地佐辛對(duì)坐骨神經(jīng)慢性壓迫性疼痛大鼠膠質(zhì)細(xì)胞活性及鎮(zhèn)痛效能的影響研究

董旭，韓學(xué)昌，邢群智，葛軍蒲，閆向彪

作者單位：河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽(yáng)471003

地佐辛是苯嗎啡烷類衍生物，作為K 受體的激動(dòng)劑，也是μ 受體的拮抗劑。近年被認(rèn)為是一種新型的麻醉劑，其擁有不良反應(yīng)低，無(wú)明顯的依賴性等優(yōu)點(diǎn)。但目前地佐辛作用于慢性壓迫性疼痛（chronic constriction injury，CCI）的藥理機(jī)制并未非常明確。膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)神經(jīng)元的功能、并為其提供營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)代謝、參加突觸的形成。使用麻醉劑后對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生的影響與其膠質(zhì)細(xì)胞有著密切的關(guān)聯(lián)。本研究通過(guò)對(duì)大鼠脊髓L3～4 節(jié)段膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白（Iba-1）和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，探討地佐辛對(duì)大鼠膠質(zhì)細(xì)胞活性及鎮(zhèn)定痛效能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2018年10月至2020年10月，選取雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量范圍160～190 g，無(wú)任何頭部頸部淤血等外傷。由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（豫）2020－0008。大鼠自由攝食飲水，飼養(yǎng)溫度（25.5±1.0）℃，分籠飼養(yǎng)。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。本研究過(guò)程嚴(yán)格按照國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)（IASP）關(guān)于進(jìn)行動(dòng)物疼痛實(shí)驗(yàn)的綱要實(shí)施完成。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分四組，每組10只。

1.2 藥品、試劑及儀器

Iba-1、GFAP一抗和羊抗兔IgG 抗體均來(lái)自美國(guó)Protein Technology 公司，ECL 發(fā)光試劑盒來(lái)自美國(guó)Thermo 公司。凝膠成像分析儀來(lái)自美國(guó)BIO-RAD。地佐辛注射液（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)H20080329，批次17054565，每支1 mL/5 mg）。GFAP 抗體，美國(guó)Abcam 公司生產(chǎn)。VonFrey電子測(cè)痛儀、熱輻射刺激儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組不進(jìn)行CCI 造模及地佐辛治療；模型組進(jìn)行CCI造模但不進(jìn)行地佐辛治療；低劑量組CCI 造模加低劑量地佐辛治療；高劑量組CCI 造模加高劑量地佐辛治療。于手術(shù)后即刻至術(shù)后7 d，低劑量組給予腹腔注射2.5 mg/kg 的地佐辛、高劑量組給予腹腔注射10 mg/kg 的地佐辛，低劑量組和高劑量組分別給予2.5 mg/kg、10 mg/kg 的地佐辛，稀釋至5 mL 給予腹腔注射，對(duì)照組和模型組給予腹腔注射等容積的0.9%生理鹽水。

1.4 大鼠CCI 模型的制作

用10%的水合氯醛4 μL/g對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后，經(jīng)股二頭肌將大鼠的左后肢位于大腿中后部分的皮膚進(jìn)行間隙鈍性分離，暴露大鼠的坐骨神經(jīng)干后將其與周圍的軟組織進(jìn)行分離；定位于坐骨神經(jīng)分成三股前的主干部位，大致在游離神經(jīng)7 mm 左右，輕度地對(duì)坐骨神經(jīng)進(jìn)行結(jié)扎，最優(yōu)以神經(jīng)外模收到輕度的壓力；強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)為引起小腿肌肉顫動(dòng)。一共對(duì)其坐骨神經(jīng)進(jìn)行4 道結(jié)扎，其間距為1 mm。此時(shí)制作成CCI 模型，在手術(shù)結(jié)束之前對(duì)大鼠前肢進(jìn)行肌肉注射4萬(wàn)單位青霉素。為保證本研究中的模型制作中盡量不出現(xiàn)偏差，均采取專人進(jìn)行模型制作，結(jié)扎時(shí)大鼠側(cè)肢出現(xiàn)輕微的抽動(dòng)且術(shù)側(cè)后爪無(wú)法承受重力，足趾開(kāi)始并攏且呈輕度外翻或出現(xiàn)自發(fā)性縮足反射等現(xiàn)象為模型制作成功。對(duì)照組對(duì)大鼠的坐骨神經(jīng)只進(jìn)行對(duì)空氣暴露，不進(jìn)行神經(jīng)結(jié)扎。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1

