外周血CK-19、Vimentin mRNA在早期診斷乳腺癌復發(fā)、轉移中的應用研究

王合兵，肖堅，陳文新，楊炳林，卓德祥

（福建醫(yī)科大學附屬三明第一醫(yī)院 1.乳腺科 2.檢驗科，福建 三明 365000）

乳腺癌是乳腺組織上皮細胞發(fā)生癌變的一種惡性腫瘤，其在婦女群體中尤為高發(fā)，尤其是40～55 歲中老年婦女，占婦女腫瘤約1/3［1］。據報道，乳腺癌的發(fā)病機制尚不清晰，然而誘導其高發(fā)的危險因素廣泛存在，包括遺傳、生活習慣等［2］。乳腺癌在臨床早期癥狀不明顯，且患者意識較弱，其多表現為乳頭凹陷、乳頭溢液等［3］。有研究指出，乳腺癌本身無致命危險，但具有全身性，從早期階段開始腫瘤細胞便可通過血液或者淋巴管進行微小轉移，多數患者手術治療后體內仍存在未檢測出殘余的腫瘤小病灶，在短暫時間內便可復發(fā)。因此，疾病的轉移和復發(fā)是導致其危險性高的關鍵［4］。

近年來乳腺癌更加高發(fā)，躍居肺癌之后，對婦女患者打擊巨大，加上人們生活質量的提高，該疾病的及時治療受到關注［5］。降低疾病轉移率和復發(fā)率的關鍵在于早期檢測出患者體內轉移微病灶并于治療后監(jiān)控殘存的微病灶。以往臨床會根據乳腺癌分期、淋巴結轉移數等指導治療方案，但其均建立在患者有意識地就醫(yī)基礎上，因此常規(guī)方法過于局限且準確性偏低［6］。現有研究指出，通過檢測外周血中波形蛋白（Vimentin）、細胞角蛋白19（CK-19）水平來診斷乳腺癌準確性更高，尤其用于早期診斷及預后［7］。本文對外周血CK-19、Vimentin 信使RNA（mRNA）在早期診斷乳腺癌復發(fā)、轉移中的應用進行研究，旨在為臨床提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014 年8 月至2016 年7 月福建醫(yī)科大學附屬三明第一醫(yī)院收治的68 例乳腺癌女性患者，根據陽性率高低分為觀察組（陽性率高）和對照組（陽性率低），每組34 例。其中，年齡22～73 歲，平均（46.53±16.25）歲。納入標準［8］：①符合乳腺癌的診斷標準［9］；②經X 射線或乳腺彩超診斷；③經組織病理學證明；④無其他惡性腫瘤引起的轉移病灶或惡性腫瘤；⑤患者及其家屬簽署知情同意書。排除標準：①并發(fā)血液性、免疫性疾??；②并發(fā)嚴重的基礎功能性疾病；③伴有嚴重抑郁等精神類疾病。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

所有研究對象入院后行外周血CK-19、Vimentin mRNA 檢測，逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）法檢測CK-19、Vimentin。按說明書應用Trizol 試劑盒（美國Invitrogen 公司）提取樣本總RNA,DNA Marker、逆轉錄試劑盒、瓊脂糖、擴增試劑盒均購于大連寶生物工程公司，所用的引物均由大連寶生物公司設計并合成。將樣本加入1 mL Trizol 裂解，200 μL 氯仿萃取，75% 乙醇洗滌，然后開始逆轉錄反應，每管逆轉錄反應體系總量10 μL。每管中加入各種試劑固定總量為5.25 μL，再加入1 μg 總RNA 體積，用DEPC-H2O 補充至10 μL，混勻、離心。反應條件：42℃預變性30 min，99℃變性5 min，4℃退火5 min，72℃延伸8 min延伸以滅活逆轉錄酶。生成cDNA 進行PCR 擴增。反應條件：95℃預變性15 min，95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，共20 個循環(huán)。

1.3 觀察指標

①比較兩組轉移復發(fā)率；②計算血清CK-19、Vimentin mRNA 單項檢測及兩種指標聯合檢測診斷乳腺癌的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值及準確性；③用Logistic 回歸分析血清CK-19、Vimentin mRNA 診斷乳腺癌的臨床價值。

1.4 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；多因素分析用Logistic 回歸模型，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組轉移復發(fā)率比較

觀察組與對照組發(fā)生復發(fā)轉移分別為23 例（67.65%）、8 例（23.53%），兩組轉移復發(fā)率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=13.339,P=0.000）。

2.2 各標志物及聯合檢測的診斷效果指標情況

CK-19+Vimentin 聯合檢測的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值及準確性高于各指標單獨檢測，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各標志物及聯合檢測的診斷效果指標情況（%）

