lnc1343對小鼠胚胎干細胞多能性的影響及其基因座潛在作用機制

陳紹恢， 蘇光松， 陳 軍， 呂萬革

(南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 天津 300071)

小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell， ESC) 是20世紀80年代首次從小鼠囊胚期內(nèi)細胞團(inner cell mass)分離得到，具有在體外保持不分化的無限增殖能力；在胎鼠或成鼠體內(nèi)胚胎干細胞可以分化形成各種細胞類型；在合適的培養(yǎng)條件下，胚胎干細胞可以定向誘導(dǎo)分化形成多種細胞類型[1-2].正是由于胚胎干細胞這種具有在體外培養(yǎng)下保持未分化狀態(tài)的增殖能力及分化為多種細胞類型的潛能，使之成為一種研究哺乳動物細胞分化、組織形成過程的基本體系，以及臨床移植治療的新的細胞來源.ESC在發(fā)育生物學(xué)研究、藥物發(fā)現(xiàn)以及細胞移植治療等方面都有著巨大的應(yīng)用價值.三個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子—Nanog、Oct4和Sox2，形成了一個核心的調(diào)控環(huán)路，以維持 ESC 的多能性[3-6].

對基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀遺傳組等測序數(shù)據(jù)的研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物基因組中編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域只占基因組區(qū)域的1%～2%，大量的區(qū)域不編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)，但會轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA分子，其中一類長度大于200 nt的RNA分子稱為長非編碼RNA(long non-coding RNA， lncRNA)[7].lncRNA在真核生物基因組中廣泛轉(zhuǎn)錄，并且能夠在多種層次以靈活的方式對基因表達進行調(diào)控.越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在維持ESC自我更新和多能性中發(fā)揮了重要的作用.核定位的lncRNA可以通過結(jié)合或者靶定特異性的染色質(zhì)修飾因子、抑或作為支架結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，而質(zhì)定位的lncRNA可以與microRNA相互作用來調(diào)節(jié)ESC的多能性，如lncRNA可以作為海綿體(Sponge)的結(jié)構(gòu)吸附或者與某些microRNA相互結(jié)合從而干擾microRNA的功能來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的翻譯，進而調(diào)節(jié)ESC的多能性[8-11].lnc1343基因定位于小鼠4號染色體，基因全長1 699 bp，在基因組中可以通過反向DNA鏈轉(zhuǎn)錄出一條437 nt的lncRNA(即lnc1343)，而且lnc1343不僅定位于細胞核，在細胞質(zhì)中也有分布[12-13].近些年來，越來越多的研究表明lnc1343通過影響細胞的增殖和遷移等在許多惡性腫瘤的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，而且lnc1343還可以作為腫瘤惡性程度和預(yù)后不良的生物標志物[14-17].此外，Guttman等通過shRNA篩選并通過與全基因組微陣列雜交的方式鑒定了26條與小鼠ESC多能性相關(guān)的lncRNA，而lnc1343即為這26條之一，表明了lnc1343在小鼠ESC多能性維持中有可能發(fā)揮了重要功能，但是其具體的機制尚不是很清楚[11].

在本研究中，利用CRISPR-cas9敲除技術(shù)，發(fā)現(xiàn)lnc1343敲除細胞系中Nanog、Sox2和Oct4等多能性因子的表達水平顯著降低.此外，在小鼠ESC中過表達lnc1343，發(fā)現(xiàn)小鼠ESC中Nanog、Sox2和Oct4等多能性因子表達水平顯著升高，表明lnc1343對于小鼠ESC的多能性維持發(fā)揮了重要的作用.而且，本實驗還發(fā)現(xiàn)lnc1343可以調(diào)節(jié)鄰近基因Rcc1(regulator of chromosome condensation 1)的表達，進一步通過Chip-seq分析發(fā)現(xiàn)lnc1343以及鄰近區(qū)域富含增強子樣的序列.最后，本實驗利用Capture-C實驗發(fā)現(xiàn)，lnc1343基因座與多個不同基因的啟動子序列具有相互作用，表明lnc1343基因位點可以通過染色質(zhì)長距離相互作用來調(diào)節(jié)基因的表達.綜上所述，lnc1343不僅可以通過轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)ESC的多能性，還可以通過其基因座位點遠距離相互作用來調(diào)節(jié)基因的表達.

