金雀異黃酮對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠海馬組織5-HT水平和神經(jīng)元自噬的調(diào)節(jié)作用*

范 勇， 洪嘉晨， 胡晶晶， 練雷棟， 邱新宇， 倪桂蓮，胡偉玲， 汪旭明， 吳仲敏△

（1臺(tái)州學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，浙江臺(tái)州318000；2臨海市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江臨海317000；3臺(tái)州學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江臺(tái)州318000）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指患者在遭受強(qiáng)烈的、超過個(gè)體所能承受的災(zāi)難性創(chuàng)傷事件后，延遲出現(xiàn)的、長(zhǎng)期性的精神心理綜合征[1]。患者常伴有抑郁、焦慮、睡眠障礙等身心障礙癥狀，嚴(yán)重者有自殺傾向[2]。近年來，隨著重大傳染病、戰(zhàn)爭(zhēng)及突發(fā)事件的不斷出現(xiàn)，PTSD 的患病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)[3]。PTSD 是應(yīng)激相關(guān)的障礙，表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)應(yīng)激信息的記憶障礙，使條件化的恐懼反應(yīng)難于抑制或消退。海馬與PTSD有密切關(guān)系，研究顯示，海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)失衡尤其是5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神經(jīng)功能低下是構(gòu)成PTSD的病理生理基礎(chǔ)之一[4]，PTSD患者的海馬體積縮小，海馬功能紊亂，海馬皮質(zhì)代謝受到明顯抑制，海馬神經(jīng)元存在異常自噬現(xiàn)象[5]，提示海馬組織5-HT 水平不足和海馬神經(jīng)元異常自噬可能參與PTSD 的發(fā)病進(jìn)程，但其具體發(fā)病機(jī)制尚未明確。金雀異黃酮（genistein，Gen）是一種來源于大豆的天然異黃酮，具有弱雌激素樣作用及神經(jīng)保護(hù)功能。近來有研究報(bào)道Gen 通過調(diào)節(jié)抑郁相關(guān)腦區(qū)5-HT 含量而產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)[6-7]，但其對(duì)PTSD 是否有干預(yù)作用，鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用連續(xù)單一應(yīng)激和足底電擊相結(jié)合的方法建立PTSD 大鼠模型[8]，觀察Gen 對(duì)PTSD 大鼠海馬組織5-HT 含量和海馬神經(jīng)元自噬的影響，探討Gen 對(duì)大鼠PTSD 的干預(yù)作用及其機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及儀器

行為學(xué)自動(dòng)觀察分析系統(tǒng)由上海吉量軟件科技有限公司提供，含攝像監(jiān)控、計(jì)算機(jī)及Super Maze 分析軟件。Gen 購(gòu)自安徽酷爾生物工程有限公司；鹽酸氟西汀分散片（本實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照藥），每片含氟西?。╢luoxetine，F(xiàn)LX）20 mg，購(gòu)自西班牙禮來公司；兔抗LC3 抗體購(gòu)自CST；兔抗beclin 1 抗體和山羊抗兔IgG-FITC 熒光Ⅱ抗購(gòu)自ABclonal；兔抗GAPDH 抗體和山羊抗兔IgG-HRP Ⅱ抗購(gòu)自Biosharp；RIPA 裂解液和BCA 試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；免疫印跡相關(guān)試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Elabscience。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康6 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體重（200±20）g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動(dòng)物的合格證編號(hào)為SCXK（浙）2019-0002；大鼠進(jìn)行7 d 的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)剔除垂直和水平活動(dòng)總分低于10者（即初始運(yùn)動(dòng)能力較差的大鼠），而后用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方法，即將100 只曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)后合格的大鼠，隨機(jī)分成5 組，即對(duì)照（control）組、PTSD 組、FLX 組、低劑量Gen（low-dose Gen，Gen-L）組和高劑量Gen（high-dose Gen，Gen-H）組，每組20只。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 PTSD 模型的建立及干預(yù)方法 大鼠進(jìn)行1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，除對(duì)照組大鼠外，其余組的大鼠均采用連續(xù)單一應(yīng)激和足底電擊結(jié)合的方法建立PTSD 模型，即先進(jìn)行單一連續(xù)應(yīng)激：禁錮2 h、強(qiáng)迫游泳20 min、七氟烷麻醉至昏迷，在大鼠蘇醒30 min后，把大鼠放于自制電擊箱（40 cm×30 cm×25 cm）中，適應(yīng)196 s 后給予15 個(gè)循環(huán)周期（電流0.8 mA，持續(xù)10 s，間歇10 s）的足底電擊。將對(duì)照組大鼠放于無(wú)電流的相同電擊箱中同樣的時(shí)間，不給予足底電擊。實(shí)驗(yàn)后將大鼠放回鼠籠靜養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：自由飲水?dāng)z食、晝夜節(jié)律、室溫22～25℃。依據(jù)文獻(xiàn)[5，9]在實(shí)驗(yàn)過程中每天上午9：00 給予低、高劑量Gen 組大鼠分別灌服7 和14 mg/kg Gen；陽(yáng)性藥物組大鼠灌服氟西汀，氟西汀的用藥劑量為10 mg/kg，均溶于含0.5%羧甲基纖維素鈉的生理鹽水中；對(duì)照組及模型組每日給予等體積含0.5%羧甲基纖維素鈉的生理鹽水灌胃。各組灌胃容積均為5 mL/kg，分別于藥物干預(yù)的第7天和第14天時(shí)測(cè)試實(shí)驗(yàn)效應(yīng)。

