P＜0.05；與UP組相比，*P ＜ 0.05

TUNEL陽性細(xì)胞率/%0.254±0.048 0.365±0.082 0.610 ± 0.075#▲*0.782 ± 0.024#▲▽0.578 ± 0.027#▲*0.605 ± 0.051#▲*Group Sham SP UUO UP EPL TCM

3.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠腎臟NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路分子表達(dá)情況

Sham 組大鼠腎臟 NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(dá)較弱；SP 組表達(dá)增強(qiáng)；UUO 組及UP 組表達(dá)明顯增強(qiáng)，UP 組表達(dá)陽性表達(dá)強(qiáng)于 UUO 組；與 UP 組比較，EPL、TCM 組表達(dá)均明顯減弱。NLRP3 主要表達(dá)于腎組織浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞；Caspase-1 和IL-1β表達(dá)于腎遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞胞漿（圖7）。

圖3 依普利酮及中藥治療改善CKD妊娠大鼠腎功能

圖4 TUNEL檢測(cè)依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織DNA損傷情況（TUNEL，×400）

圖5 依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織NF-κBp65在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)（SABC，×400）

圖6 Western blot 檢測(cè)依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎臟NF-κBp65表達(dá)

3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)各組大鼠腎臟NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況

與Sham 組比較，SP 組各項(xiàng)指標(biāo)表升高，其中NLRP3、Caspase-1、IL-1β明顯升高（P＜ 0.05）；與UUO組 比 較 ，UP 組 大 鼠 腎 臟 NLRP3、Pro-caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β蛋 白 表 達(dá) 增 強(qiáng)（P＜0.05）；與 UP 組比較，EPL、TCM 組各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)明顯下調(diào)（P＜ 0.05）（表4、圖8-圖10）。

4 討論

圖7 依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)

表4 Western blot 檢測(cè)依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β蛋白表達(dá),n = 8

表4 Western blot 檢測(cè)依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β蛋白表達(dá),n = 8

注：與Sham組比較，＃P ＜ 0.05；與SP組比較，▲P ＜ 0.05；與UUO組比較，▽P ＜ 0.05；與UP組相比，*P ＜ 0.05

IL-1β/GAPDH 0.036±0.002 0.043±0.004#0.053±0.003#▲0.065 ± 0.004#▲▽0.045± 0.007▽*0.033± 0.004▲▽*Group Sham SP UUO UP EPL TCM NLRP3/GAPDH 0.247±0.038 0.308±0.028 0.502±0.017#▲0.717 ± 0.041#▲▽0.390± 0.048▽*0.450 ± 0.049#▲▽*Pro-caspase-1/GAPDH 1.023±0.180 1.070±0.210 1.456±0.160#▲1.668 ± 0.130#▲▽1.184±0.150▽*0.975±0.130▽*Caspase-1/GAPDH 0.301±0.110 0.512±0.220 0.740±0.210#0.984 ± 0.060#▲▽0.563 ± 0.220#▽*0.049 ± 0.120#▽*Pro-IL-1β/GAPDH 0.283±0.021 0.415±0.043 0.605±0.029#▲0.779 ± 0.043#▲▽0.432±0.069#*0.532±0.036#*

圖8 Western blot檢測(cè)依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織NLRP3蛋白表達(dá)

妊娠期心輸出血量增加，腎臟代償性體積增大30%，有效腎血漿流量平均增加70-80%，腎小球?yàn)V過率增加50%。在妊娠期，凝血因子Ⅰ-纖維蛋白原Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ增加,出現(xiàn)高凝狀態(tài)。使腎臟處于高灌注、高濾過、高凝狀態(tài)[11]，可造成CKD 患者腎臟器質(zhì)性損害，使原有腎臟病變加重。慢性腎臟病妊娠患者易發(fā)妊娠期高血壓疾病，其機(jī)制與RAAS 系統(tǒng)失衡有關(guān)。隨著RAAS 的深入研究，發(fā)現(xiàn)下游的醛固酮可能發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用。CKD 妊娠期間，醛固酮水平升高使得血漿容量增加，對(duì)于維持循環(huán)血容量，血壓和子宮胎盤灌注至關(guān)重要[12]。腎臟損傷可激活RAAS，介導(dǎo)腎源性腎素分泌增多與胎盤產(chǎn)生雌激素作用于肝臟[13]，促進(jìn)血管緊張素酶解，因而促進(jìn)RAA S 主要效應(yīng)分子AngⅡ的增加，發(fā)揮收縮血管，升高血壓的作用。且有研究顯示，醛固酮結(jié)合鹽皮質(zhì)激素受體引起腎損傷[14]，給以醛固酮受體阻斷劑可以減輕糖尿病腎病[15]、慢性腎病、腎臟纖維化改變[16]。同時(shí)，醛固酮可介導(dǎo)炎性巨噬細(xì)胞聚集，上調(diào)炎性因子表達(dá)，激活NLRP3 炎癥小體，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。