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

小鼠E14細胞系培養(yǎng)于常規(guī)干細胞培養(yǎng)基中，其中培養(yǎng)基成分如下：DMEM (C11995500BT， Gibco)、15%胎牛血清(Fetal Bovine Serum， FBS500-S， AusGeneX， Australia)、100 μmol·L-1非必需氨基酸(non-essential amino acids， NEAA)、5 000 U·mL-1雙抗(penicillin/streptomycin， 15140-122， Gibco)、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺(2503081， Gibco)、0.1 mmol·L-1β-巰基乙醇(M3148， Sigma， USA)、1000 U·mL-1LIF (ESG1107， Millipore).細胞培養(yǎng)箱(INCO153， Memmert， Germany)溫度恒定在37 ℃，CO2體積分數(shù)恒定為5%，濕度恒定為95%.

1.2 兩種lnc1343敲除細胞系和過表達細胞系的構(gòu)建

1.2.1 lnc1343基因座敲除細胞系的構(gòu)建 如圖1A所示，在lnc1343基因座兩端各設(shè)計一個sgRNA，合成后連接到pX330質(zhì)粒載體中.利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 (L3000015， Thermo Scientific， USA)將含有sgRNA的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的E14細胞中(WT細胞中轉(zhuǎn)染對應(yīng)的空載體質(zhì)粒用于對照組)，24 h后加入1 μg·mL-1嘌呤霉素，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，然后將剩余的細胞收集后重新轉(zhuǎn)入10 cm的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)5 d.待克隆生長到合適大小后，挑取單克隆細胞到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng).待細胞長滿后，收取部分細胞進行RT-qPCR和DNA擴增跑膠進行鑒定并挑選出敲除的克隆.

1.2.2 lnc1343轉(zhuǎn)錄起始位點(transcription start site， TSS)敲除細胞系的構(gòu)建 如圖1B所示，在lnc1343基因TSS兩端再次設(shè)計兩個sgRNA，為了盡可能不干擾lnc1343基因座的功能，兩個sgRNA之間的片段要盡可能短一些.設(shè)計完成后按照1.2.1所述的方法進行細胞轉(zhuǎn)染并篩選獲得敲除的克隆.

1.2.3 lnc1343過表達細胞系的構(gòu)建pCAGIPuro 為了構(gòu)建lnc1343過表達細胞系，在lnc1343 cDNA兩端設(shè)計兩條合適的引物(Forward primer:GACTTCCGGGCGTTACTTAAG; Reverse primer: AGACATTCAAATGCTTTAATTC)，利用cDNA為模板體外轉(zhuǎn)錄lnc1343 cDNA序列，經(jīng)測序比對無誤的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物連接到pCAGIPuro質(zhì)粒載體中.利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到E14細胞中(WT細胞中轉(zhuǎn)染對應(yīng)的空載體質(zhì)粒用于對照組)，24 h后，加入1 μg·mL-1嘌呤霉素，繼續(xù)培養(yǎng)5 d左右，收集部分細胞進行總RNA提取和RT-qPCR檢測來驗證是否成功構(gòu)建過表達細胞系.

1.3 RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄及 RT-qPCR

RNA的提取采用TRIzol抽提法，方法簡述如下：收集細胞后，用PBS清洗一遍，加入1mL TRIzol試劑(207002， Ambion)，充分混勻后，加入200 μL氯仿(288306， Sigma， USA)后劇烈晃動30 s以上，室溫靜置5 min，利用離心機(5424R/5424， Eppendorf， Germany)在12 000 ×g 4℃條件下離心15 min，吸取400 μL上清并加入等量異丙醇(500 mL，科密歐，中國)，混勻后室溫靜置10 min，12 000 ×g、4 ℃離心15 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇(500 mL，科密歐，中國)清洗一遍，7 500×g 4 ℃離心5 min，棄去乙醇，待自然晾干后加入適量的RNasefree的水(69182， Millipore， USA)，混勻后放入-80 ℃冰箱(MDF-U54V， Panasonic， Japan)保存?zhèn)溆?

