麗江烏頭根中的二萜生物堿成分研究

劉 為，任佳俐，李信瑜，陳 琳，黃 帥

西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031

麗江烏頭(AconitumforrestiiStapf)為毛茛科烏頭屬(AconitumL.)植物，分布于云南西北部及四川西南部，其性熱-味辛-有毒，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛等藥理作用；麗江地區(qū)民間常用于風(fēng)濕病鎮(zhèn)痛，全草殺蟲[1，2]。烏頭屬植物主要藥用成分為二萜生物堿，現(xiàn)代藥理研究表明二萜生物堿具有鎮(zhèn)痛、抗炎、殺蟲、免疫調(diào)節(jié)和抗心律失常等藥理活性[6]。從1981年開始陸續(xù)有學(xué)者對麗江烏頭的化學(xué)成分進(jìn)行研究，目前，從該植物中分離并鑒定出20余種二萜生物堿[1-5]，均為為高烏寧堿型C18-二萜生物堿和烏頭堿型C19-二萜生物堿[7]。已經(jīng)有學(xué)者報道過麗江烏頭中二萜生物堿的鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性[8,9]，但對麗江烏頭中二萜生物堿的強(qiáng)心活性卻未見文獻(xiàn)報道。有研究證明部分海替定型C20-二萜生物堿具有抗血小板聚集活性[10]；部分C18-二萜生物堿和烏頭堿型C19-二萜生物堿有強(qiáng)心活性和心肌保護(hù)作用[11-13]；天然來源的化合物來源廣泛、安全低毒，已經(jīng)證實(shí)一些天然來源的化合物與抗腫瘤藥物聯(lián)用具有減毒增效的作用[14]。為了拓寬麗江烏頭中的化合物成分類型，繼續(xù)找尋具有藥用價值的生物活性成分，本研究對采自云南麗江的麗江烏頭中化學(xué)成分進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。并測試了所有化合物對阿霉素誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)活性。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

麗江烏頭于2018年8月采自云南省麗江市，由云南中醫(yī)藥大學(xué)李國棟副教授鑒定，標(biāo)本(NO.2018HS0801)保存于西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院。

1.2 儀器與試劑

核磁共振波譜儀(Bruker AV 400和600，TMS為內(nèi)標(biāo)，CDCl3為溶劑)；超高效液相色譜(ACQUITY UPLCI-Class)與四級桿飛行時間質(zhì)譜(Xevo G2-S QTof)聯(lián)用儀(Waters公司)；Hei-vap digital G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph公司)；薄層層析硅膠GF254(青島海洋化工廠)；柱層析硅膠G和H(200～400目，青島海洋化工廠)；堿性氧化鋁(100～200目，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑公司)；H9c2大鼠心肌細(xì)胞(上海研生生化試劑有限公司)；阿霉素、胰蛋白酶和甲基四唑藍(lán)(MTT)(北京索萊寶生物科技有限公司)；顯色劑為碘蒸氣和改良碘化鉍鉀溶液，所用試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離

麗江烏頭塊根(11.8 kg)陰干后粉碎，95%乙醇室溫下冷浸5次，每次3天。合并濾液，減壓濃縮得乙醇浸膏。浸膏用水溶解，稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3，用石油醚萃取，每次4 L，共4次，合并萃取液，濃縮得石油醚萃取物。然后用氨水溶液將水層的pH調(diào)至9～10，最后用二氯甲烷萃取，每次4 L，共4次，合并萃取液，濃縮得到生物總堿(140 g)。生物總堿經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇(100∶1→0∶1)梯度洗脫，得到A～G七個部分，A部分經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺50∶1∶0.05→0∶1∶0.05)梯度洗脫得到A1(18 g)、A2(10.43 g)、A3(87.3 mg)、A4(1.62 g)和A5(18 g)五個部分。A1部分經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶二乙胺100∶0.5→100∶2)，得化合物2(418 mg)和11(221 mg)。A2部分經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇10∶0.2→1∶1)，得化合物5(52 mg)。A3和A4部分經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶二乙胺100∶0.6→1∶1)，得到化合物1(10 mg)、3(40 mg)、4(24 mg)、12(13 mg)和13(6 mg)。A5部分經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺10∶0.2∶0.1→1∶1∶0.5)，得到化合物9(14 mg)。E和F部分經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇10∶0.2→1∶1)，得到化合物15(1.88 g)、E3(1 g)和E4(600 mg)。E3部分經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇10∶0.2→1∶1)得到化合物7(83 mg)。E4部分經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇10∶0.4→1∶1)得到化合物8(28.4 mg)。G部分經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶二乙胺10∶0.2→1∶1)得到化合物6(817 mg)、10(40 mg)和14(17 mg)。