NLRP3 炎癥小體識(shí)別受損和垂死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，在調(diào)節(jié)CKD 腎臟炎癥中發(fā)揮作用[17]。NF-κB 信號(hào)通路活化及損傷相關(guān)分子模式（PAMPs）可為NLRP3提供激活信號(hào)，NLRP3激活后發(fā)生自身寡聚化，募集ASC 及Pro-caspase-1 組裝成為炎癥小體，Pro-caspase-1 自身剪切成為成熟的Caspase-1，活化的 Caspase-1 切割 Pro-IL-1β和 Pro-IL-18，產(chǎn)生成熟的具有生物學(xué)活性的 IL-1β和 IL-18[18]。Toshiki 等據(jù)報(bào)道，醛固酮可誘導(dǎo)大鼠NLRP3炎性體表達(dá)增加并導(dǎo)致腎細(xì)胞焦亡[19]。細(xì)胞焦亡（Pyroptosis）是1 種新型促炎程序性細(xì)胞死亡，介于凋亡和壞死之間，其特征是DNA 損傷和膜穿孔[20]，由 Caspase-1 介導(dǎo)，焦亡細(xì)胞TUNEL 染色陽性，提示其DNA 發(fā)生斷裂損傷。NLRP3/ASC/Caspase-1/IL-1β/IL-18 軸活化誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，加重腎臟炎癥損傷。

圖9 Western blot檢測(cè)依普利酮及中藥治療妊娠大鼠腎組織Pro-caspase-1、Caspase-1蛋白表達(dá)

圖10 Western blot 檢測(cè)依普利酮及中藥治療CKD妊娠大鼠腎組織Pro-IL-1β、IL-1β蛋白表達(dá)

妊娠加重慢性腎病腎臟損傷，屬于中醫(yī)“子滿”“子眩”“虛勞”“胎氣”等。臨床主要癥狀為水氣，身重且以腰下腫甚，小便不利，水道不通，陽虛水濕不化，水濕內(nèi)停，化生濁毒。根據(jù)慢性腎病發(fā)病特點(diǎn)，結(jié)合妊娠的特殊生理變化，素體脾腎虧虛，孕后血聚養(yǎng)胎，胎兒奪精傷母，氣血虧耗，唐·昝殷所著《經(jīng)效產(chǎn)寶》亦認(rèn)為，“臟氣本弱，因產(chǎn)重虛，土不克水。血散入四肢，遂致腹脹，手足面目皆浮腫，小便秘澀”。根據(jù)慢性腎臟病脾腎虧虛，濁毒內(nèi)蘊(yùn)的病機(jī)，結(jié)合妊娠特殊的生理變化，治療以治病與安胎并舉，確立益腎健脾瀉濁法，方藥由黃芪、當(dāng)歸、白芍、山藥、山茱萸、桑寄生、土茯苓、澤瀉組成。方中以補(bǔ)五臟諸虛的黃芪，補(bǔ)益脾腎，為君藥。山茱萸補(bǔ)養(yǎng)肝腎，取“肝腎同源”之意；配伍山藥補(bǔ)益脾陰，亦能固腎，共為臣藥。孕后氣以載胎，血以養(yǎng)胎，方中黃芪與當(dāng)歸以5∶1 的比例配伍，寓“當(dāng)歸補(bǔ)血湯”補(bǔ)益氣血之意，扶助正氣，有形之血生于無形之氣，使氣旺血生。白芍養(yǎng)血益陰，為血中之血藥配當(dāng)歸，加強(qiáng)補(bǔ)血之力；配伍桑寄生補(bǔ)腎安胎。本虛得固，胎兒得養(yǎng)。黃芪益氣推動(dòng)水液運(yùn)行，兼可利水。配伍澤瀉，以其甘淡，直達(dá)腎與膀胱，利水滲濕而泄腎濁。佐入土茯苓，味甘、淡，性平，入絡(luò)以滲利下導(dǎo)為務(wù)，以去濕濁。諸藥配伍，標(biāo)本兼顧。全方共奏益氣健脾、養(yǎng)血瀉濁之功，采用此方加減治療慢性腎炎、腎病綜合征緩解期妊娠病人，尿蛋白未見增多，亦未出現(xiàn)妊娠中毒癥狀。本方的配伍特點(diǎn)：一是脾腎同治，重點(diǎn)在后天，使脾旺則氣血生化有源，氣行則濕化。二是氣血并補(bǔ)，但重在補(bǔ)氣，意在氣為血之帥，氣旺則血自生，血足則胎兒有所養(yǎng)。三是補(bǔ)益與祛濕并行，佐以澤瀉、土茯苓甘淡利濕，表邪得去。

