基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討培元補(bǔ)腎安胎方治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的作用機(jī)制

奚 婷，劉雁峰，包曉霞

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是女性妊娠期常見疾病，是指連續(xù)2 次或2 次以上在妊娠28 周之前的胎兒丟失，在育齡期女性中發(fā)病率達(dá)0.5%～3%［1，2］。受社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、生活環(huán)境的改變、工作壓力的增加等多方面因素的影響，發(fā)病率逐年增多［3，4］。隨著中國二胎政策的放開，具有生育需求的家庭進(jìn)一步增加，然而復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的高發(fā)病率嚴(yán)重影響患者的身心健康和家庭的和諧，目前正逐漸成為一項社會問題。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)不僅只意味著生育力下降，調(diào)查發(fā)現(xiàn)隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，女性患缺血性卒中［5］、缺血性心臟病、冠心病等循環(huán)系統(tǒng)疾?。?，7］、后代神經(jīng)系統(tǒng)疾病［8］等發(fā)病風(fēng)險增加。目前研究發(fā)現(xiàn)染色體異常、子宮因素、內(nèi)分泌異常、男性精子異常等均可導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)［9-12］，然而仍有50%～60%的病因不明［13］。用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)藥物治療主要是激素補(bǔ)充治療（孕酮、甲狀腺激素等）［14］、免疫調(diào)節(jié)治療（免疫球蛋白、環(huán)孢素等）［15］、抗凝血治療（阿司匹林、肝素等）［16］，部分患者還接受手術(shù)治療，如宮頸環(huán)扎術(shù)、宮腔粘連分離術(shù)等［17］。然而通過系統(tǒng)的篩查病因和相應(yīng)治療后，仍有50%患者無法成功妊娠，且目前這些化學(xué)及生物藥物治療方法存在較多的不良反應(yīng)，如過敏、出血、頭疼及胃腸道反應(yīng)等。近期研究發(fā)現(xiàn)免疫療法可改善不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的妊娠結(jié)局［18］，然而其治療范圍還有所限制，且其安全性還需要進(jìn)一步明確。因此，需要一種更加安全、有效的治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的方法。

中醫(yī)藥在多種疾病的治療中已經(jīng)使用了數(shù)千年，且中醫(yī)藥具有價格便宜、療效好且大部分中藥來自天然的植物或動物等，副作用少等優(yōu)點(diǎn)。在整體觀念的指導(dǎo)下，通過辨證論治，中醫(yī)藥已成為被廣泛接受的一種安全有效的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療方法。近年來大量的臨床研究報道證明了中醫(yī)藥治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的有效性。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)在中醫(yī)學(xué)中稱為“滑胎”。中國清代名醫(yī)張錫純創(chuàng)建的壽胎丸是治療滑胎、防治先兆流產(chǎn)的經(jīng)典方，臨床中廣泛應(yīng)用，且進(jìn)行了大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究，meta 分析結(jié)果提示在先兆流產(chǎn)的治療中，壽胎丸的療效優(yōu)于單純西藥［19］。

培元補(bǔ)腎安胎方是劉雁峰教授在結(jié)合治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的長期臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和前人經(jīng)驗(yàn)方“壽胎丸”的基礎(chǔ)上創(chuàng)建，基于“脾腎不足，胎元不固”的病機(jī)，以培元補(bǔ)腎、益氣安胎為治法。培元補(bǔ)腎安胎方是在壽胎丸基礎(chǔ)上增加白術(shù)、黃芪、黨參、黃芩、炙甘草、白芍6 味中藥而成。方中桑寄生、續(xù)斷、菟絲子補(bǔ)腎，黨參、黃芪、白術(shù)健脾益氣，黃芩清熱，白芍柔肝，甘草調(diào)和諸藥。前期臨床研究證實(shí)補(bǔ)腎安任法能改善復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者再次先兆流產(chǎn)的中醫(yī)證 候 積 分，改 善E2、P、HCG 水 平，提 高 妊 娠 成 功率［20，21］。然而培元補(bǔ)腎安胎方含有多種活性成分，這些給它的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)作用靶點(diǎn)以及分子機(jī)制研究帶來很大的困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新興藥物的研究方法，可以幫助獲得中藥復(fù)方的主要活性成分，篩選出藥物作用的核心靶標(biāo)和參與的主要通路，從系統(tǒng)水平上研究藥物、基因等生物學(xué)過程。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來逐漸發(fā)現(xiàn)和了解培元補(bǔ)腎安胎方的治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 培元補(bǔ)腎安胎方活性化合物的篩選