A) lnc1343基因座敲除細胞系的構(gòu)建；B) lnc1343基因TSS敲除細胞系的構(gòu)建；A) Construction of gene locus knockout for lnc1343; B) Construction of TSS knockout for lnc1343; 圖1 兩種lnc1343敲除細胞系構(gòu)建Fig.1 Construction of lnc1343 homozygous knockout cell lines

取出提取完畢的RNA，利用試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A， TaKaRa， Japan)進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄方法嚴格按照試劑盒的要求進行.RNA 反轉(zhuǎn)錄后，加入試劑盒[FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)，Roche， 4913850001， USA]配制好的Mix混勻離心，并加入到 96 孔板中，用配套膜覆蓋孔板后離心，放至 qPCR儀(CFX Manager 3.1 System， Bio-Rad， USA)中進行反應(yīng)，其中反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性 5 min，進入循環(huán)反應(yīng)，即 95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸共計30 s，共循環(huán)35次，循環(huán)結(jié)束后隨即進入熔解曲線程序，此程序根據(jù)儀器默認程序即可.程序全部運行完成后對數(shù)據(jù)進行以下處理即得到目的基因的相對表達量：

△Ct(test)=Ct(target， test)-Ct(reference， test)，

△Ct(calibrator)=Ct(target， calibrator)-Ct(reference， calibrator)，

△△Ct=△Ct(test)-△Ct(calibrator)，

目的基因的相對表達量=2-△△Ct.

1.4 Western Blot

收集適量的細胞，加入適量的裂解液(P0013B，碧云天，中國)，并根據(jù)裂解液的量加入適量的蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail Set Ⅲ， Millipore)，用移液槍吹打直至看不見細胞沉淀，將樣品放在冰上，每隔10 min用Vortex(Vortex-6，海門市其林貝爾儀器制造有限公司，中國)震蕩10 s左右，重復(fù)3～5次，震蕩完畢后，將樣品放入預(yù)冷后的非接觸式超聲破碎儀(B01060010， Diagenode， Belgium)超聲5個循環(huán)，4 ℃條件下12 000 ×g離心10 min，吸取全部上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷EP管中，利用試劑盒(P0010S，碧云天，中國)測定所有樣品的蛋白濃度.在測完濃度后的蛋白樣品中加入適量的5×Loading Buffer，95 ℃金屬浴(DTH-100，上海百典儀器設(shè)備有限公司，中國)中變性處理10 min，然后按照測定的蛋白濃度加入到配制好的膠塊(按照試劑盒來配制，20325ES62，上海翊圣生物科技有限公司，中國)，電泳儀(PowerPacTMUniversal， Bio-Rad， USA)先用70 V電壓開始電泳，待蛋白Marker(26616， Thermo Scientific， USA)進入分離膠并開始出現(xiàn)條帶分離后，將電壓調(diào)至120 V繼續(xù)電泳，直至蛋白樣品孔中的藍色條帶接近膠板邊緣后停止電泳.整理取出的膠塊，進行轉(zhuǎn)膜操作，轉(zhuǎn)膜完畢后取出PVDF膜(88520， Thermo Scientific， USA)，放入盛有5%的脫脂牛奶封閉液中，用水平搖床(TY-80A/SA，華城潤華，中國)室溫封閉1h.封閉完成后將膜和稀釋好的抗體(Antibody-Nanog， sc-293121， Antibody-Sox2， sc-365964， Antibody-Oct4， sc-5279， SantaCruz， USA， Antibody-β-Actin， P30002， Abmart， USA)封在塑料薄膜中，4 ℃下過夜.第二天用TBST連續(xù)洗膜5次，每次10 min，孵育二抗(Goat anti-Mouse IgG-HRP， LK2003; Goat anti-Mouse IgG-HRP， LK2001， 天津三箭生物技術(shù)有限公司，中國，室溫，2 h)，完畢后再次連續(xù)洗膜5次，每次10 min.洗膜完畢后，配制適量的HRP-底物顯色液(WBKLS0500， Millipore， USA)，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon-5200，上海天能科技有限公司，中國)進行蛋白條帶圖像采集.

