大鼠腎間質纖維化早期的差異蛋白質篩選與annexin A5表達的動態(tài)分析*

李肖肖， 陸大祥， 王華東， 戚仁斌， 張珂珂， 王達安△

（1暨南大學基礎醫(yī)學院病理生理學系，國家中醫(yī)藥管理局病理生理重點實驗室，廣東廣州510632；2佛山市第二人民醫(yī)院護理部，廣東佛山528200）

腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是多種慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）發(fā)展到終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）的共同病理基礎，有效干預RIF 的發(fā)生發(fā)展是控制CKD 進展、延緩腎功能衰竭發(fā)生的關鍵[1]。疾病蛋白質組學（disease proteomics）通過全面、系統(tǒng)地觀察疾病狀態(tài)下蛋白質組（proteome）的變化規(guī)律來闡明疾病發(fā)生機制，并發(fā)現(xiàn)疾病標志物和干預新靶點。本研究采用雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）和質譜（mass spectrometry，MS）技術，分析大鼠單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）所致RIF 模型的蛋白質組表達模式的變化情況，以期發(fā)掘出有助于探討RIF 發(fā)病規(guī)律的有價值信息。

材料和方法

1 材料與儀器

甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、N，N，N"，N"-四甲基乙二胺、碘乙酰胺、Bradford 法和BCA 法蛋白質定量測定試劑盒及15～150 kD Protein Ladder（Bio-Rad）；二硫蘇糖醇和過硫酸銨（Amresco）；IPG非線性（pH 4～7，24 cm）干膠條（GE）；考馬斯亮藍R350（上海生物工程股份有限公司）；ECL 發(fā)光液（Millipore）；β-tubulin 單抗和膜聯(lián)蛋白A5（annexin A5）單抗（Abcom）；HRP 標記的抗兔和抗鼠IgG 抗體（上海碧云天生物科技公司）。

5427 R 高速低溫離心機（Eppendorf）；MBX51 倒置熒光顯微鏡（Olympus）；RM2235 切片機（Leica）；JB-L7 組織包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；KZ-Ⅱ電動組織勻漿器（武漢塞維爾科技有限公司）；手術器械（上海醫(yī)療器械有限公司）；Ettan IP Gphor 3 等電聚焦系統(tǒng)、SE 600 垂直電泳系統(tǒng)和ImageJ 2-DE 分析軟件（GE Healthcare）；GS800凝膠掃描儀（Bio-Rad）；4800串聯(lián)飛行時間質譜儀（Applied Biosystems）。

2 方法

2.1 UUO大鼠RIF模型構建及腎臟組織病理分析

2.1.1 實驗動物與分組 雄性Wistar大鼠48只，體質量180～220 g，購于北京華阜康實驗動物有限公司[許可證號為SCXK（魯）2014-00070]，飼養(yǎng)于暨南大學動物實驗管理中心SPF 動物飼養(yǎng)房：室溫（23±2）℃，相對濕度40%～70%，標準顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水。48 只大鼠隨機分為3 組：正常對照組（control 組）6 只、假手術組（sham 組）6 只和UUO 模型組（UUO組）36只。

2.1.2 UUO大鼠模型制備與腎臟組織標本取材[2]UUO 組大鼠以2%戊巴比妥鈉（20 mg/kg 體重）腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術臺上，手術區(qū)用脫毛膏脫毛，75%乙醇消毒皮膚，腹腔中線中下段作一長2～3 cm 的縱向皮膚切口，并逐層分離腹壁，輕輕分離右側輸尿管，用3 號手術絲線于輸尿管上下段兩處各作1 道結扎，逐層縫合腹壁切口，無菌敷料包裹傷口，待動物清醒后放回飼養(yǎng)籠。control 組不作任何手術處理；sham 組開腹后僅進行右側輸尿管鈍性分離，不予結扎，其他步驟同UUO 組。所有大鼠術后均肌肉注射獸用頭孢曲松Ⅲ（0.1 mg/kg），每12 h 注射1 次，連續(xù)使用3 d，以預防術后感染。UUO 大鼠在術后第3 天、第7 天、第11 天、第14 天、第21 天和第28天分別隨機選取6只，處死后取右腎上極組織，浸泡在4%多聚甲醛中固定，作HE 染色及Masson 染色進行病理組織學分析；取右腎下極組織，在適量RIPA 裂解液中勻漿，12 000 r/min 離心20 min，取上清液，采用BCA 法進行蛋白定量，加入5×蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，離心5 s后-20℃保存，以備Western blot 分析。control 組和sham 組分別于飼養(yǎng)或手術后第28天按相同方法取腎臟標本。