現(xiàn)代研究顯示，黃芪具有抗炎、抗氧化應(yīng)激損傷、免疫調(diào)節(jié)等作用，黃芪甲苷有效降低妊娠期高血壓，緩解血管內(nèi)皮損傷引起的氧化應(yīng)激和炎癥因子水平，改善腎組織細(xì)胞損傷[21]。黃芪可有效改善創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠腸黏膜免疫功能及NLRP3 炎癥小體的致炎作用[22]。Deng YP 等發(fā)現(xiàn)白芍總苷可下調(diào)NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC 蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞焦亡通路[23]。土茯苓具有清熱解毒、除濕、通利關(guān)節(jié)等作用，臨床廣泛應(yīng)用于治療慢性腎衰竭，現(xiàn)代研究表明其具有抗抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等豐富的藥理學(xué)活性[24]。臨床上采用此法加減治療慢性腎炎、腎病綜合征妊娠病人，獲得較為滿意的臨床效果。

在本研究中，單側(cè)輸尿管梗阻妊娠大鼠增加醛固酮分泌，結(jié)合鹽皮質(zhì)激素受體，進(jìn)一步使NF-κB 信號(hào)通路活化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NF-κB P65 主要在腎遠(yuǎn)端小管，蛋白表達(dá)同步增加，促進(jìn)Pro-IL-1β等炎性因子的分泌；同時(shí)NLRP3/caspase-1/IL-1β信號(hào)通路蛋白表達(dá)增加，提示NLRP3 炎癥小體及Caspase-1 前體及成熟的蛋白活化，促進(jìn)Pro-IL-1β切割成為具有致病力的IL-1β炎癥因子的產(chǎn)生。結(jié)果說明，單側(cè)輸尿管梗阻妊娠大鼠腎臟中存在焦亡，并且提示炎癥小體家族中NLRP3 炎癥小體是焦亡的重要標(biāo)志，NLRP3 炎癥小體蛋白的增加促進(jìn)IL-1β炎癥因子表達(dá)；同時(shí)，TUNEL染色觀察DNA 損傷情況進(jìn)一步佐證這一結(jié)論，單側(cè)輸尿管梗阻大鼠DNA 斷裂百分比上升，UP 組較UUO 組陽性細(xì)胞數(shù)量增加13%，說明腎臟梗阻可以誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞焦亡，妊娠是加重慢性腎病的獨(dú)立因素。MR 阻斷劑依普利酮及益腎健脾瀉濁方藥有效改善NF-κB 及NLRP3／caspase-1／IL-1β信號(hào)通路蛋白表達(dá)，提示可以通過鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑（EPL）抑制鹽皮質(zhì)激素受體及以上蛋白的表達(dá)，減少其下游炎性介質(zhì)的釋放。進(jìn)一步說明，慢性腎病患者妊娠刺激Ald 分泌增多，通過MR 活化-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)-NF-κB/NLRP3-細(xì)胞焦亡為途徑介導(dǎo)炎性損傷。

據(jù)此，慢性腎病妊娠上調(diào)醛固酮含量，通過NF-κB 信號(hào)通路及 NLRP3/Caspase-1/IL-1β軸,誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，調(diào)控腎臟炎癥損傷。醛固酮阻斷劑依普利酮可以有效的通過抑制Ald-MR/NF-κB/NLRP3-Caspase-1-IL-1β通路。益腎健脾瀉濁中藥可抑制NF-κB通路和NLRP3 炎癥小體活化，減少誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，減輕炎癥損傷，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。