2.2 對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

采用MTT法測定H9c2心肌細(xì)胞存活率[15]。取對數(shù)生長期的H9c2心肌細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，6×104個細(xì)胞，孵育24 h后分組，各組均設(shè)6個復(fù)孔。空白組加入無細(xì)胞的培養(yǎng)液；正常組加入正常的心肌細(xì)胞；模型組加入8 μmol/L的阿霉素處理細(xì)胞24 h；實(shí)驗(yàn)組加入濃度為40 μmol/L的待測化合物，同時加入8 μmol/L的阿霉素，培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，4 h后吸除培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜150 μL，搖床上振搖10 min，在492 nm波長處測定吸光值(A)，按照公式:細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(正常對照組A值-空白組A值)×100% 計算細(xì)胞存活率。

圖1 化合物1～14的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-14

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

圖2 化合物1的1H-1H COSY(―)、HMBC(→)和NOESY()關(guān)鍵相關(guān)Fig.2 Key 1H-1H COSY (―),HMBC (→) and NOESY () correlations of compound 1

表1 化合物1的核磁數(shù)據(jù)(1H NMR：400 MHz；13C NMR：100 MHz，CDCl3)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

化合物2無色油狀液體；HR-ESI-MS：m/z448.563 1[M + H]+；分子式C26H41NO5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.75(3H，s，H-18)，1.04(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.11，3.25，3.31(各3H，s，3×OMe),2.01(3H，s，14-OAc)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:86.1(d，C-1)，27.1(t，C-2)，38.0(t，C-3)，34.5(s，C-4)，50.8(d，C-5)，24.6(t，C-6)，40.1(d，C-7)，78.0(s，C-8)，43.3(d，C-9)，45.3(d，C-10)，49.3(s，C-11)，29.2(t，C-12)，38.2(d，C-13)，76.0(d，C-14)，35.7(t，C-15)，83.5(d，C-16)，61.5(d，C-17)，26.6(q，C-18)，57.0(t，C-19)，49.4(t，C-21)，13.4(q，C-22)，56.4(q，1-OMe)，48.3(q，8-OMe)，56.4(q，16-OMe)，171.7(s，14-MeCO)，21.5(q，14-MeCO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]基本一致，故化合物2鑒定為14-acetoxy-8-O-methylsachaconitine。

化合物3白色無定形粉末；HR-ESI-MS：m/z464.303 0[M + H]+；分子式C26H41NO6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.04(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.20、3.25、3.27(各3H，s，3×OMe)，2.03(3H，s，14-OAc)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：85.9(d，C-1)，26.3(t，C-2)，32.8(t，C-3)，38.7(s，C-4)，45.5(d，C-5)，25.1(t，C-6)，46.4(d，C-7)，73.8(s，C-8)，46.1(d，C-9)，45.1(d，C-10)，48.9(s，C-11)，28.6(t，C-12)，35.6(d，C-13)，77.1(d，C-14)，41.0(t，C-15)，81.7(d，C-16)，62.2(d，C-17)，79.7(t，C-18)，53.2(t，C-19)，49.5(t，C-21)，13.7(q，C-22)，56.3(q，1-OMe)，56.6(q，16-OMe)，59.6(q，18-OMe)，170.8(s，14-MeCO)，21.5(q，14-MeCO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故化合物3鑒定為14-acetyltalatizamine。