2.1.3 腎臟組織切片制備及觀察 腎組織標本經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜，梯度乙醇脫水、二甲苯透明處理后行石蠟包埋，制成4 μm 切片，分別進行HE 染色和Masson 染色。HE 染色：蘇木素水溶液染色5 min，自來水沖洗1 min，1%鹽酸乙醇分化2 s，自來水沖洗1 min，伊紅水溶液染色5 min，自來水沖洗1 min，用濃度由低到高的乙醇脫水處理，二甲苯處理使組織透明，中性樹膠封片；置于倒置顯微鏡下觀察、采集圖像。Masson 染色：蘇木素染色5 min，麗春紅酸性染液染色10 min，苯胺藍染液染色6 min；中性樹膠封片；置于倒置顯微鏡下觀察、采集圖像。

2.2 差異蛋白質組學分析方法

2.2.1 實驗標本采集、蛋白質提取和定量 按2.1.1方法制備UUO模型，共3只大鼠，術后7 d處死動物取雙腎組織標本，以左側健腎（non-obstructive kidney）與右側梗阻腎（obstructed kidney）作對照行2-DE 分析。腎臟組織加入適量全細胞裂解液，用勻漿器勻漿，冰浴超聲裂解，4℃、14 000×g離心40 min，取上清；采用Bradford法進行蛋白質定量，-80℃低溫保存。

2.2.2 2-DE分析方法 一向等點聚焦電泳：干膠條水化：將樣品溶液加入水化盤，然后放入干膠條浸泡12 h；膠條上槽：等電聚焦盤內(nèi)加6 mL 覆蓋油，將泡好的膠條放入盤內(nèi)；上樣：上樣成分包括樣品蛋白、1%二硫蘇糖醇、1% IPG Buffer、溴酚藍，總體積460 μL，蛋白上樣量為1 200 μg；依次等電聚焦：500 V×1 h、1 000 V×1 h、10 000 V×3 h、10 000 V×4 h，總電壓約60 kV。二向SDS-PAGE：按說明書安裝制膠架和電泳槽，按12.5%SDS-PAGE 凝膠配方進行配膠，加入過硫酸銨、N，N，N"，N"-四甲基乙二胺和正丁醇，灌膠，凝固過夜。膠條平衡：平衡管先后加入含二硫蘇糖醇平衡液及含碘乙酰胺平衡液，各平衡15 min。取出平衡后膠條，放入灌制好凝膠的玻璃板內(nèi)，緊貼膠面，加上槽液到上下槽液面相平，以2 W/gel×1 h、17 W/gel×4.5 h 電泳（溴酚藍跑到底）?？捡R斯亮藍染色：取出電泳后凝膠，放入250 mL 固定液中固定10 min，然后將凝膠放入盛有考馬斯亮藍的染色盤中，搖床上室溫染色3 h。上述實驗重復3 次。凝膠圖像的掃描和分析：用凝膠掃描儀對染色后的凝膠進行掃描，獲得凝膠電泳圖像，通過ImageJ 2-DE 軟件進行蛋白質差異表達分析，選取在不同樣本中表達差異均超過1.5倍的蛋白點作為差異表達蛋白質。