1.5 Capture C

Capture C實驗和分析方法主要參考Davies等的方法[18].具體方法簡述如下：收集足夠量的細胞并用甲醛固定，加入適量的限制性內(nèi)切酶Dpn Ⅱ進行充分消化，待檢測消化樣品合格后加入DNA連接酶進行連接；連接完成后，60 ℃過夜去交聯(lián)并提取DNA，將提取合格的DNA樣品進行超聲處理，構(gòu)建3C文庫(DNA長度約為200 bp)，將構(gòu)建完畢的3C文庫加入測序接頭和引物，并利用磁珠進行純化，并利用加入的引物進行擴增，獲得足夠的測序樣品，最后交給華大基因進行測序和分析.

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗均采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用Mean±SEM來表示，并利用單因素方差分析來進行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 lnc1343基因座敲除對小鼠ESC多能性的影響

如圖2A、B所示，利用CRISPR-cas9基因編輯技術(shù)，本研究得到了兩個lnc1343基因座敲除細胞系(Clone 1#和Clone 2#).通過RT-qPCR檢測lnc1343的表達，發(fā)現(xiàn)兩個雙敲細胞系中l(wèi)nc1343的相對表達量極低(圖2A)，而且在lnc1343基因座敲除內(nèi)部設(shè)計引物(Forward:5′-ggcaagcttttctgcctact-3′；Reverse：5′-ccccatcactgagggtcttaac-3′)進行PCR擴增驗證，發(fā)現(xiàn)兩個敲除細胞系中不能擴增出條帶(圖2B)，表明兩個細胞系中l(wèi)nc1343已經(jīng)被成功敲除.為了驗證lnc1343敲除后對小鼠ESC多能性維持的影響，本研究利用RT-qPCR檢測了多能性維持的標志物(Nanog、Sox2和Oct4)的mRNA相對表達量，發(fā)現(xiàn)lnc1343敲除后Nanog、Sox2和Oct4的相對表達量均有所下降，且差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(圖2C)，表明lnc1343敲除后小鼠ESC的多能性出現(xiàn)了顯著的下降.進一步利用westernblot檢測多能因子在蛋白水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lnc1343敲除后，Nanog、Sox2和Oct4的蛋白水平也出現(xiàn)了下降，這與其mRNA的表達變化一致 (圖2D).綜上所述，lnc1343的敲除破壞了小鼠ESC的多能性維持.

A.不同組中l(wèi)nc1343的相對表達量； B.lnc1343基因敲除的驗證； C.不同組中多能因子的相對表達量； D.不同組中多能因子的蛋白水平變化A.The relative expression of lnc1343 in different groups; B.Verification of deletion of lnc1343; C.The relative expression of pluripotency makers in different groups; D.The protein level of pluripotency markers in different groups圖2 lnc1343敲除對小鼠ESC多能性維持的影響Fig.2 The effect of deletion of lnc1343 on mouse ESC

2.2 lnc1343基因座敲除對小鼠ESC分化的影響

為了驗證lnc1343對小鼠ESC分化的影響，本研究繼續(xù)利用單層貼壁分化模型[19]來探究，結(jié)果表明，基因座敲除細胞在去除白細胞抑制因子LIF的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后，相較于WT細胞來說，敲除細胞分化后的克隆呈現(xiàn)出更加不規(guī)則的單層扁平形狀(圖3A)，這表明lnc1343基因座敲除后加快了細胞的分化進程.進一步通過RT-qPCR檢測不同組分化標志物的表達，結(jié)果顯示lnc1343基因座敲除后不同胚層分化標志物的相對表達量均有所上升，且差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B)，再次表明lnc1343基因座敲除后確實加快了ESC的分化進程.