培元補(bǔ)腎安胎方由桑寄生、續(xù)斷、菟絲子、黨參、黃芪、黃芩、白術(shù)、白芍、甘草這9 味中藥組成。通 過 檢 索TCM（http：//tcm.cmu.edu.tw/）、TC?MSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）數(shù)據(jù)庫，收集培元補(bǔ)腎安胎方方中各單味藥的主要化學(xué)成分?？紤]中藥成分復(fù)雜，并非所有成分均被吸收，結(jié)合文獻(xiàn)及平臺推薦，設(shè)置條件參數(shù)口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 初步篩選出該復(fù)方潛在的活性成分［22，23］。

1.2 預(yù)測化合物所對應(yīng)的靶基因

通過TCMSP、pubchem、CHEMBL 逐一對比得到培元補(bǔ)腎安胎方潛在化合物對應(yīng)的作用靶點(diǎn)。然后，利用Uniport（蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫）（https：//www.uniprot.org/）獲得與潛在活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白信息，對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，篩選來自人類屬性的靶點(diǎn)基因。

1.3 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的疾病靶點(diǎn)

通過人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫（Genecard?shttps：//www.genecards.org/）和 人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIMhttps：//www.omin.org/），設(shè)置檢索詞為“Recurrent spontaneous abortion or RSA”，獲得與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)的已知靶基因信息。

1.4 藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用R 語言將疾病靶基因與培元補(bǔ)腎安胎方化合物潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行對比取交集，繪制韋恩圖，得到培元補(bǔ)腎安胎方治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的潛在作用靶點(diǎn)，用于后續(xù)研究。將培元補(bǔ)腎安胎方的潛在活性成分與其潛在靶點(diǎn)蛋白上傳至cytoscape3.6.1軟件（https：//www.cytoscape.org/）構(gòu)建體現(xiàn)藥物-化合物-作用靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，以探究培元補(bǔ)腎安胎方的藥理學(xué)作用機(jī)制。

1.5 靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述得到的培元補(bǔ)腎安胎方治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入string 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org），屬性限定“Homo sapiens”，獲得靶蛋白之間的相互作用關(guān)系，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并且利用R 語言軟件統(tǒng)計出現(xiàn)頻次并繪制柱狀圖。

1.6 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

clusterProfiler 是Bioconductor 的 軟 件 包，可 以對基因集合進(jìn)行功能的聚類統(tǒng)計和可視化分析。本研究應(yīng)用clusterProfiler 包對藥物與疾病的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，并將富集結(jié)果以氣泡圖或條形圖等形式可視化。利用R 語言構(gòu)建核心通路的靶基因的位置，以便研究培元補(bǔ)腎安胎方治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的可能的作用機(jī)制和涉及的通路。

1.7 分子對接

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的可靠性，通過MOE軟件進(jìn)行分子對接來評估培元補(bǔ)腎安胎方重要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性。本文藥效特征注釋采用的是EHT（Extend Huckel theory）方式。為了準(zhǔn)確評估預(yù)測目標(biāo)，蛋白結(jié)構(gòu)在對接之前需要對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，因?yàn)榈鞍捉Y(jié)構(gòu)解析的時候會存在結(jié)構(gòu)缺失，原子的局部電性沒有標(biāo)出，沒有明確水分子的位置，以及氫原子的位置信息，首先從RCSB Protein Data Bank（http：//www.pdb.org/）下載PPI 網(wǎng)絡(luò)中前10 的核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)，然后通過MOE（2015）的Structure Preparation 查找并解決相應(yīng)的問題，主要包括優(yōu)化和修補(bǔ)氨基酸，重新移動水分子，計算局部原子的電性，最后通過Proton?ate3D 進(jìn)行加氫質(zhì)子化，優(yōu)化氫鍵結(jié)構(gòu)，最后利用LigX Panel 對整體結(jié)構(gòu)再次優(yōu)化，包括化合物的結(jié)構(gòu)式和能量最小化，以MOE 格式保存，最后通過Dock 計算，將預(yù)測的藥效團(tuán)特征與前10 個目標(biāo)化合物分子擬合。利用MOE 中Dock 功能進(jìn)行模擬計算的時候配體分子的模式設(shè)置為柔性對接，確保尋找到最優(yōu)分子結(jié)構(gòu)，選擇經(jīng)典小分子對接函數(shù)Triangle Matcher 進(jìn)行計算，最后根據(jù)London dG 評分準(zhǔn)則對結(jié)果進(jìn)行打分。當(dāng)Docking Score 絕對值＞4.25 表示分子與靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合能力，＞5.0表示結(jié)合能力較強(qiáng)，＞7.00 表示結(jié)合能力很強(qiáng)［24］。