2.2.3 差異蛋白質的MS 鑒定 選取19 個差異倍數(shù)顯著、斑點清晰的差異蛋白質點，切膠后使用胰蛋白酶進行膠內(nèi)酶解，酶解產(chǎn)物采用基質輔助激光解吸附電離-飛行時間質譜法（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）進行分析。MS 獲得的肽質量指紋譜通過Mascot 軟件在NCBI 蛋白質數(shù)據(jù)庫中進行檢索，選擇種屬為大鼠。

2.3 Western blot 分析 取2.1.2 方法制備的蛋白質提取液進行SDS-PAGE：5%濃縮膠電泳60 V×25 min，12%分離膠電泳120 V×1 h，至溴酚藍到達膠的底端附近終止。電泳后凝膠以350 mA×1 h 轉至PVDF 膜；PVDF 膜用5%牛血清白蛋白封閉，于常溫下?lián)u床振蕩孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min；加入抗annexin A5 抗體（1∶500）或內(nèi)參照β-tubulin 抗體（1∶1 000）常溫下?lián)u床振蕩孵育2 h，TBST 洗膜3次，每次5 min；加入HRP標記的II抗（1∶5 000），常溫振蕩孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min；加入配制好的ECL 化學發(fā)光液，放入暗匣中曝光，再進行顯影、定影；利用ImageJ 軟件對顯影蛋白條帶進行灰度分析。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 各組大鼠腎組織切片HE染色觀察結果

光鏡下觀察可見，與control 組相比，sham 組腎組織無明顯變化，腎小球形態(tài)正常、無萎縮，腎小管排列整齊、無擴張，腎小管上皮細胞形態(tài)規(guī)整，腎間質未見炎癥細胞浸潤和纖維增生；在各UUO 組梗阻側腎臟可見不同程度的組織病變，其中，術后第3 天僅出現(xiàn)腎小管擴張，腎小球無明顯改變，無明顯間質增生；術后第7 天除腎小管擴張外，腎間質有少量炎癥細胞浸潤及極輕微增生，未見明顯腎小球變化；術后第11 天腎小管進一步擴張，間質炎癥細胞浸潤加重，腎間質出現(xiàn)輕度增生，腎小球結構尚完整；術后第14、21 和28 天，腎小球逐漸變形、萎縮，腎小管上皮細胞萎縮或消失，術后第14天RIF明顯，術后第21和28天出現(xiàn)廣泛大面積的RIF，見圖1。

2 各組大鼠腎組織切片Masson染色觀察結果

光鏡下觀察可見，與control 組相比，sham 組腎組織無明顯變化，腎小管排列整齊、無擴張，腎小管上皮細胞形態(tài)規(guī)整，腎間質未見增生、無明顯藍染，腎小球形態(tài)正常；在各UUO組梗阻側腎臟所見與HE染色結果一致，逐漸出現(xiàn)腎小管擴張，腎小管上皮細胞萎縮，腎小球變形、萎縮，腎間質炎癥細胞浸潤、纖維組織增生，代表腎間質纖維增生的藍染逐漸加重；其中，術后第3 天腎間質無明顯藍染，術后第7 天出現(xiàn)輕微腎間質藍染，表明腎間質有少量膠原纖維沉積，術后第11 天腎間質增生藍染進一步加重，術后第14 天開始腎間質增生藍染明顯，術后第21 和28天出現(xiàn)大面積腎間質增生藍染，表明腎間質膠原纖維廣泛沉積，見圖2。

Figure 1. Pathological sections of kidney tissue with HE staining in different groups.圖1 各組大鼠腎臟組織切片HE染色光鏡下觀察結果

Figure 2. Pathological sections of kidney tissue with Masson staining in different groups.圖2 各組大鼠腎臟組織切片Masson染色光鏡下觀察結果