3.2 行為學(xué)檢測(cè)

3.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open-field test） 于藥物干預(yù)的第7 和14 天時(shí)分別取各組大鼠進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程需保持安靜，使用特制的立方體曠場(chǎng)箱（80 cm×80 cm×40 cm），底面及內(nèi)側(cè)壁均為黑色，底面用線劃分了16 格，每格形制均為20 cm×20 cm。位于中央的格為中央格（4個(gè)中心正方形），沿側(cè)壁的格稱為外周格（12 個(gè)周邊正方形）。攝像頭安置于正中格正上方。實(shí)驗(yàn)時(shí)動(dòng)物放于箱內(nèi)底面正中格中，并用自動(dòng)觀察分析系統(tǒng)攝像，觀察大鼠在5 min 內(nèi)的運(yùn)動(dòng)總路程、后肢直立次數(shù)（2前爪騰空或攀附墻壁，為垂直運(yùn)動(dòng)得分）、中央格穿越次數(shù)（4 爪均進(jìn)入方格才記數(shù)，為水平運(yùn)動(dòng)得分），以上數(shù)據(jù)均是用于衡量大鼠探索行為能力的指標(biāo)[5]。每只大鼠僅測(cè)定1 次。每一次在進(jìn)行下一只觀察前，均要徹底清洗箱底面及內(nèi)壁并用乙醇除去上一只鼠的味道，避免前一只動(dòng)物殘留的信息（如動(dòng)物的大、小便、氣味）影響下次測(cè)試結(jié)果。

3.2.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（elevated plus maze test） 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)在安靜環(huán)境下進(jìn)行。高架十字迷宮由一個(gè)開臂和一個(gè)閉臂呈十字交接而成，高出地面36 cm。開、閉臂均為46 cm 長(zhǎng)，15 cm 寬，二臂交接區(qū)為15 cm×15 cm 大小的中心平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，大鼠可以自由活動(dòng)5 min。并用進(jìn)入開臂的時(shí)間百分比，進(jìn)入開臂的次數(shù)百分比以及焦慮指數(shù)｛焦慮指數(shù)=1-[1/2（開臂時(shí)間/總時(shí)間）+1/2（進(jìn)入開臂的次數(shù)/總的探索次數(shù)）]｝來衡量大鼠的焦慮程度[5]（大鼠4 爪均進(jìn)入開臂才開始計(jì)時(shí)，若大鼠從開臂掉下，則此次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作廢）。

3.2.3 僵立行為測(cè)定 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定各組大鼠的僵立行為，將大鼠放置于無(wú)電流的原造模電擊箱中，檢測(cè)4 min 內(nèi)大鼠的僵立行為，每10 s 測(cè)一次，表現(xiàn)為僵立行為時(shí)為陽(yáng)性，木僵率為陽(yáng)性次數(shù)之和占總次數(shù)的百分比。僵立行為是在嚙齒類動(dòng)物中常見的一種防御行為，是大鼠恐懼表達(dá)的一種行為方式[5]。常常表現(xiàn)出刻板的蹲伏姿勢(shì)，大鼠除呼吸運(yùn)動(dòng)以外其它的肌肉運(yùn)動(dòng)均消失，可以伴有輕微的搖擺。

3.3 海馬組織Nissl 染色 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，隨機(jī)抽取各組大鼠5 只，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，心腔內(nèi)灌注生理鹽水，后經(jīng)4%多聚甲醛灌流固定，之后取完整大腦用4%多聚甲醛后固定24 h，石蠟包埋，常規(guī)腦組織切片（厚5 μm），切片分4 套，1套按尼氏染色步驟進(jìn)行尼氏染色，光鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)及數(shù)目改變，另3 套分別用于beclin 1和LC3免疫熒光標(biāo)記染色和陰性對(duì)照。

