基于流式分析技術的奶粉中金黃色葡萄球菌活菌快速定量檢測方法研究

王 斌, 隋志偉, 劉思淵, 王 晶, 傅博強, 王 義

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2.中國計量科學研究院前沿計量科學中心，北京 100029)

1 引 言

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種重要的食源性致病菌，是導致皮膚感染、肺炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎和其他感染的重要原因，也會引起食物中毒[1]。在所有食品安全事件中，金黃色葡萄球菌是引起食源性疾病的主要原因之一[2]。根據(jù)美國國家疾控制中心的報告，每年在美國金黃色葡萄球菌感染50萬病例，占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大為45%，其他歐洲國家如匈牙利、芬蘭等占50%以上[3]。而我國每年由金黃色葡萄球菌引起的感染事件也非常多[4]。金黃色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要病原體之一，會引起奶及奶制品的污染[5,6]。奶粉作為嬰幼兒的日常食品，其安全性直接影響嬰幼兒的健康[7]，因此，金黃色葡萄球菌快速高效檢測方法的研究對于保障乳及其制品的安全至關重要。

目前，奶粉中金黃色葡萄球菌的檢測主要依賴于平板計數(shù)法(GB 4789.10)，但卻費時費力[8]，同時也無法檢測處于活的非可培養(yǎng)(viable but non-culturable，VBNC)狀態(tài)的細菌，易造成漏檢[9]。近年來，許多新興方法被開發(fā)出來，用于實現(xiàn)奶粉中金黃色葡萄球菌的快速檢測，例如PetrifilmTM測試片法[10]和聚合酶鏈反應(PCR)法[11]等，但是，這些方法檢測時間仍然較長，特別是PCR法由于檢測目標是細菌核酸而無法區(qū)分死活菌，從而導致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性[12]。流式分析法有著快速、高效且能區(qū)分死活菌的優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛應用于致病菌檢測領域[13,14]，因此，流式分析法有望解決乳及乳制品中致病菌檢測的技術瓶頸[15,16]。

由于流式分析法具有快速靈敏等優(yōu)點，國內(nèi)外許多學者開始嘗試研究將其用于金黃色葡萄球菌的檢測。董曉林等采用特異性適配體實現(xiàn)對純培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌特異性檢測，檢測時長為40 min，然而該方法檢測限較高，為108CFU[17]。Meng等采用萬古霉素結(jié)合的磁珠富集金黃色葡萄球菌，雖然通過流式分析法能夠在120 min內(nèi)檢測到33 CFU的金黃色葡萄球菌，但是該方法無法排除死菌的干擾[18]。Rüger等和Li等分別通過流式分析法來評價金黃色葡萄球菌的存活率和超聲波處理對金黃色葡萄球菌的損傷作用[19,20]。然而，他們研究建立的方法均不能特異性檢測金黃色葡萄球菌。因此，目前尚無將流式分析法應用于奶粉中金黃色葡萄球菌快速定量檢測的報道。

本研究擬以金黃色葡萄球菌為研究對象，結(jié)合流式分析法和免疫熒光標記法，建立了一種奶粉中金黃色葡萄球菌活菌的快速定量檢測方法，旨在進一步縮短檢測周期、提高定量檢測的準確性，以期實現(xiàn)乳制品中金黃色葡萄球菌活菌的快速、高效、精確定量檢測，為食源性致病菌的快速檢測和預警提供重要的技術保障。

2 材料與方法

2.1 試劑與儀器

2.1.1 材料與試劑

本研究所用的菌株均為標準菌株，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心和美國菌種保藏中心，試驗所用菌株名稱及編號見表1。

本研究以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)標準菌株(ATCC 6538P)作為研究的目標菌株，包括金黃色葡萄球菌的表1中其他48株菌株作為本研究對照菌株。