2 結(jié)果

2.1 培元補(bǔ)腎安胎方的化合物篩選及預(yù)測靶點(diǎn)

本研究運(yùn)用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP、TCM 數(shù)據(jù)庫最終收集到培元補(bǔ)腎安胎方中這9 味藥所含的化合物共810 個，其中桑寄生46個，續(xù) 斷31 個，菟 絲子29 個，黨參134 個，黃芪87個，黃芩143 個，白術(shù)55 個，白芍5 個，甘 草280 個。通過標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)OB≥30%，DL≥0.18 對其所有化合物進(jìn)行篩選并去重，最終得到培元補(bǔ)腎安胎方潛在化合物186 個，見表1。共獲得1 339 個化合物作用靶點(diǎn)，去除重復(fù)的1 299 個，得到藥物共有的136 個成分靶點(diǎn)。

2.2 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的疾病靶點(diǎn)篩選

通過檢索Genecards、OMIM 數(shù)據(jù)庫得到復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的疾病靶點(diǎn)，其中Genecards 數(shù)據(jù)庫以score值≥30 為限制條件進(jìn)行篩選.經(jīng)過去重共得到1 658 個。

2.3 共同靶點(diǎn)篩選及化合物?作用靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用R 語言將疾病靶點(diǎn)與藥對活性成分對應(yīng)的136 個靶點(diǎn)作對比，繪制韋恩圖，獲得共同靶標(biāo)65個，即培元補(bǔ)腎安胎方對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的預(yù)測作用靶標(biāo)，見圖1。將藥物化合物與共同靶點(diǎn)導(dǎo)入cyto?scape3.6.1 軟件中，繪制“化合物-靶點(diǎn)”圖，見圖2。由于MOL000379、MOL004990 等化合物在數(shù)據(jù)處理過程中未查及相關(guān)作用靶點(diǎn)，故將其剔除。網(wǎng)絡(luò)中化合物節(jié)點(diǎn)145 個，作用靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)65 個，網(wǎng)絡(luò)中共有210 個節(jié)點(diǎn)，1 671 條邊，每條邊表示化合物與靶點(diǎn)直接的關(guān)系；度值表示連接該節(jié)點(diǎn)的條數(shù)，度值越大，表示該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的相互作用越廣泛，在網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐作用。化合物中度值前10 的是kaempferol、quercetin、beta-sitosterol、isorhamne?tin、luteolin、formononetin、7-Methoxy-2-methyl iso?flavone、baicalein、Calycosin、wogonin 等。65 個潛在靶點(diǎn)分別至少與兩個化合物相連接，說明多種化合物均有多個共同的作用靶點(diǎn)，提示了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用模式。

圖1 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與培元補(bǔ)腎安胎方共同靶點(diǎn)韋恩圖Fig 1 Venn diagram of the common targets of recurrent abortion and Peiyuan Bushen Antai formula

圖2 化合物-靶點(diǎn)圖Fig 2 Compound-target diagram

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)的提取

機(jī)體的調(diào)節(jié)不是由單一的信號途徑主導(dǎo)，而是存在不同的信號通路和靶點(diǎn)的復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。PPI 運(yùn)作大規(guī)模的生物過程，例如蛋白間相互作用，代謝控制和發(fā)育控制。因此運(yùn)用PPI 分析可以可視化分析潛在靶點(diǎn)直接的相關(guān)作用，有助于挖掘核心的調(diào)控基因。將65 個靶點(diǎn)基因輸入string 數(shù)據(jù)庫，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中有65 個節(jié)點(diǎn)，含有610 條邊，節(jié)點(diǎn)度數(shù)平均為18.8，見圖3。利用R 語言軟件統(tǒng)計出頻次前30 靶點(diǎn)并繪制條形圖，圖中可知VEG?FA（47），IL6（46），EGFR（43），MAPK8（41），ESR1（39）等是整個核心蛋白，說明在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療中，培元補(bǔ)腎安胎方可能通過這些蛋白發(fā)揮治療作用，見圖4。