化合物4白色無定形粉末；HR-ESI-MS：m/z422.290 1[M + H]+；分子式C24H39NO5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.02(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.21，3.26，3.31(各3H，s，3×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:86.4(d，C-1)，25.9(t，C-2)，37.8(t，C-3)，34.6(s，C-4)，50.9(d，C-5)，24.8(t，C-6)，45.1(d，C-7)，72.9(s，C-8)，47.1(d，C-9)，46.0(d，C-10)，48.8(s，C-11)，27.8(t，C-12)，37.7(d，C-13)，75.7(d，C-14)，38.5(t，C-15)，82.4(d，C-16)，63.0(d，C-17)，79.6(t，C-18)，53.3(t，C-19)，49.6(t，C-21)，13.8(q，C-22)，56.4(q，1-OMe)，56.6(q，16-OMe)，59.6(q，8-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故化合物4鑒定為talatisamine。

化合物5白色無定形粉末；HR-ESI-MS：m/z452.308 7[M + H]+；分子式C25H41NO6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.06(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.23，3.30，3.30，3.32(各3H，s，4×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：86.4(d，C-1)，26.1(t，C-2)，35.4(t，C-3)，39.6(s，C-4)，48.8(d，C-5)，82.5(d，C-6)，52.8(d，C-7)，72.7(s，C-8)，50.4(d，C-9)，45.8(d，C-10)，50.5(s，C-11)，28.5(t，C-12)，38.1(d，C-13)，75.7(d，C-14)，39.0(t，C-15)，82.2(d，C-16)，62.8(d，C-17)，80.9(t，C-18)，54.0(t，C-19)，49.5(t，C-21)，13.9(q，C-22)，56.6(q，1-OMe)，57.5(q，6-OMe)，56.3(q，16-OMe)，59.4(q，18-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]基本一致，故化合物5鑒定為chasmanine。

化合物6白色無定形粉末；HR-ESI-MS：m/z468.298 3[M + H]+；分子式C25H41NO7。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.07(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.23，3.30，3.30，3.32(各3H，s，4×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：83.2(d，C-1)，33.9(t，C-2)，72.2(d，C-3)，43.5(s，C-4)，48.6(d，C-5)，82.3(d，C-6)，52.4(d，C-7)，72.6(s，C-8)，48.9(d，C-9)，38.1(d，C-10)，50.2(s，C-11)，28.1(t，C-12)，45.3(d，C-13)，75.5(d，C-14)，39.1(t，C-15)，82.0(d，C-16)，62.2(d，C-17)，77.5(t，C-18)，47.4(t，C-19)，49.1(t，C-21)，13.7(q，C-22)，56.4(q，1-OMe)，57.3(q，6-OMe)，56.0 (q，16-OMe)，59.2(q，18-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]基本一致，故化合物6鑒定為ezochasmanine。

化合物7白色無定形粉末；HR-ESI-MS：m/z632.352 9[M + H]+；分子式C34H49NO10。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.09(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，2.98，3.23，3.26，3.29，3.52，3.85(各3H，s，6×OMe)，8.00(2H，d，J=8.9 Hz，H-2′/6′)，6.91(2H，d，J=8.9 Hz，H-3′/5′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：83.2(d，C-1)，33.5(t，C-2)，71.9(d，C-3)，43.2(s，C-4)，48.2(d，C-5)，82.7(d，C-6)，48.7(d，C-7)，78.7(s，C-8)，46.1(d，C-9)，35.9(d，C-10)，50.8(s，C-11)，36.8(t，C-12)，75.4(s，C-13)，79.2(d，C-14)，41.6(t，C-15)，83.9(d，C-16)，61.2(d，C-17)，77.5 (t，C-18)，47.8(t，C-19)，48.8(t，C-21)，13.5(q，C-22)，56.0(q，1-OMe)，58.7(q，6-OMe)，58.8(q，8-OMe)，59.0(q，16-OMe)，59.2(q，18-OMe)，166.4(s，14-OCOAs)，123.2(s,C-1′)，131.9(d，C-2′/6′)，113.6(s，C-3′/5′)，163.3(s，C-4′)，55.5(q，4′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]基本一致，故化合物7鑒定為crassicautine。