3 UUO大鼠RIF早期的2-DE分析結果

將UUO 造模后第7 天的健側腎（non-obstructive kidney）與梗阻腎（obstructed kidney）的組織蛋白質提取液行2-DE 及考馬斯亮藍染色（圖3），經(jīng)ImageJ 2-DE 圖像分析軟件分析，共獲得重復出現(xiàn)、表達量差異≥±1.5 倍的差異蛋白質點166 個。其中，與健側腎相比，梗阻腎出現(xiàn)上調(diào)蛋白質81 個，下調(diào)蛋白質85個。圖4 為從2-DE 圖像上選取的用于MS 鑒定的19個差異蛋白質點的截圖（每組截圖的左側為健側腎，右側為梗阻腎）。

Figure 3. The two-dimensional gel electrophoresis profiles of the proteins from non-obstructive kidney（A）and obstructed kidney（B）tissues in UUO rats.圖3 UUO大鼠健側腎與梗阻腎組織蛋白質的雙向凝膠電泳結果

Figure 4. The screenshots of 19 differential proteins chosen for identification by MS. The left image of each pair showed the protein from non-obstructive kidney，while the right one showed the protein from obstructed kidney.圖4 19個作質譜鑒定的差異蛋白質截圖

4 差異蛋白質的MS分析結果

19 個差異蛋白質點的MALDE-TOP-MS 結果經(jīng)Mascot 軟件查詢蛋白質數(shù)據(jù)庫，獲得蛋白質的基本信息，見表1；經(jīng)UniProt 數(shù)據(jù)庫及相關研究文獻檢索到相應蛋白質的功能注釋，見表2。

5 Western blot分析的結果

Western bolt 分析結果顯示，sham 組annexin A5蛋白有少量表達，UUO 各組annexin A5 蛋白表達量均顯著高于sham 組（P＜0.05），以UUO 術后第3 天表達量最高，之后隨著梗阻時間的延長而逐漸下降，但仍顯著高于sham組，見圖5。

討論

RIF 通常呈慢性、進行性發(fā)展，當發(fā)展到一定階段將難以逆轉，因此，早期的干預對延緩其進展極為重要。蛋白質作為生命活動的主要參與者，是構成動態(tài)生命過程的基礎，許多疾病的發(fā)生與蛋白質異常有著密切的關系；眾多細胞受體、細胞內(nèi)信號轉導分子、酶等蛋白質已成為開發(fā)藥物的重要靶點；差異蛋白質組學具有傳統(tǒng)蛋白質研究方法無法比擬的高通量分析能力，已成為發(fā)現(xiàn)疾病相關蛋白質的強有力篩選工具。利用差異蛋白質組學方法分析RIF 早期的蛋白質組表達模式變化，將有助于發(fā)掘出闡明其發(fā)病機制的有用信息，進而為開發(fā)出新的干預策略提供重要的思路。

表1 差異蛋白質的質譜鑒定結果Table 1. Results of mass spectrometry analysis for differential proteins

本研究的UUO 模型病理分析顯示，輸尿管梗阻后7 d的梗阻腎開始出現(xiàn)輕微間質纖維化，此時是組織取材和分析RIF 早期蛋白質組變化情況的合適時間點?？紤]到動物蛋白質組表達存在著個體差異，為降低這種因素對差異蛋白質分析可能造成的影響，我們在2-DE 分析中采用實驗動物的梗阻側腎與健側腎的自身對照；共找到表達量差異≥1.5 倍的蛋白質差異點166 個，其中，梗阻腎表達為上調(diào)的有81個，下調(diào)有85個。我們選取了其中19個較有代表性的蛋白質差異點進行MS 分析，鑒定出19 種蛋白質，它們的功能涉及血管功能調(diào)節(jié)、細胞信號轉導、氧化應激、抗氧化反應、內(nèi)質網(wǎng)功能調(diào)節(jié)、能量代謝和細胞凋亡等多個方面。