主要試劑：腦心浸出液肉湯(BHI)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、Baird-Parker瓊脂、亞碲酸鉀卵黃增菌液均購于北京陸橋技術有限責任公司；異丙醇購于北京化工廠；偶聯(lián)有異硫氰酸熒光素(FITC)的金黃色葡萄球菌多克隆抗體(FITC-ab)購于美國KPL公司；牛奶中微生物快速純化試劑盒購于北京亦泰生物技術有限公司；熒光染料碘化丙啶(PI)購于美國Thermo Fisher Scientific公司；美素佳兒奶粉購于菲仕蘭食品貿(mào)易有限公司。

2.1.2 儀器與設備

A50-Micro型流式分析儀，英國Apogee公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；HZQ-X100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，江蘇太倉市實驗設備廠；BSC-1600ⅡB2型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司；1-14型離心機，美國Spectronics公司。

2.2 方法

2.2.1 細菌菌懸液的制備

將第2.1.1節(jié)中所述的49株常見標準菌株分別接種于7 mL BHI培養(yǎng)基中，于37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。吸取1 mL菌懸液，12 000g離心5 min后棄上清，以1 mL無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7.2)重懸，得到活菌菌懸液，備用。

經(jīng)預實驗驗證，異丙醇處理會導致細菌死亡[21]，因此本研究吸取1 mL金黃色葡萄球菌(ATCC 6538P)活菌菌懸液，加入異丙醇(終濃度70%)，室溫處理30 min，12 000g離心5 min后棄上清，沉淀以1 mL PBS重懸，得到死菌菌懸液，備用。

2.2.2 金黃色葡萄球菌的熒光標記及檢測條件設置

以綠色熒光染料FITC[22]偶聯(lián)的抗體FITC-ab特異性標記金黃色葡萄球菌，再輔以紅色熒光材料PI[23]對死亡的細菌進行標記。FITC的激發(fā)波長為495 nm、發(fā)射波長為519 nm，PI的激發(fā)波長為535 nm、發(fā)射波長為615 nm。

參照劉思淵等[24,25]的試驗方法，對反應條件進行優(yōu)化，設置如下：1 mL樣本的反應體系中PI的終濃度為1 μg/mL，F(xiàn)ITC-ab的終濃度為1 μg/mL，孵育溫度為37 ℃，孵育時間為15 min。

表1 試驗所用菌株Tab.1 List of all bacterial strains used in this study

流式分析儀具有3種檢測熒光通道：FL1=525λ，F(xiàn)L2=575λ，F(xiàn)L3=680λ。檢測時間為30 s，分析速度為10.5 μL/min，以FL1熒光通道檢測FITC-ab標記的金黃色葡萄球菌，呈現(xiàn)綠色；以FL3熒光通道檢測PI標記的死菌，呈現(xiàn)紅色。通過計數(shù)相應熒光信號，直接獲得金黃色葡萄球菌的濃度。

2.2.3 流式分析法檢測活菌的可行性

為了探討流式分析法檢測金黃色葡萄球菌活菌的可行性，將第2.2.1節(jié)中制備的金黃色葡萄球菌活菌與死菌分別與FITC-ab和PI兩種熒光探針的不同組合進行標記，制備出6組樣品，分別為：A，未標記熒光的金黃色葡萄球菌活菌；B，金黃色葡萄球菌活菌+FITC-ab；C，金黃色葡萄球菌活菌+PI；D，金黃色葡萄球菌死菌+PI；E，金黃色葡萄球菌活菌+PI+FITC-ab；F，金黃色葡萄球菌死菌+PI+FITC-ab。6組樣品經(jīng)37 ℃孵育15 min后，采用流式分析法進行檢測。

2.2.4 流式分析法特異性驗證[26]

將第2.2.1節(jié)中培養(yǎng)的49株標準菌株的菌懸液分別稀釋成濃度約為107CFU/mL的菌液，與FITC-ab(終濃度為1 μg/mL)在37 ℃下孵育15 min，用流式分析法驗證該抗體的特異性。