A.不同組細胞在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d的圖像，比例尺為50 μm；B.不同組中分化標志物的相對表達量A.Representative images of different group cultured 2 days in indicated differentiation media. Scale bar， 50 μm; B.The relative expression of differential makers in different groups圖3 lnc1343基因座敲除對小鼠ESC多能性維持的影響Fig.3 The effect of DNA locus deletion of lnc1343 on mouse ESC

2.3 lnc1343 TSS敲除對小鼠ESC多能性的影響

為了進一步驗證lnc1343 RNA對于小鼠ESC多能性的影響，本研究利用CRISPR-cas9基因編輯技術(shù)，在lnc1343 TSS設(shè)計兩個sgRNA位點，經(jīng)轉(zhuǎn)染篩選后得到了兩個lnc1343 TSS敲除細胞系(Clone 3#和Clone 4#)，通過RT-qPCR檢測lnc1343的表達，結(jié)果顯示這兩個TSS敲除細胞系中l(wèi)nc1343的表達量不足10%(圖4A)，在lnc1343 TSS敲除兩端設(shè)計引物：Forward: gctaagaccgccaacacctt；Reverse:ctggaaggcggctaacactt，進行PCR擴增驗證，結(jié)果顯示兩個敲除細胞系中均被敲除了部分序列(圖4B).為了驗證lnc1343 TSS敲除對于小鼠ESC多能性維持的影響，本研究利用RT-qPCR檢測了多能性維持的標志物的相對表達量，結(jié)果顯示lnc1343 TSS敲除后Nanog、Sox2和Oct4的相對表達量均有所下降，且差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(圖4C)，表明lnc1343 TSS敲除后小鼠ESC的多能性出現(xiàn)了顯著的下降.利用western blot檢測多能因子在蛋白水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lnc1343敲除后，多能因子蛋白水平同樣出現(xiàn)了下降，這與其mRNA的表達變化一致 (圖4D).綜上所述，lnc1343的TSS敲除也破壞了小鼠ESC的多能性維持.

A.不同組中l(wèi)nc1343的相對表達量；B.lnc1343 TSS敲除的驗證；C.不同組中多能因子的相對表達量；D.不同組中多能因子的蛋白水平變化A.Relative expression of lnc1343 in different groups; B.Verification of the TSS deletion of lnc1343; C.Relative expression of pluripotency makers in different groups; D.Protein level of pluripotency markers in different groups圖4 lnc1343 TSS敲除對小鼠ESC多能性維持的影響Fig.4 The effect of the TSS deletion of lnc1343 on mouse ESC

2.4 lnc1343 TSS敲除對小鼠ESC分化的影響

為了進一步驗證lnc1343 RNA自身對小鼠ESC分化的影響，本研究將lnc1343 TSS敲除細胞系和WT細胞培養(yǎng)于去除LIF的分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)2 d，同樣的，結(jié)果顯示TSS敲除后的細胞克隆也呈現(xiàn)出更加不規(guī)則的單層扁平形狀(圖5A).通過RT-qPCR技術(shù)檢測TSS敲除細胞和WT細胞分化2 d后的分化標志物的相對表達，結(jié)果顯示lnc1343 TSS位點敲除后，不同胚層的分化標志物相對表達量均有所上升，且差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(圖5B)，這些結(jié)果表明，lnc1343 TSS敲除后促進了小鼠ESC的分化.

A.不同組細胞在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d的圖像，比例尺為50 μm；B.不同組中分化標志物的相對表達量；A.Representative images of differentgroup cultured 2 days in indicated differentiation media. Scale bar， 50 μm; B.Relative expression of differential makers in different groups圖5 lnc1343 TSS敲除對小鼠ESC多能性維持的影響Fig.5 The effect of TSS deletion of lnc1343 on mouse ESC