隨后，我們采用Western bolt 對其中一種差異蛋白annexin A5 在UUO 模型的表達進行了驗證，觀察了該蛋白在RIF 發(fā)展過程中的動態(tài)變化情況。這是一種含319 個氨基酸、由單條多肽鏈構成的蛋白質，屬于鈣依賴性磷脂結合蛋白家族成員，具有與磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）特異性結合的特性，以鈣離子依賴的方式與磷脂膜相結合；其基因ANXA5定位于4號染色體長臂2區(qū)6～8帶處，含13個外顯子和12 個內(nèi)含子；是哺乳動物細胞中含量最豐富、分布最廣泛的一種膜聯(lián)蛋白[3-4]。文獻資料顯示，annexin A5 參與許多生理和病理過程，包括參與凝血、炎癥反應、細胞遷移和增殖、細胞凋亡和膜運輸?shù)然顒拥恼{(diào)節(jié)過程。該蛋白于1985 年被發(fā)現(xiàn)具有抗凝血作用而被命名為抗凝蛋白；它具有抗凝血功能是因為能與PS 結合而掩蓋血小板膜上的磷脂結合位點，阻礙凝血因子與膜磷脂結合而激活的凝血啟動過程[5]。此外，annexin A5還能下調(diào)組織因子（tissue factor，TF）的表達[6]。既往研究資料表明，annexin A5參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)過程；在細胞凋亡早期，PS 從胞膜內(nèi)側轉位到外側，PS 的轉位會誘導周圍的吞噬細胞識別并清除凋亡細胞，但annexin A5與PS 有極高的親和力，兩者結合會阻礙PS 的暴露，從而抑制吞噬細胞對凋亡細胞的識別和結合，進而抑制凋亡進程[7]。Hawkins 等[8]報道，敲除ANXA5基因的DT40 細胞因缺乏annexin A5 而無法發(fā)生鈣離子依賴的細胞凋亡，這也說明annexin A5 具有抗凋亡活性。還有研究資料顯示，annexin A5 可能參與器官纖維化過程。Luo 等[9]報道，硅誘導的肺纖維化小鼠血漿和肺組織annexin A5 含量顯著升高，并證實硅誘導的肺纖維化小鼠TGF-β1 和IL-1 表達的上調(diào)是依賴于annexin A5 的，他們認為annexin A5 通過促進巨噬細胞活化、促進肺部炎癥而介導肺纖維化的發(fā)生。Buckley 等[10]報道，特發(fā)性肺纖維化患者肺泡灌洗液中含高濃度可溶性annexin A5，annexin A5的高表達與肺部炎癥和纖維化存在顯著相關性；此外，經(jīng)annexin A5 處理的肺泡Ⅱ型上皮細胞能刺激培養(yǎng)的成纖維細胞增殖及炎癥因子和促纖維化細胞因子的釋放。最近有研究報道，annexin A5 通過促進自噬體向溶酶體的遞送來促進自噬[11]。我們Western bolt 的檢測結果表明，UUO 術后大鼠梗阻腎的annexin A5 表達明顯高于正常水平，隨后逐漸回降，但在RIF 整個發(fā)病過程中始終高于正常水平。然而，目前尚未見有關annexin A5與RIF 發(fā)病之間相關性的研究報道。綜上所述，annexin A5 與細胞凋亡、炎癥調(diào)節(jié)、肺纖維化發(fā)生等病理生理過程有一定相關性，那么annexin A5在RIF 發(fā)病過程到底起何種作用？為什么annexin A5 的表達在RIF 早期明顯增高后又有所回降，這種回降對RIF 的發(fā)生發(fā)展有何意義？annexin A5 這種變化情況是否意味著annexin A5僅僅在RIF早期的某種或某些病理變化中發(fā)揮重要作用，而非在RIF 整個發(fā)病過程都起主導作用？這些都很值得深入探討，通過進一步研究或許能揭示RIF發(fā)病過程中過去不曾被認識的規(guī)律。

表2 各差異蛋白質功能的UniProt數(shù)據(jù)庫查詢結果Table 2. Functions of the differential proteins retrieved from UniProt database

Figure 5. Expression level of annexin A5 in each group. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs sham group.圖5 各組大鼠的annexin A5表達情況