2.3 各指標對乳腺癌診斷價值的Logistic 回歸分析

Logistic 回歸分析顯示，CK-19、Vimentin mRNA 及CK-19+Vimentin 與乳腺癌診斷有密切的相關性（P<0.05）。見表2。

表2 各指標對乳腺癌診斷價值的Logistic 回歸分析參數

3 討論

目前，乳腺癌已成為廣受注目的高危性疾病之一，其危險性主要體現為轉移和復發(fā)。隨著人們生活壓力的增大，吸煙、飲酒等高危因素越來越多，導致乳腺癌發(fā)病率不斷增加，因此對乳腺癌的治療已成為臨床關注的焦點［10］。有研究指出，在疾病早期，腫瘤細胞便開始從原發(fā)灶脫落，經血液循環(huán)存在于外周血、淋巴結中，其在合適的機會下侵入其他組織，導致疾病的轉移或復發(fā)；從腫瘤原發(fā)灶或轉移灶脫落進入血液循環(huán)形成的惡性細胞稱循環(huán)腫瘤細胞（CTCs），其容易引起腫瘤的進展和遠處轉移［11］。因此，乳腺癌的早期診斷和術后監(jiān)測至關重要。有報道顯示，僅憑以往采用的影像技術對患者手術前后進行檢查，檢查出微轉移灶的可能性較低，導致誤診率和復發(fā)率較高，且其成本較高［12］。現階段隨著腫瘤治療技術的不斷發(fā)展，臨床逐漸意識到CTCs 作為檢驗指標所起的關鍵作用，其可在RT-PCR 技術的作用下進行擴增，達到具有敏感性和特異性的診斷價值，而CK-19 mRNA 和Vimentin mRNA 是CTCs 表達的主要因子，其用于診斷乳腺癌早期的可靠標志物對科技、經濟及社會的發(fā)展具有很好的推動作用［13］。

以往大量研究表明，臨床研究的CTCs 多以間質亞型存在，其具有存活于血液循環(huán)并適時入侵其他組織器官的能力［14］。CK-19 mRNA 作為乳腺癌CTCs 的上皮型標志物，CK 是一種骨架蛋白，其構成了上皮細胞的骨架以保持其完整和連續(xù)；同時其也構成了來源于上皮細胞的腫瘤細胞的中間絲，決定著上皮細胞的增值分化程度。正常情況下，其在外周血中不存在CK-19 mRNA；而在病理情況下，當機體乳腺組織的上皮腫瘤細胞侵入血液，血液中便可檢測到CK-19 mRNA，因此其可作為檢測乳腺癌早期、轉移或復發(fā)的指標。然而有研究指出，在轉移性的上皮型腫瘤中，在較多樣本中并不能檢測到CK-19 mRNA，可能是由于在以上皮型抗原為目的的實驗過程中，另一種細胞亞群被忽視，即Vimentin［15］。多項研究證實，血清Vimentin mRNA 是診斷乳腺癌的特異性標志物，其在疾病轉移、復發(fā)的監(jiān)測中價值較高［16］。上皮-間充質轉化過程（EMT）是指病理情況下上皮細胞轉化為間充質細胞的過程，與癌癥的進展與轉移等進程密切相關。EMT 發(fā)生時，可導致乳腺癌上皮細胞喪失其原上皮表型如Cytokeratin、Ecadherin 等，轉化為Vimentin、Fibronectin 等間質表型，細胞骨架也由以CK 為主轉變?yōu)橐訴imentin 為主。

有研究顯示，正常人生理情況下，外周血檢測不會出現Vimentin RNA，而原上皮表型的乳腺癌細胞轉化為間質性侵入外周血中，Vimentin RNA 便可在血液中檢測出。因此，其可作為檢測乳腺癌早期的靈敏指標，此外也可用作檢測患者術后殘留小病發(fā)灶的指標［17］。但有研究發(fā)現，當機體出現其它上皮細胞的癌變并且癌細胞入血時，也能引起外周血Vimentin RNA 水平升高，其檢測特異性受限［18］。因此可發(fā)現該兩項指標單項檢測時的敏感性和特異性均受限。大量研究證實，聯合兩項指標檢測可綜合兩者的優(yōu)點，避免局限性，最終提高臨床診斷的準確性和診斷價值［19-20］。本研究結果顯示，觀察組發(fā)生復發(fā)轉移數明顯多于對照組，表明復發(fā)轉移的患者外周血CK-19、Vimentin mRNA 的陽性率高，通過比較陽性率或敏感性等方面差異，較臨床影像檢測出復發(fā)轉移時間更早，突出乳腺癌外周血CK-19、Vimentin mRNA 的陽性率在早期診斷復發(fā)轉移乳腺癌中的應用價值；同時CK-19、Vimentin mRNA 聯合檢測的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值、準確性高于各指標單獨檢測，證實兩項指標聯合診斷的準確率更高，有利于乳腺癌的早期診斷及術后恢復監(jiān)測，有利于患者預后提高。

綜上所述，血清CK-19、Vimentin mRNA 對于乳腺癌的早期診斷和轉移具有一定的價值，同時指標的聯合檢測可增加準確性，指導患者治療效果明顯，值得臨床推廣應用。