清金化痰湯聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦對產ESBLs肺炎克雷伯菌體外抑菌的研究

周曉瑩 郭永聰 劉艷 鄧文喻 畢婷婷

1廣東省婦幼保健院檢驗科，廣州 510010；2廣東省婦幼保健院藥學部，廣州 510010

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是從人體、自然環(huán)境中感染檢出率較高的革蘭陰性桿菌，常常導致人體泌尿道、呼吸道或其他部位出現(xiàn)炎性癥狀，也能引發(fā)敗血癥、腦膜炎等疾病。隨著β-內酰胺類抗生素在臨床上的廣泛使用，KP耐藥率呈現(xiàn)上升的趨勢［1］。這主要與KP能產生超廣譜β-內酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）有關。ESBL 是由質粒介導的，主要以單酰胺類、青霉素酶類及頭孢菌素抗生素為水解對象的β-內酰胺酶。近年來發(fā)現(xiàn)，產ESBL 菌株耐藥的抗生素從對常規(guī)β-內酰胺類耐藥發(fā)展到有部分對氨基糖苷類、喹諾酮類等也出現(xiàn)耐藥的現(xiàn)象，臨床上尚未研究出有效的治療方案。我國細菌耐藥性監(jiān)測中顯示，2018年產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌（ESBL-KP）的檢出率達30%以上，對絕大部分青霉素類、一到三代頭孢菌素的耐藥率也高于30%［2］。ESBL-KP 用藥方案越來越受到臨床醫(yī)生的廣泛關注，因此，如何減少抗生素的耐藥率，并增強對ESBL-KP 的療效有著十分重要的臨床意義。本文通過對15例ESBL-KP 菌株進行體外實驗，以探討清金化痰湯聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦在治療ESBL-KP 中的應用前景。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 本文樣本選取2019 年1 月至2020 年2 月期間，本院患者送至檢驗科進行檢驗的痰標本，分離出產ESBL-KP 菌株15 例。分為抗菌藥組（頭孢哌酮/舒巴坦）、中藥組（清金化痰湯）、聯(lián)合組（清金化痰湯聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦）以及陰性對照組（培養(yǎng)液）4 個組別。所選菌株嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行分離培養(yǎng)操作。采用Vitek 2 Compact 細菌分析儀鑒定及初步選出ESBL 陽性菌株，根據(jù)CLSI 推薦的紙片擴散法對初篩后的15 株ESBL-KP進行表型確認試驗。

1.2 儀器與試劑 主要儀器：梅里埃VITEK2 Compact細菌分析儀，海爾HR型生物安全柜，HF240型培養(yǎng)箱，新華牌LMQ.C 型立式高壓滅菌器；主要試劑：頭孢哌酮/舒巴坦（SCF，購買自輝瑞制藥公司，2∶1），M-H 瓊脂平板、M-H 肉湯培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板（均為杭州天和公司生產）。

1.3 方法

1.3.1 清金化痰湯制備 將黃芩、山梔子各12 g，茯苓、橘紅、貝母、麥門冬、桔梗各9 g，桑白皮、瓜蔞仁、知母各15 g，甘草3 g作為原料倒入藥鍋內，加水400 ml浸泡30 min后用武火煮沸，沸后改用文火煎煮30～40 min，收集煎液，用無菌紗布過濾，繼續(xù)加水300 ml，同法煎制，將2次煎液過濾合并，加熱濃縮至約33 ml，得每1 ml 相當于原藥材4 g 的中藥水煎劑溶液。

1.3.2 細菌培養(yǎng)和菌液制備 將15 株產ESBL 肺炎克雷伯菌株，采用分區(qū)劃線法分別接種，經35℃18～24 h培養(yǎng)后，用一次性接種環(huán)挑取單個菌落1～2 個，調整至0.5 麥氏濁度，加入M-H 肉湯作直至稀釋倍數(shù)為1∶10，以此調制為15份實驗菌液。

1.3.3 測定單藥最低抑制濃度 將配制備好的15 株頭孢哌酮/舒巴坦、清金化痰湯藥物原液，用肉湯倍比稀釋將兩種藥物分別配制成8 個濃度梯度的藥液備用，準確吸取1 ml 各濃度藥液依次加入試管，每管加入配制的15 株產ESBL 肺炎克雷伯菌菌液50 μl；同時設陰性對照；35℃培養(yǎng)18～24 h 后肉眼大致觀察肉湯的清亮和混濁程度，中藥濃縮液顏色太深觀察不清的，從中取一環(huán)接種于普通培養(yǎng)基上，置37℃恒溫箱內培養(yǎng)24 h 后觀察結果，記錄15 株菌對頭孢哌酮/舒巴坦、清金化痰湯的MIC。

1.3.4 聯(lián)合藥敏試驗 根據(jù)15 株產ESBL 肺炎克雷伯菌對清金化痰湯、頭孢哌酮/舒巴坦的MIC 結果，以單藥對15 株ESBL-KP 所測MIC 的2 倍作為最高濃度，采用以上同樣稀釋方法分別配制出8 個濃度梯度，不同濃度清金化痰湯、頭孢哌酮/舒巴坦藥液依次取量0.5 ml，應用棋盤法的設計兩兩配對組合加入試管中，然后將上述盛有藥物稀釋液的試管在121℃下高壓滅菌30 min，冷卻后再分別加入15株試驗菌液50 μl，35℃培養(yǎng)18～24 h。選擇上述棋盤模型中，記錄兩藥聯(lián)用最佳組合效應時的MIC 值，即清金化痰湯聯(lián)合的MIC 和頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合的MIC；單獨用藥時的MIC，即清金化痰湯單用的MIC 和頭孢哌酮/舒巴坦單用時的MIC，最后計算部分FIC，判定清金化痰湯與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)用后的抑菌效果。