機(jī)械縮足反射閾值及熱縮足反射潛伏期的測(cè)定①使用VonFrey 電子測(cè)痛儀對(duì)大鼠的病側(cè)后足的機(jī)械疼痛閾值（Mechhanical withdral threshold，MWT）進(jìn)行測(cè)量：將大鼠放置于籠內(nèi)，等待30 min 使其適應(yīng)環(huán)境鎮(zhèn)定下來(lái)后使用VonFrey 電子測(cè)痛儀針尖對(duì)大鼠的病側(cè)足后第三、四組的足底皮膚進(jìn)行垂直刺激，當(dāng)大鼠出現(xiàn)極為迅速的縮足會(huì)舔足系列動(dòng)作則記為大鼠的MWT。②使用熱輻射刺激儀對(duì)大鼠的熱縮足反射潛伏期（Thermalpaw withdral wallatency，TWL）進(jìn)行測(cè)量；使用光斑直徑0.8 cm 的熱輻射刺激儀按照Hargreaves 法對(duì)大鼠的足底中后處1/3 處進(jìn)行照射，當(dāng)大鼠出現(xiàn)收足、舔足、抬足甚至撕咬即認(rèn)為大鼠的TWL。

對(duì)建模后大鼠第1 d、第3 d、第5 d、第7 d 的MWT、TWL進(jìn)行測(cè)定及比較，間隔3分鐘進(jìn)行1次測(cè)定，將切斷時(shí)間設(shè)置為20 s。

1.5.2

Western blotting 檢測(cè)大鼠L3～4 節(jié)段脊髓Iba-1、GFAP 蛋白表達(dá)水平 對(duì)大鼠的MWT 及TWL結(jié)束測(cè)量后，使用10%水合氯醛（400 mg/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉后快速斷頭，使其冰浴的同時(shí)迅速取其L3～4節(jié)段脊髓，用液氮進(jìn)行保存，加入含有磷酸蛋白酶抑制劑的SDS 緩沖液（按每毫克組織10 mL/mg 標(biāo)準(zhǔn)）和蛋白酶，將樣品用沸水浴5 min后進(jìn)行BCA 法測(cè)定蛋白濃度，應(yīng)用濕轉(zhuǎn)膜法將等量采用電泳的蛋白樣品10%SDS-聚丙烯酰胺轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。用5%的脫脂牛奶進(jìn)行60 min 的封閉后在4 ℃分別用1∶200的一抗Iba-1及1∶2 000的GFAP在搖床孵育過(guò)夜。洗膜后用ECL 發(fā)光試劑盒在凝膠成像分析儀處理。用Image Lab 軟件條帶的平均灰度值代表GFAP蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脊髓中Iba

-

1 及GFAP 的表達(dá)水平

單因素方差分析，各指標(biāo)整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：大鼠脊髓中Iba-1 及GFAP 的表達(dá)水平模型組蛋白表達(dá)水平最高，對(duì)照組水平最低。對(duì)照組與模型組，低、高劑量組與模型組的Iba-1、GFAP 表達(dá)水平，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均

P

＜0.05），見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組大鼠脊髓中中Iba-1及GFA的表達(dá)水平比較/±s

圖1 Western blotting檢測(cè)各組大鼠脊髓Iba-1、GFAP的蛋白表達(dá)電泳圖

2.2 各組大鼠疼痛行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

整體比較（兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析）知：各指標(biāo)組間差異、時(shí)間差異及交互作用均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。兩兩精細(xì)比較：低劑量組、高劑量組在CCI造模后不同時(shí)間段出現(xiàn)了行走時(shí)抬足、跛行、足外翻等行為學(xué)變化，MWT 和TWL 均明顯下降（

P

＜0.05）；與模型組相較，低劑量組和高劑量組在接受地佐辛治療后行為學(xué)變化有緩解，MWT 和TWL 回升（

P

＜0.05），高劑量組同時(shí)間點(diǎn)TWL 高于低劑量組（

P

＜0.05），而兩組同時(shí)間點(diǎn)MWT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠疼痛行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果（n=10）/±s