2.2.5 流式分析法區(qū)分死活菌的驗證

參照第2.2.1節(jié)的方法獲得金黃色葡萄球菌活菌和死菌菌懸液。碘化丙啶為紅色熒光染料，具有膜選擇性通透性，不能穿過活菌的細胞膜，只能穿過破損的細胞膜而對細胞核染色。將不同體積比(0/10，1/9，5/5，9/1，10/0)的金黃色葡萄球菌死菌和活菌菌懸液混勻，與FITC-ab和PI進行孵育后采用流式分析法檢測。

2.2.6 流式分析法的線性與靈敏度[27]

金黃色葡萄球菌經(jīng)無菌PBS溶液10倍系列稀釋后，獲得終濃度為2.32×101～2.32×108CFU/mL濃度的活菌菌懸液，再分別采用國家標準中金黃色葡萄球菌平板計數(shù)法[28]和本研究建立的流式分析法進行定量檢測，驗證流式分析法的線性與靈敏度。

2.2.7 人工污染奶粉樣品的檢測

將購買的奶粉采用國家標準中金黃色葡萄球菌平板計數(shù)法檢測不含金黃色葡萄球菌后[27] ，取25 g奶粉溶于225 mL滅菌后的PBS中，充分混勻，制備奶粉稀釋液。將用無菌PBS緩沖液10倍系列稀釋的金黃色葡萄球菌菌懸液離心后，棄上清保留沉淀，加入1 mL奶粉稀釋液，制備成終濃度為3.00×103～3.00×108CFU/mL的人工污染奶粉樣品。采用牛奶中微生物快速純化試劑盒去除奶粉稀釋樣本中的蛋白顆粒和脂肪，純化出金黃色葡萄球菌，樣品處理步驟如下：吸取500 μL的人工污染奶粉樣品置于2 mL的離心管中，加入1 mL純化試劑盒處理液，反復顛倒離心管至少100次，使之混勻，12 000g離心5 min，棄上層脂肪和中層清液，保留離心管底部的沉淀。吸取500 μL的PBS溶液重懸沉淀，全部轉(zhuǎn)移到新的離心管中，12 000g離心5 min，棄上清，取500 μL的PBS溶液重懸沉淀，得到純化的樣品溶液，加入FITC-ab和PI進行孵育，最終采用流式分析儀進行檢測。

3 結(jié) 果

3.1 金黃色葡萄球菌活菌的熒光標記

采用FITC-ab來標記金黃色葡萄球菌，再通過PI區(qū)分死菌和活菌。如圖1所示，橫坐標為FL1綠色熒光通道；縱坐標為FL3紅色熒光通道。通過圈“十”字門的方法[29]把雙參數(shù)散點圖劃分為4個象限：PI(+)表示細菌被標記上紅色熒光，PI(-)表示細菌未被標記上紅色熒光，F(xiàn)ITC(+)表示細菌被標記上綠色熒光，F(xiàn)ITC(-)表示細菌未被標記上綠色熒光。圖中，A為未標記熒光的金黃色葡萄球菌活菌；B為金黃色葡萄球菌活菌+ FITC-ab；C為金黃色葡萄球菌活菌+PI；D為金黃色葡萄球菌死菌+PI；E為金黃色葡萄球菌活菌+PI+FITC-ab；F為金黃色葡萄球菌死菌+PI+FITC-ab。金黃色葡萄球菌活菌(圖1B)和死菌(圖1F)與FITC-ab反應后，均被標記上綠色熒光；而金黃色葡萄球菌死菌(圖1D)與PI反應后，被標記上紅色熒光，活菌(圖1C)則不會被標記上紅色熒光；當金黃色葡萄球菌死菌(圖1F)或活菌(圖1E)分別同時與PI和FITC-ab反應后，活菌只會被標記上綠色熒光，死菌則同時被標記上紅色和綠色兩種熒光。結(jié)果表明，流式分析法可以檢測到金黃色葡萄球菌活菌。