化合物8白色無定形粉末；HR-ESI-MS：m/z614.334 4[M + H]+；分子式C34H47NO9。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.16(3H，t，J=7.2 Hz，H-22)，3.27、3.37、3.94、3.95(各3H，s，4×OMe)，1.81(3H，s，14-OAc)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：72.3(d，C-1)，26.8(t，C-2)，29.8(t，C-3)，37.3(s，C-4)，41.5(d，C-5)，25.0(t，C-6)，43.5(d，C-7)，86.6(s，C-8)，41.5(d，C-9)，40.8(d，C-10)，49.1(s，C-11)，29.2(t，C-12)，39.3(d，C-13)，76.0(d，C-14)，38.6(t，C-15)，83.2(d，C-16)，63.4(d，C-17)，78.9(t，C-18)，56.6(t，C-19)，48.6(t，C-21)，13.0(q，C-22)，56.8(q，16-OMe)，59.5(q，18-OMe)，171.3(s，14-MeCO)，21.6(q，14-MeCO)，164.9(s，OCOVr)，123.6 (s， C-1′)，111.8(d，C-2′)，148.8(s，C-3′)，153.1(s，C-4′)，110.4(d，C-5′)，123.4 (d，C-6′)，56.1(q，3′-OMe)，56.1(q，4′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]基本一致，故化合物8鑒定為geniculatine C。

化合物9白色無定形粉末；HR-ESI-MS：m/z408.273 8[M + H]+；分子式C23H37NO5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.04(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.25、3.32(各3H，s，2×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：86.4(d，C-1)，25.9(t，C-2)，32.3(t，C-3)，39.2(s，C-4)，46.0(d，C-5)，24.7(t，C-6)，45.9(d，C-7)，73.1(s，C-8)，47.1(d，C-9)，37.7(d，C-10)，48.9(s，C-11)，27.8(t，C-12)，45.7(d，C-13)，75.7(d，C-14)，38.4(t，C-15)，82.3(d，C-16)，63.1(d，C-17)，68.9(t，C-18)，53.1(t，C-19)，49.6(t，C-21)，13.8(q，C-22)，56.6(q，1-OMe)，56.4(q，16-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]基本一致，故化合物9鑒定為cammaconine。

化合物10無色棱晶(石油醚∶丙酮=10∶1)；HR-ESI-MS：m/z372.244 6[M + H]+；分子式C23H33NO3。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.74(3H，s，H-18)，1.03(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.25，3.34(各3H，s，2×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：80.1(d，C-1)，25.0(t，C-2)，38.1(t，C-3)，35.2(s，C-4)，48.8(d，C-5)，26.4(t，C-6)，42.8(d，C-7)，41.2(s，C-8)，40.1(d，C-9)，45.1(d，C-10)，51.5(s，C-11)，29.7(t，C-12)，46.9(d，C-13)，211.3(s，C-14)，30.6(t，C-15)，79.7(d，C-16)，77.4(d，C-17)，26.6 (q，C-18)，57.1(t，C-19)，50.4(t，C-21)，13.5(q，C-22)，55.9(q，1-OMe)，56.8(q，16-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]基本一致，故化合物10鑒定為vilmoraconitine。

化合物11無色油狀液體；HR-ESI-MS：m/z402.276 0[M + H]+；分子式C24H35NO4。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.05(3H，t，J=7.2 Hz，H-22)，3.27、3.29、3.37(各3H，s，3×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：79.9(d，C-1)，24.5(t，C-2)，33.1(t，C-3)，39.4(s，C-4)，44.3(d，C-5)，26.4(t，C-6)，43.0(d，C-7)，41.0(s，C-8)，40.1(d，C-9)，45.1(s，C-10)，51.2(s，C-11)，29.6(t，C-12)，46.9(d，C-13)，211.1(s，C-14)，30.5(t，C-15)，79.8(d，C-16)，79.6(d，C-17)，77.8 (t，C-18)，53.5(t，C-19)，50.4(t，C-21)，13.5(q，C-22)，55.9(q,1-OMe)，56.8(q，16-OMe)，59.6(q，18-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]基本一致，故化合物11鑒定為aconitramine A。