2.5 lnc1343過表達對小鼠ESC多能性和分化的影響

為了進一步證實lnc1343在小鼠ESC中的作用，本研究在小鼠ESC中過表達lnc1343 (圖6A).利用RT-qPCR檢測過表達細胞中多能因子的表達，結(jié)果顯示lnc1343過表達后細胞中多能性因子Nanog、Sox2和Oct4的表達量均出現(xiàn)了上升，且差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(圖6B)，表明了lnc1343的過表達進一步增強了小鼠ESC的多能性.同樣的，本研究也通過westernblot檢測了多能因子蛋白質(zhì)水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多能因子在蛋白水平上也出現(xiàn)了上升(圖6C).此外，利用單層貼壁模型試驗進一步發(fā)現(xiàn)，lnc1343過表達后，過表達細胞在分化培養(yǎng)基中所形成的克隆相較于WT多數(shù)保持穹頂狀樣克隆(圖6D)，表明lnc1343過表達延緩了小鼠ESC的分化進程，抑制了其的分化作用.通過檢測不同分化胚層的標志物發(fā)現(xiàn)，lnc1343過表達后，不同分化胚層的標志物都有了不同程度的下降，而且具有顯著差異性(圖6E).綜上，lnc1343過表達能夠促進小鼠ESC的多能性維持，而抑制其分化作用.

A.不同組中l(wèi)nc1343的相對表達量；B.不同組中多能因子的相對表達量；C.不同組中多能因子的蛋白表達量；D.不同組細胞在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d的圖像，比例尺為50 μm；E.不同組中分化標志物的相對表達量A.The relative expression of lnc1343 in different groups; B.The relative expression of pluripotency makers in different groups; C.The protein level of pluripotency markers in different groups; D.Representative images of different group cultured 2 days in indicated differentiation media. Scale bar， 50 μm; E.The relative expression of differential makers in different groups圖6 lnc1343過表達對小鼠ESC的影響Fig.6 The effect of overexpression of lnc1343 on mouse ESC

2.6 lnc1343基因座對小鼠ESC的影響

在上述敲除和過表達實驗中，發(fā)現(xiàn)lnc1343不管是基因座敲除還是TSS敲除，lnc1343鄰近基因Rcc1的表達均有不同程度的下降，且差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(圖7A、B)，此外，在lnc1343過表達后，鄰近基因Rcc1的表達出現(xiàn)了上升，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖7C).這些結(jié)果表明，lnc1343的缺失或者過表達都能夠?qū)︵徑虻谋磉_具有一定的調(diào)節(jié)作用，因此，本實驗繼續(xù)探究lnc1343是否可以通過染色質(zhì)長遠距離相互作用來調(diào)節(jié)其他基因的表達.首先，本實驗利用已發(fā)表的文獻以及數(shù)據(jù)庫來檢測lnc1343基因座的表觀遺傳修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lnc1343基因座具有很強的增強子特異性表觀遺傳標記，如H3K27ac等(圖7D)，表明lnc1343基因座含有增強子樣的序列，可以通過染色質(zhì)的長遠距離調(diào)控作用來調(diào)節(jié)基因的表達.為了進一步驗證lnc1343基因座是否可以通過長遠距離調(diào)控作用來調(diào)節(jié)基因的表達，本實驗在lnc1343基因座設(shè)計了特異性的DNA探針(Left oligo：5′-GAT CAA GGC AGG CAG CAG AGT CAT CAA TTT TCC ATT ATG ACC TAG GGA CCA GTC TAC CTC ATA TCA TAA GGC CCC TGT TAG GCC TAT CCA T-3′;Right oligo：5′-CCT TTT GCC AGA CCT CCA GCT GGA GGA AAA ACC CCA AAA ACG CCT GTC TCC AGA GTG CTG TGA CTA CAG ACT TCA GCC ACC TTT TCA GAT C-3′)，利用Capture C技術(shù)來捕獲與lnc1343基因座具有相互作用的DNA片段，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，lnc1343基因座與鄰近的基因間具有很強的相互作用(圖7E)，表明了lnc1343基因座可能通過自身增強子樣的序列調(diào)節(jié)鄰近基因的表達.此外，本實驗進一步分析發(fā)現(xiàn)，lnc1343基因座在其他染色體上也有許多相互作用的位點(圖7F)，這表明lnc1343基因座可能通過增強子樣的序列與其他不同的位點遠距離相互作用，從而調(diào)節(jié)不同位點基因的表達.