圖1 金黃色葡萄球菌的熒光標記Fig.1 Fluorescent labeling of Staphylococcus aureus

3.2 流式分析法的特異性

從生產(chǎn)加工到運輸?shù)倪^程中，乳及乳制品易被多種微生物污染，如大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌，單增李斯特氏菌等[30]，因此本研究選取了乳制品中常見的49株菌株。將49株菌株分別與金黃色葡萄球菌的多克隆抗體FITC-ab進行孵育后，采用流式分析法進行檢測。圖2中橫線代表圈門，圈門內(nèi)事件表示FL1通道檢測出熒光，即金黃色葡萄球菌陽性。結(jié)果顯示見圖2，10株金黃色葡萄球菌經(jīng)FL1熒光通道均能在橫線圈門內(nèi)檢測出熒光，而其余39株對照菌株未在橫線圈門內(nèi)檢測到熒光。說明FITC-ab只與金黃色葡萄球菌發(fā)生反應，不與非金黃色葡萄球菌發(fā)生反應。因此，建立的流式分析法可以特異地檢測金黃色葡萄球菌。

3.3 金黃色葡萄球菌區(qū)分死活菌的驗證

將制備的金黃色葡萄球菌死菌菌懸液和活菌菌懸液分別按照0:10,1:9,5:5,9:1和10:0不同體積比例混合均勻，再采用流式分析法進行檢測。結(jié)果顯示見表2，流式分析法測得的金黃色葡萄球菌死菌和活菌的比例與添加比例接近，見圖3，說明流式分析法可以定量測量金黃色葡萄球菌死菌和活菌。

3.4 流式分析法的線性與靈敏度

金黃色葡萄球菌經(jīng)無菌PBS緩沖溶液進行10倍系列稀釋后，分別采用流式分析法與平板計數(shù)法進行檢測。結(jié)果顯示(表3和圖4)，當金黃色葡萄球菌的濃度在103～108CFU/mL時，流式分析法檢測出的結(jié)果與平板計數(shù)法的結(jié)果基本一致且線性良好(R2=0.999 9)。然而，當金黃色葡萄球菌的濃度小于103CFU/mL時，流式分析法與平板計數(shù)法的結(jié)果偏差較大。因此，流式分析法定量檢測PBS中金黃色葡萄球菌的濃度范圍為1.90×103～2.36×108CFU/mL，靈敏度為1.90×103CFU/mL。

表2 流式分析法檢測金黃色葡萄球菌死活菌的結(jié)果

表3 流式分析法與平板計數(shù)法檢測金黃色葡萄球菌的結(jié)果 Tab.3 Results of FCM-based method and plate counting method in detection for Staphylococcus aureus

圖2 流式分析法的特異性Fig.2 Specicity of FCM-based method for Staphylococcus aureus

圖3 流式分析法檢測金黃色葡萄球菌死菌和活菌的百分比Fig.3 Percentage of viable and dead Staphylococcus aureus cells detected by FCM-based method

圖4 流式分析法與平板計數(shù)法定量檢測金黃色葡萄球菌活菌的線性關系Fig.4 The linear relationship between the results of quantitative detection for viable Staphylococcus aureus by FCM-based method and plate counting method

3.5 人工污染奶粉樣品的檢測

將用無菌PBS緩沖液10倍系列稀釋的金黃色葡萄球菌菌懸液，離心棄上清，加入奶粉稀釋液制備成人工污染金黃色葡萄球菌的奶粉樣品。使用牛奶中微生物快速純化試劑盒處理后，通過流式細胞儀進行檢測，結(jié)果顯示(表4)，當金黃色葡萄球菌的濃度在103～108CFU/mL時，流式分析法檢測奶粉中金黃色葡萄球菌得到的結(jié)果與添加濃度基本一致。因此，流式分析法定量檢測奶粉樣品中金黃色葡萄球菌的濃度范圍為2.72×103～2.80×108CFU/mL，靈敏度為2.72×103CFU/mL。