化合物12白色無定形粉末；HR-ESI-MS：m/z376.249 1[M + H]+；分子式C22H33NO4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：1.09(3H，s，H-18)，3.12、3.23、3.37(各3H，s，3×OMe)，7.20(1H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：84.8(d，C-1)，26.0(t，C-2)，32.7(t，C-3)，45.8(s，C-4)，46.7(d，C-5)，25.1(t，C-6)，47.4(d，C-7)，77.3(s，C-8)，45.3(d，C-9)，46.3(d，C-10)，48.3(s，C-11)，27.9(t，C-12)，37.7(d，C-13)，75.3(d，C-14)，32.0(t，C-15)，82.1(d，C-16)，61.9(d，C-17)，23.0(q，C-18)，169.2(d，C-19)，56.2(q，1-OMe)，48.6(q，8-OMe)，56.6(q，16-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]基本一致，故化合物12鑒定為vilmorrianine G。

化合物13無色油狀液體；HR-ESI-MS：m/z404.279 8[M + H]+；分子式C24H37NO4。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.05(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.24、3.30、3.39(各3H，s，3×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：84.9(d，C-1)，26.1(t，C-2)，33.8(t，C-3)，37.6(s，C-4)，137.4(s，C-5)，119.0(d，C-6)，22.3(t，C-7)，46.9(t，C-8)，48.5(s，C-9)，37.3(d，C-10)，40.9(s，C-11)，36.4(t，C-12)，49.0(d，C-13)，218.2(s，C-14)，37.5(t，C-15)，80.1(d，C-16)，50.5(t，C-17)，78.6(t，C-18)，54.5(t，C-19)，52.7(t，C-21)，12.5(q，C-22)，54.8(q，1-OMe)，56.1(q，16-OMe )，59.4(q，18-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]基本一致，故化合物13鑒定為hemsleyaconitine G。

化合物14白色無定形粉末；HR-ESI-MS：m/z384.220 2[M + H]+；分子式C23H29NO4。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.45(3H，s，H-18)，2.02(3H，s，2-OAc)，2.33(3H，s，H-21)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：35.9(t，C-1)，71.0(d，C-2)，43.4(t，C-3)，36.9(s，C-4)，63.2(d，C-5)，203.7(s，C-6)，50.5(t，C-7)，41.9(s，C-8)，59.3(d，C-9)，44.6(s，C-10)，22.8(t，C-11)，52.9(d，C-12)，211.8(s，C-13)，50.5(d，C-14)，44.0(t，C-15)，142.3(s，C-16)，110.7(t，C-17)，31.3(q，C-18)，60.5(t，C-19)，68.6(d，C-20)，43.4(q，C-21)，170.0(s，2-MeCO)，21.7(q，2-MeCO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]基本一致，故化合物14鑒定為heterophylloidine。

3.2 活性測試結(jié)果

結(jié)果表明，化合物濃度在40 μmol/L時，3、10、11和12表現(xiàn)出一定的保護(hù)活性，其細(xì)胞存活率分別為69.92%、64.90%、74.86%和69.90%(阿霉素的細(xì)胞存活率為61.49%)。

4 結(jié)論

本研究對麗江烏頭干燥塊根進(jìn)行了二萜生物堿成分的研究，共分離得到1個新的烏頭堿型C19-二萜生物堿和13個已知化合物。分離得到的化合物結(jié)構(gòu)類型涉及：9個烏頭堿型C19-二萜生物堿、2個重排型C19-二萜生物堿、1個7，17次裂型C19-二萜生物堿和1個海替定型C20-二萜生物堿。除化合物4和9外，其余化合物均為首次從該植物中分離得到。發(fā)現(xiàn)麗江烏頭中除了烏頭堿型還有其他類型的C19-二萜生物堿與C20-二萜生物堿，豐富了麗江烏頭的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類型，也為闡明麗江烏頭藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一定依據(jù)。同時考察了化合物對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)活性，發(fā)現(xiàn)在濃度40 μmol/L時，化合物3、10、11和12表現(xiàn)出了一定的保護(hù)活性。因此為發(fā)現(xiàn)能夠減少因化療藥物副作用所致心肌損傷的新藥和深入研究二萜生物堿的活性提供了線索。