3 討論

神經(jīng)性疼痛（Neuropathic pain，NPP）是一種當(dāng)感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或者發(fā)生疾病時(shí)對(duì)軀體直接發(fā)生的疼痛。表現(xiàn)為痛覺(jué)過(guò)敏、感覺(jué)異常、自發(fā)性疼痛、異常疼痛等。膠質(zhì)細(xì)胞是一種支持細(xì)胞，分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，支持并引導(dǎo)神經(jīng)元遷移，對(duì)整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)和再生進(jìn)行參與，并且參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，在形成髓鞘、血腦屏障、物質(zhì)代謝及維持細(xì)胞外鉀離子的濃度等方面進(jìn)行作用。膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的關(guān)系在神經(jīng)生物學(xué)科成為最新熱點(diǎn)，神經(jīng)元在大腦中承擔(dān)著重要作用，參與釋放遞質(zhì)等影響突觸活動(dòng)。近年來(lái)大量的研究證實(shí)膠質(zhì)細(xì)胞與NPP 有關(guān)。王伍超等研究顯示，膠質(zhì)細(xì)胞在活化后會(huì)對(duì)神經(jīng)炎癥及免疫反應(yīng)進(jìn)行主導(dǎo)，而神經(jīng)炎癥和免疫反應(yīng)在NPP 的發(fā)生和維持上發(fā)揮著重要作用，發(fā)生神經(jīng)損傷后的膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)外周到中樞釋放出細(xì)胞因子及炎性因子加速NPP 發(fā)生，因此調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞活性或許是研究NPP的新方向。

地佐辛是阿片受體混合激動(dòng)-拮抗劑，具有優(yōu)越的鎮(zhèn)痛作用。其成癮性較小、對(duì)呼吸抑制作用較弱，在人體內(nèi)吸收快、分布快，因此鎮(zhèn)痛起效快、鎮(zhèn)痛久等優(yōu)點(diǎn)。臨床上將其廣泛在術(shù)后鎮(zhèn)痛、全麻誘導(dǎo)等方面運(yùn)用。Welch 等研究在大鼠上建立CCI 模型后給予嗎啡會(huì)升高大鼠在術(shù)后的MWT，以此來(lái)推測(cè)地佐辛是否會(huì)有類似作用。而鮑楊等的研究結(jié)果顯示，術(shù)后切口痛大鼠給予地佐辛能明顯升高痛閾，認(rèn)為地佐辛對(duì)術(shù)后切口痛具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。而本研究中大鼠在建模后的MWT、TWL水平均較低，在兩種不同劑量地佐辛干預(yù)下的MWT、TWL均呈現(xiàn)出一定水平的升高，與Welch等及李海鷗的研究結(jié)論類似，提示地佐辛對(duì)疼痛及神經(jīng)反射有著抑制作用，且還發(fā)現(xiàn)高劑量和低劑量對(duì)升高M(jìn)WT、TWL水平均有效果，但兩種劑量對(duì)MWT影響間的差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量的地佐辛可能并不能提高對(duì)坐骨神經(jīng)壓迫性疼痛的抑制作用。Iba-1為膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白，其陽(yáng)性蛋白水平可以作為膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白之一；GFAP是膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白及主要骨架成分。GFAP 可以在一定程度上反映膠質(zhì)細(xì)胞活化的狀態(tài)，因此可以檢測(cè)GFAP 水平來(lái)對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組GFAP 熒光強(qiáng)度值高于模型組、低劑量組及高劑量組，表明地佐辛可抑制大鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 的表達(dá)。同時(shí)，隨著地佐辛劑量的增加，GFAP熒光強(qiáng)度值開(kāi)始降低，地佐辛發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用可能與抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，本研究推測(cè)地佐辛在鎮(zhèn)痛的同時(shí)又可抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化：抑制大鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活性以至下調(diào)GFAP 的表達(dá)，但由于NPP 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，應(yīng)擴(kuò)大大鼠數(shù)量進(jìn)行多中心合作以此探索地佐辛在治療NPP的機(jī)制及臨床效果。