2.6 GO 功 能 和KEGG 通 路 富 集

應(yīng)用clusterProfiler 對共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。GO 功能主要涉及轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合、氧化活性、抗氧化活性、單加氧酶活性等生物學(xué)過程，體現(xiàn)了培元補(bǔ)腎安胎方可能調(diào)控多個復(fù)雜的生物學(xué)過程來治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，GO 分析的前20 個條目，見圖5。對共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，通過設(shè)置p-value＜0.05，q-value＜0.05 的條件共得到62條信號通路。經(jīng)分析，62 條富集通路主要是信號傳導(dǎo)相關(guān)通路（PI3K-Akt、MAPK、P53、凋亡等通路）、疾病通路（乙型肝炎、EB 病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、前列腺癌等通路）等。利用R 語言軟件對前20 條主要富集的通路進(jìn)行可視化處理，見圖6。大多數(shù)基因主要富集在癌癥信號通路（15個、圖7）、P53 通路（9 個、圖8）。通路上靶點(diǎn)基因越多，提示培元補(bǔ)腎安胎方可能通過調(diào)控該信號通路從而起到治療作用。

圖3 65 個潛在作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Protein-protein interaction（PPI）network diagram of 65 potential targets

圖4 前30 個潛在作用靶點(diǎn)條形圖Fig 4 Bar chart of the top 30 potential targets

圖5 GO 功能富集分析Fig 5 GO functional enrichment analysis

2.7 分子對接

圖6 前20 個KEGG 通路氣泡圖Fig 6 Bubble diagram of the top 20 KEGG pathways

圖7 培元補(bǔ)腎安胎方潛在作用靶點(diǎn)富集在癌癥信號通路圖Fig 7 Potential effect targets of Peiyuan Bushen Antaiformula enriched in the cancer signaling pathway map

圖8 培元補(bǔ)腎安胎方潛在作用靶點(diǎn)富集在P53 信號通路圖Fig 8 Potential effect targets of Peiyuan Bushen Antaiformula enriched in the P53signaling pathway map

在分子對接前，將AR、caspase-3、CCND1、EG?FR、ESR1、FOS、MAPK8、MYC 的 蛋 白 結(jié) 構(gòu) 從PDB 數(shù) 據(jù) 庫 下 載，IL6 和VEGFA 的PDB 結(jié) 構(gòu) 沒 有原配體，故未分析。分子對接結(jié)果顯示培元補(bǔ)腎安胎 方 的 核 心 化 合 物（MOL000098、MOL000422、MOL000354、MOL000006、MOL003896、MOL000392、MOL002714、MOL000417、MOL000173、MOL000497、MOL000211）和潛在作用靶點(diǎn)的對接得分均≤-5.0 kcal/mol，由此可以表明培元補(bǔ)腎安胎方與預(yù)測的作用靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性。具體分子對接分?jǐn)?shù)見表2。配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。由表3 可以得出結(jié)合性最強(qiáng)的是CCND1 蛋白與MOL000497 化合物。圖9以三維模式表示了CCND1 的活性位點(diǎn)中MOL000497 的結(jié)合模式，圖10 中以速寫二維圖展示了MOL000497 能與穩(wěn)定的對接到CCND1 的1OR9 藥效特征的活性口袋中。圖11 和圖12 顯示Glu81，Leu83 的羰基與H 原子發(fā)生氫鍵作用，Leu83的N 原子與H 原子之間形成氫鍵作用，還有Gin85與6-ring 之間存在pi-H 鍵作用，但結(jié)合EHT 計算得出的鍵距以及鍵能值，Gin85 與6-ring 之間存在pi-H鍵作用影響不占主導(dǎo)因素，所以該藥效團(tuán)的主要特征是羰基與H 原子形成的氫鍵以及N 原子與H 原子形成的氫鍵上。EHT 計算量值表具體見表3。因此我們認(rèn)為MOL000497 是培元補(bǔ)腎安胎方中重要的潛在活性化合物。

表2 8 個潛在靶點(diǎn)蛋白與前10 個化合物分子對接表Tab 2 The 8 potential target proteins and the first 10 compoundmolecular dockings

圖9 MOL000497 與CCND1 的活性位點(diǎn)結(jié)合的三維圖Fig 9 Three-dimensional diagram of binding of MOL000497 to the active site of CCND1

圖10 MOL000497能與穩(wěn)定的對接到CCND1的速寫二維圖Fig 10 Two-dimensional sketched diagram of MOL000497 stably connected to CCND1