4 討 論

我國食品安全國家標準 GB 10765-2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》明確規(guī)定克羅諾桿菌(原阪崎腸桿菌)、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是嬰兒配方食品中必檢的3種食源性致病微生物，并且公布了其相應的微生物限量指標。因此，奶粉中金黃色葡萄球菌的快速準確檢測具有重要的公共衛(wèi)生學意義。本研究采用流式分析技術，經(jīng)FITC-ab和PI雙色熒光標記后，建立了一種奶粉中金黃色葡萄球菌活菌的快速定量檢測方法。

表4 流式分析法檢測人工污染金黃色葡萄球菌的奶粉樣品的結(jié)果 Tab.4 Testing results of Staphylococcus aureus in artificially infected milk powder samples by FCM-based method

抗體的特異性是決定流式分析法成功與否的關鍵，因此，本研究選擇偶聯(lián)有FITC的金黃色葡萄球菌多克隆抗體作為金黃色葡萄球菌屬特異性標記探針[31]，將其與10株金黃色葡萄球菌菌株和其它39株非金黃色葡萄球菌菌株進行孵育后，經(jīng)流式分析法檢測只有金黃色葡萄球菌被標記上熒光，證明該抗體對于檢測金黃色葡萄球菌具有良好的特異性，同時也表明，所建立的流式分析法特異性良好。

在流式分析法檢測整個過程中，奶粉樣本前處理即金黃色葡萄球菌純化的時間為15 min，金黃色葡萄球菌與FITC-ab和PI的孵育時間為15 min，流式分析時間約為5 min，總計用時約35 min。而平板計數(shù)方法用時20～24 h[27]、PetrifilmTM測試片法用時22～26 h[10]，PCR法用時約1.5 h[11](見表5)。

表5 金黃色葡萄球菌不同檢測方法的比較Tab.5 Comparison of different detection methods for Staphylococcus aureus

與這些方法相比，流式分析法檢測金黃色葡萄球菌的時間明顯縮短，可以滿足食品中金黃色葡萄球菌快速檢測的需求。此外，流式分析法還能夠檢測VBNC狀態(tài)的細菌，可以避免平板計數(shù)法和PetrifilmTM測試片法的漏檢問題[9,10]。PCR法檢測的是細菌核酸，無法區(qū)分死菌與活菌，會造成一定程度的假陽性[11,12]。通過比較分析，流式分析法更適用于實際奶粉樣品中金黃色葡萄球菌活菌的快速準確定量檢測。

目前，平板計數(shù)法仍然是金黃色葡萄球菌檢測的經(jīng)典方法。本研究通過比較流式分析法與平板計數(shù)法，證明在103～108CFU/mL的濃度范圍內(nèi)，兩種方法定量檢測金黃色葡萄球菌活菌的結(jié)果基本一致且線性良好，流式分析法的靈敏度可達到2.72×103CFU/mL。然而，國家標準規(guī)定的乳制品中金黃色葡萄球菌的限量值為10 CFU/g(mL)，最高安全限量值為100 CFU/g(mL)，相對來說，所建立的流式分析法檢測下限仍然有些偏高，對于實際奶粉樣品的檢測需求尚存在一定差距。然而，有研究表明，在流式分析法檢測之前，若采用一定的富集方式以增加待檢細菌濃度，可以降低流式分析法的檢測下限[32]。本研究在奶粉中金黃色葡萄球菌的快速定量檢測中做了有益嘗試，同時，我們會在今后的工作中不斷優(yōu)化細菌的富集方法，進一步提升該方法的靈敏度，推動該方法在實際奶粉中金黃色葡萄球菌檢測的應用。

5 結(jié) 論

本研究探索性地建立了一種金黃色葡萄球菌活菌的快速定量檢測方法，并可對奶粉中金黃色葡萄球菌活菌進行有效檢測。雖然本研究所建立的流式分析法檢測目標微生物是金黃色葡萄球菌，但是在未來的研究中可以將該技術平臺應用于食品中其他微生物的快速、高效和精準定量檢測，具有廣闊的應用價值。