A.～C. lnc1343基因座、TSS敲除以及過表達后Rcc1的相對表達量；D.lnc1343基因座的表觀遺傳修飾；E.lnc1343基因座與鄰近基因的相互作用；F.lnc1343基因座在染色體上的長遠距離相互作用A.-C. Relative expression of Rcc1 in different groups upon lnc1343 DNA locus and TSS deletion or overexpression; D.Epigenetic modification in lnc1343 DNA locus; E.The interaction between lnc1343 DNA locus and adjacent genes; F.Long range interaction of lnc1343 DNA locus in different chromosomes圖7 lnc1343基因座對小鼠ESC的影響Fig.7 The effect of lnc1343 DNA locus on mouse ESC

3 討論

lncRNA 通常由多外顯子的前體 RNA 剪接、加帽、聚腺苷酸化加工形成，定位于細胞質(zhì)、細胞核或者同時存在于細胞質(zhì)和細胞核中[9， 20-21].lncRNA已被證明在調(diào)節(jié)多種細胞功能和疾病進程(包括干細胞和癌癥轉(zhuǎn)移)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[11， 22-24].在本研究中，利用CRISPR-cas9基因編輯技術(shù)敲除lnc1343基因座后，發(fā)現(xiàn)小鼠ESC多能因子在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上都出現(xiàn)了顯著降低，表明lnc1343基因座的敲除對小鼠ESC多能性的維持造成了一定的影響，降低了小鼠ESC的多能性.此外，基因座的敲除雖然直接阻止了lnc1343在細胞中的表達，但是也因為切除了基因座序列而無法區(qū)分RNA自身和基因座序列對于小鼠ESC多能性的影響，而且后續(xù)的實驗也證實，基因座序列具有增強子的特異性表觀遺傳標記H3K27ac，表明lnc1343基因座可能具有類似增強子的功能，在染色質(zhì)的長距離相互作用中發(fā)揮了重要的功能.因此在本研究中進一步通過CRISPR-cas9基因編輯技術(shù)敲除lnc1343的TSS區(qū)，且盡可能地保留lnc1343基因座序列，結(jié)果表明TSS區(qū)敲除后，小鼠ESC多能性因子也出現(xiàn)了顯著下降，表明lnc1343 RNA自身對于小鼠ESC多能性的維持也是必要的.此外，通過單層貼壁分化實驗結(jié)果可以看出，lnc1343的敲除可以加快小鼠ESC分化的進程，即lnc1343的敲除可以促進小鼠ESC的分化，從而進一步表明lnc1343對于小鼠ECS多能性的維持是不可或缺的.最后通過Gain-of-function實驗，發(fā)現(xiàn)lnc1343的過表達能夠顯著增加小鼠ESC多能性因子的表達，抑制小鼠ESC的分化進程，再次證明了lnc1343對于小鼠ESC多能性的維持是必需的.

lncRNA功能的發(fā)揮可以通過不同的機制來實現(xiàn)，如lncRNA能夠與染色質(zhì)修飾復(fù)合物相互作用，并且已經(jīng)被認為是染色質(zhì)表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要組成成分[12].此外，lncRNA還可以通過形成二級結(jié)構(gòu)模仿DNA序列，作為“分子誘餌(molecular decoy)”調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的細胞定位以及形成不同的二級結(jié)構(gòu)作為支架(scaffold)[25-26].在本實驗中，通過Loss-of-function和Gain-of-function發(fā)現(xiàn)lnc1343對于小鼠ESC多能性的維持是不可或缺的，而且也通過Capture C 實驗發(fā)現(xiàn)lnc1343基因座可能通過染色質(zhì)長遠距離相互作用調(diào)控基因的表達.此外，不管是敲除還是過表達，發(fā)現(xiàn)鄰近基因Rcc1的表達量在lnc1343敲除后出現(xiàn)顯著下調(diào)，在lnc1343過表達后顯著上調(diào)，表明lnc1343可能通過自身增強子樣的序列調(diào)控基因的表達.但是lnc1343過表達后造成Rcc1的上調(diào)，而外源性的lnc1343過表達不能將lnc1343 DNA序列引入內(nèi)源位點，這一結(jié)果表明lnc1343可能通過RNA形成一定的二維結(jié)構(gòu)，從而作為支架結(jié)合某些轉(zhuǎn)錄因子與其內(nèi)源性DNA序列相互作用來調(diào)節(jié)鄰近基因或者其他基因的表達.