圖11 LEU 83 羰基與氫原子形成氫鍵Fig 11 The carbonyl group of LEU 83 forms a hydrogen bond with a hydrogen atom

圖12 GLU81 與氫原子形成氫鍵Fig 12 GLU81 forms a hydrogen bond with a hydrogen atom

表3 配體與受體EHT 計算量值表Tab 3 Calculated value table of ligand and receptor EHT

3 討論

中藥復(fù)方具有成分多、靶點(diǎn)復(fù)雜、化合物之間成分協(xié)同作用于靶點(diǎn)等特征，這些因素造成目前中醫(yī)藥研究主要集中在單一的信號通路和作用靶點(diǎn)等，難以全面深入研究中醫(yī)藥作用機(jī)制。集系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)和生物信息學(xué)為一體的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過在網(wǎng)絡(luò)模型中識別化合物-化合物、化合物-靶點(diǎn)、疾病-靶點(diǎn)等之間的相互作用，認(rèn)識中藥對生物網(wǎng)絡(luò)的影響，構(gòu)建化合物-蛋白-信號通路等網(wǎng)絡(luò)，對作用靶點(diǎn)功能進(jìn)行富集，系統(tǒng)的展示了中醫(yī)藥的作用機(jī)制。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析，探究培元補(bǔ)腎安胎方治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的作用機(jī)制，為其治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)提供證據(jù)，有利于臨床的進(jìn)一步開發(fā)利用，也有利于進(jìn)一步研究。

本研究篩選出培元補(bǔ)腎安胎方核心化合物有山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、異鼠李素、木犀草素、刺芒柄花素、黃芩素、毛蕊異黃酮等，這些化合物大部分屬于黃酮類化合物。黃酮類化合物具有非常重要的藥用價值，其具有抗炎、抗氧化［25］、抗衰老［26］、抗腫瘤［27］、抑制肥胖和相關(guān)的代謝紊亂［28］等作用。桑寄生、菟絲子等中藥材中都含有槲皮素，有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能抑制MCP-1 的生成，減少TNF-α，調(diào)節(jié)妊娠小鼠子宮內(nèi)環(huán)境、改善小鼠胚泡著床障礙等從而發(fā)揮保胎作用［29，30］。黃芩素能提高滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲能力［31］。異鼠李素、木犀草素能有效的抑制TNF-α、IL-1β 等的釋放，抑制炎癥損傷，同時異鼠李素能通過激活PI3K/AKT 通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對細(xì)胞的損失［32，33］。木犀草素還參與細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的侵襲能力［34］。

通過構(gòu)建作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)VEGFA、IL6、EGFR、MAPK8、ESR1 等是培元補(bǔ)腎安胎方治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的核心蛋白。早期妊娠中滋養(yǎng)細(xì)胞入侵子宮蛻膜以及母體-胎盤血管生成、重塑非常重要，VEGFA 參與這一過程，子宮內(nèi)膜中VEGFA 通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜血管生成和通透性，促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化，提高子宮內(nèi)膜容受性［35］。表皮生長因子受體（EGFR）廣泛分布于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞，有利于胎盤絨毛的生成，EGFR 促進(jìn)細(xì)胞的增殖和血管生成［36］。有研究發(fā)現(xiàn)在早期妊娠丟失患者的子宮蛻膜 中VEGFA 和 絨 毛 組 織 中EGFR 表 達(dá) 下 降［37，38］。雌激素通過與雌激素受體結(jié)合在胚胎植入和妊娠維持起著重要作用［39］。雌激素受體分為雌激素受體α（ESR1）和雌激素受體β（ESR2），研究發(fā)現(xiàn)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的蛻膜組織雌激素受體降低［40］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)多囊卵巢綜合征患者早期自然流產(chǎn)的子宮內(nèi)膜ESR 減少，通過中西醫(yī)結(jié)合治療，能 明 顯 改 善ESR 的 分 布［41，42］。由Th2 細(xì) 胞 分 泌 的IL6 主要參與體液免疫，抑制免疫反應(yīng)，減少免疫過度損失。在早期妊娠中，IL6 調(diào)節(jié)激素的合成，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能和胎盤血管形成，有利于成功妊娠［43］。調(diào)查發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的IL6 水平低于正常妊娠人群。本研究通過對核心蛋白進(jìn)行生物學(xué)功能分析顯示主要參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合、氧化活性、抗氧化活性、單加氧酶活性等生物學(xué)過程。臨床觀察發(fā)現(xiàn)壽胎丸能提高妊娠成功率，降低患者TNF-α、IL-6、IL-10 等炎癥因子［44］，動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)壽胎丸能改善大鼠的子宮內(nèi)膜和卵巢黃體功能，提高孕酮水平，提 高RSA 孕 鼠 的 螺 旋 動 脈 的 生 理 性 重 鑄［45，46］。與本研究結(jié)果相符合。