1.3.5 結果判別 35℃培養(yǎng)18～24 h 后，肉眼大致觀察管底無出現(xiàn)細菌沉淀、肉湯清亮的最低抗菌藥物濃度記錄為MIC。FIC指數(shù)=（頭孢哌酮/舒巴坦藥聯(lián)用時的MIC÷頭孢哌酮/舒巴坦藥單用時的MIC）+（清金化痰湯聯(lián)用時的MIC÷清金化痰湯單用時的MIC），F(xiàn)IC≤0.5 為協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1 為相加作用；1＜FIC≤2 為無關作用；FIC＞2 為拮抗作用。

1.4 統(tǒng)計學分析 本文數(shù)據(jù)處理參考SPSS20.0 分析軟件，計量資料表示為均數(shù)±標準差（），單藥與聯(lián)合用藥組間的計量數(shù)據(jù)采用t 檢驗比較，當P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 單藥及聯(lián)合用藥對ESBL-KP 菌株MIC 的影響中藥組、抗菌藥組分別與聯(lián)合組相比，MIC 差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。各組MIC值均數(shù)見表1所示。

2.2 聯(lián)合用藥的FIC 指數(shù) 清金化痰湯聯(lián)合SCF 用藥對ESBL-KP菌株的FIC≤0.5，為協(xié)同作用。

表1 各藥物分組對ESBL-KP的MIC值

3 討 論

本院在2016 至2018 年期間臨床總共分離出1 632 例KP，其中ESBL-KP 有817 例，檢出率高達50.0%。碳青霉烯類抗生素是治療ESBL-KP 的最后一道防線，但KP 對美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別從2005 年的2.9%和3.0%上升到了2017 年的24.0%和20.9%，耐藥率上升幅度高達8倍，而且一旦出現(xiàn)碳青霉烯酶耐藥的KP，多數(shù)患者病情危重，病死率高。我們另辟蹊徑，尋找治療ESBL-KP新思路。

本文中清金化痰湯與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合應用對產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌在體外環(huán)境下具有明顯的協(xié)同抑制作用。近年來，SCF 廣泛應用于細菌性肺炎的治療并具有良好的臨床療效，對產ESBLs 菌株有較強的抑制作用，但其耐藥率也明顯提高，可達32.1%。中藥治療病原菌因其具有不易產生耐藥、不良反應小等優(yōu)勢而受到廣泛的關注。近年研究表明中醫(yī)藥對逆轉耐藥細菌具有很好的優(yōu)勢及廣闊的探索空間，其機制大致可分為直接抑制和間接抑制作用［3-5］。直接抑制包括抗生素靶標位點的突變或重組、抑制細菌外排泵、消除生物被膜、逆轉細菌耐藥質粒以及改變細胞膜的通透性等；間接抑制主要指通過增強機體免疫力及改善微生態(tài)的穩(wěn)定而產生抗耐藥性。

KP 引起的肺部感染中醫(yī)證型以實證為主，痰熱壅肺證是其主要證候［6］。針對痰熱壅肺的病理癥狀，服以清熱潤肺、化痰止咳的清金化痰湯臨床療效已確切獲多個研究的認可［7-8］。清金化痰湯方中黃芩為君藥，黃芩苷為其主要成分，知母、桑白皮、瓜蔞仁、山梔子共為臣藥。黃芩有明顯地抑制炎癥反應，調節(jié)免疫功能的作用［9］；黃芩和魚腥草水煎藥則含有可溶性抑菌成分，能消除KP的生物被膜［10］。張曉玲和于翠香［11］研究顯示黃芩苷與某些抗生素聯(lián)用后，可以通過抑制β-內酰胺酶、質粒消除逆轉多重耐菌的耐藥性，對抗菌活性有一定協(xié)同作用。Luo J 等［12］則證明了黃芩苷能抑制銅綠假單胞菌生物膜形成并具有增強多種常見抗生素抑菌作用的能力。知母主要通過抗菌、抗炎、解熱發(fā)揮重要作用［13］，其中前胡、知母、黃芩等聯(lián)合西藥在嬰幼兒KP肺炎中療效顯著。其他成分如桑白皮和魚腥草可抑制肥大細胞分化、增殖及釋放炎性介質［14-15］；瓜蔞子可減輕炎癥反應，起到有清熱滌痰的作用［16］；茯苓可增強機體巨噬細胞免疫功能［17］等。由此推測，清金化痰湯可通過黃芩直接消除生物被膜、抑制β-內酰胺酶活性或逆轉細菌耐藥質粒以及通過知母、桑白皮、瓜蔞子等抗菌與抗炎的間接抑制作用對ESBL-KP達到抑菌效果。

本研究從中藥角度尋找改善頭孢哌酮/舒巴坦在KP 應用的治療方案，取得一定預期結果，希冀可以改善ESBL-KP肺炎治療效果和患者預后，提高肺炎治療水平，為臨床的治療和研究提供一些新的思路。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。