高級染色質(zhì)構(gòu)象也是一種參與多能性維持的重要表觀遺傳機制.染色質(zhì)雖然是線性的分子，同一染色體上或不同染色體上的位點可通過染色質(zhì)的折疊從而在三維空間上相互接近，而且染色質(zhì)長距離相互作用(long-range chromatin interaction)可以調(diào)控基因的表達，進而參與細胞命運決定[27].染色質(zhì)長距離相互作用的重要意義正在逐步被揭示.參與染色質(zhì)折疊的蛋白質(zhì)的遺傳突變、以及破壞染色質(zhì)長距離相互作用的非編碼 DNA 序列的突變可導(dǎo)致多種疾病，包括腫瘤、發(fā)育異常和早衰等[28-29].胚胎干細胞維持著特殊的高級染色質(zhì)構(gòu)象，相比分化的細胞而言，ESC中轉(zhuǎn)錄不活躍的染色質(zhì)位點更多通過長遠距離的相互作用與其他位點結(jié)合[30-32].在本研究中，通過對lnc1343基因座的分析，發(fā)現(xiàn)Rcc1基因毗鄰lnc1343下游轉(zhuǎn)錄終止位點，而先前的研究表明，DNA結(jié)合蛋白Rcc1對于細胞周期的調(diào)控、核被膜形成、紡錘體形成以及核質(zhì)物質(zhì)運輸過程中都發(fā)揮了重要的作用，而且Rcc1還有可能作為一類與ESC相似的具有多潛能特性的胚胎癌細胞惡性進展的基因組生物標志物[33-36].通過檢測不同敲除細胞系以及過表達細胞系發(fā)現(xiàn)，Rcc1也確實在敲除細胞系中表達量降低而在過表達細胞系中表達量升高，而且基因座全敲后，Rcc1的表達量相較于TSS位點的敲除更少，這些數(shù)據(jù)表明lnc1343缺失或者過表達能夠?qū)︵徑虻谋磉_具有一定的調(diào)節(jié)作用，而且基因座的缺失，對于鄰近基因的調(diào)節(jié)更加明顯，這也提示lnc1343基因座有可能對于小鼠ESC的多能性維持有一定的影響.通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)lnc1343基因座中具有增強子的特異性表觀遺傳標記H3K27ac，這表明lnc1343基因座可能具有類似增強子的功能，在染色質(zhì)的長距離相互作用中發(fā)揮了重要的功能.為此，本實驗進一步通過Capture C來捕獲可能與lnc1343基因座相互作用的DNA片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lnc1343基因座不僅可以與鄰近基因之間具有很強的相互作用，而且與其他染色質(zhì)之間也有許多不同的相互作用位點，進一步表明了lnc1343基因座在小鼠ESC中發(fā)揮了一定的功能，可能通過增強子樣的序列長距離地調(diào)控基因的表達，從而調(diào)控ESC的多能性.進一步分析lnc1343基因座敲除以及TSS敲除數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)基因座敲除后不管是多能因子的相對表達量還是在分化模型中不同胚層的相對表達量變化幅度均相對高于TSS敲除后的變化，這也進一步表明lnc1343基因座DNA序列很有可能通過增強子樣的序列在小鼠ESC的多能性維持中發(fā)揮了一定的功能，這部分的研究需要進一步探討.

綜合上述，本研究發(fā)現(xiàn)lnc1343在小鼠ESC中發(fā)揮了重要的作用，lnc1343不僅可以通過自身的轉(zhuǎn)錄剪切形成的lncRNA來調(diào)控mESCs的多能性，同時也可能通過其基因座位調(diào)控染色質(zhì)的長遠距離相互作用來調(diào)節(jié)其他基因的表達.