根據(jù)KEGG 富集通路結(jié)果提示，靶點(diǎn)受多種生物學(xué)途徑的調(diào)控，培元補(bǔ)腎安胎方通過調(diào)節(jié)癌癥信號通路、感染性疾病相關(guān)信號通路、TNF、細(xì)胞凋亡、P53、PI3K/AKT、MAPK 等信號通路來治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。P53 是人體重要的腫瘤抑制基因，參與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和DNA 修復(fù)等，維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定及調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與衰老功能［47］，P53 主要通過P53/P21、p53-tristetraprolinstathmin-1 等信號通路調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化和滋養(yǎng)細(xì)胞功能，從而參與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)p53 信號通路的多態(tài)性是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的高危因素［48］。細(xì)胞凋亡通路其主要包含線粒體凋亡和死亡受體凋亡途徑兩條重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)與散發(fā)流產(chǎn)患者相比，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織的促凋亡蛋白明顯增加，抗凋亡蛋白明顯減少，從而引起細(xì)胞過度凋亡，不利于胚胎植入從而導(dǎo)致流產(chǎn)［49］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)壽胎丸含藥血清通過上調(diào)BCL-2，下調(diào)BAX 蛋白減少自然流產(chǎn)患者滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡［50］。絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK）參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種功能，目前研究發(fā)現(xiàn)MAPK信 號 通 路 主 要 包 含3 條：ERKs 通 路、JNKs 通 路 和p38 通路。MAPK 通路與子癇、流產(chǎn)等多種病理妊娠有關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK 信號通路調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲的關(guān)鍵酶，影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能［51］。越來越多研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與母體免疫異常有關(guān)，p38MAPK 信號通路參與炎癥反應(yīng)，該通路的活化能激活大量的細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-6 等合成和釋放，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展。黃酮類化合物能抑制MAPK 通路，從而減少炎癥因子的分泌，減少炎性損失。本研究發(fā)現(xiàn)培元補(bǔ)腎安胎方的化合物主要為黃酮類，所以提示培元補(bǔ)腎安胎方可能通過調(diào)節(jié)MAPK 信號通路從而治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。PI3K/AKT 信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和黏附能力，人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展與該通路密切相關(guān)，如：卵巢早衰、高血壓、腫瘤等。研究發(fā)現(xiàn)激活滋養(yǎng)細(xì)胞的PI3K/AKT 信號通路可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力［52］。補(bǔ)腎中藥能上調(diào)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜細(xì)胞PI3K/AKT 通路中的關(guān)鍵蛋白從而恢復(fù)蛻膜細(xì)胞的增殖功能，改善凋亡水平，從而改善妊娠結(jié)局。這些通路在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)理和治療過程中起著協(xié)同作用，也為中醫(yī)藥多靶點(diǎn)治療提供了有力的依據(jù)。

分子對接學(xué)是計算機(jī)靶點(diǎn)預(yù)測工具，目前已被廣泛用作基于配體的靶標(biāo)預(yù)測和基于結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)預(yù)測。目前這種虛擬篩選是鑒定特點(diǎn)配體，推定靶標(biāo)的有前途的方法。利用MOE 軟件對11 個活性成分及8 個靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接，提示篩選出的潛在靶點(diǎn)和結(jié)合性較高，驗(yàn)證了運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對培元補(bǔ)腎安胎方治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的機(jī)制進(jìn)行了初步探討的可靠性。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對培元補(bǔ)腎安胎方的藥效成分、作用靶點(diǎn)以及作用主要通路進(jìn)行了分析，初步明確了培元補(bǔ)腎安胎方通過多成分-多靶點(diǎn)-多通路發(fā)揮治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，為后續(xù)深入研究相關(guān)作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。但分析過程中未考慮方劑中的“君-臣-佐-使”關(guān)系，藥物煎煮方式和時間，藥物用法等因素，因此本結(jié)果尚需進(jìn)一步動物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。