3.4 海馬組織beclin 1 和LC3 免疫熒光標(biāo)記 取上述切片3 套，依次入二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，檸檬酸鈉抗原修復(fù)，3%過氧化氫浸泡10 min，羊血清封閉后，其中的2 套分別滴加兔抗beclin 1、LC3 Ⅰ抗，4℃孵育過夜；PBS 液漂洗3 min、3 次，F(xiàn)ITC 熒光Ⅱ抗室溫避光孵育2 h；PBS液漂洗3 min、3次，DAPI工作液室溫避光孵育5 min；PBS 液漂洗3 min、3 次，滴加甘油PBS 混合液封片；激光共聚焦顯微鏡下觀察beclin 1和LC3熒光標(biāo)記的陽(yáng)性神經(jīng)元。第3套切片不加Ⅰ抗，用于陰性對(duì)照。

3.5 海馬組織beclin 1 和LC3 蛋白水平檢測(cè) 行為學(xué)測(cè)試完畢后，隨機(jī)抽取各組大鼠5 只，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（0.5 mL/kg）深麻醉，大鼠斷頭取新鮮海馬組織，冰浴中分別抽提總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入目標(biāo)蛋白Ⅰ抗（1∶1 000）或GAPDH Ⅰ抗（1∶2 000），4℃孵育過夜，TBST 洗膜，加入Ⅱ抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL顯色劑進(jìn)行曝光。

3.6 海馬組織5-HT 含量檢測(cè) 取上述大鼠新鮮海馬組織，進(jìn)行組織勻漿，吸取上清液。按5-HT ELISA檢測(cè)試劑盒步驟要求進(jìn)行5-HT含量的檢測(cè)。

3.7 海馬組織5-HT含量與beclin 1和LC3蛋白水平之間的相關(guān)性分析 獲取實(shí)驗(yàn)第7 天和第14 天時(shí)各組大鼠海馬組織5-HT、beclin 1、LC3 蛋白數(shù)值，采用Pearson 相關(guān)分析分析海馬組織5-HT 含量與海馬beclin 1和LC3蛋白水平之間的相關(guān)性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 軟件22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Gen減少大鼠的PTSD樣行為

1.1 Gen 提升PTSD 大鼠的探索能力 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第7、14 天PTSD 組大鼠的運(yùn)動(dòng)總距離、直立次數(shù)和進(jìn)入中央格次數(shù)均較對(duì)照組減少（P＜0.01），低、高劑量Gen 組大鼠上述各指標(biāo)值均高于同時(shí)段PTSD 模型組（P＜0.01），且高劑量Gen 組效果優(yōu)于低劑量Gen組和氟西汀組（P＜0.05），見表1。

表1 大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Table 1. Comparison of the results of open-field test in rats（Mean±SD. n=10）

1.2 Gen 減少PTSD 大鼠的焦慮樣行為 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第7、14 天PTSD 組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比、進(jìn)入開臂時(shí)間百分比較對(duì)照組減少（P＜0.01），而焦慮指數(shù)較對(duì)照組增加（P＜0.01），低、高劑量Gen 組大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)和時(shí)間百分比均高于同時(shí)段PTSD 組，焦慮指數(shù)顯著低于同時(shí)段PTSD 模型組（P＜0.05），高劑量組上述指標(biāo)值優(yōu)于低劑量組和氟西汀組（P＜0.05），見表2。

表2 大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Table 2. Comparison of the results of elevated plus-maze test in rats（Mean±SD. n=10）

1.3 Gen 減少PTSD 大鼠的恐懼樣行為 僵立實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第7、14 天PTSD 組大鼠的木僵率較對(duì)照組上升（P＜0.01）。低、高劑量Gen 組木僵率均顯著低于同時(shí)段PTSD 模型組（P＜0.01），其中高劑量Gen組木僵率低于低劑量Gen 組和氟西汀組（P＜0.01），見表3。

表3 大鼠僵立實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Table 3. Comparison of the results of stiff behavior test（numbness rate）in rats（%. Mean±SD. n=10）

2 Gen減輕PTSD大鼠海馬神經(jīng)元的病理改變

Nissl 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元輪廓清晰，染色均勻，尼氏小體明顯，核大而圓，核膜完整，排列整齊，神經(jīng)元形態(tài)正常；同時(shí)段模型組大鼠海馬神經(jīng)元存在不同程度的萎縮，細(xì)胞外形不規(guī)則，數(shù)量減少，排列松散，核固縮現(xiàn)象明顯；同時(shí)段低、高劑量Gen 組及氟西汀組神經(jīng)元核固縮現(xiàn)象減少，神經(jīng)元排列趨向整齊，見圖1。

Figure 1. The distribution of hippocampal neurons in rats（Nissl staining，scale bar=50 μm）.圖1 大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)與分布

3 Gen 減少PTSD 大鼠海馬組織beclin 1 和LC3 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量

免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示，第7 和14 天對(duì)照組海馬組織beclin 1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（3.20±1.92）mm-2和（1.60±1.14）mm-2，模型組為（50.20±5.26）mm-2和（31.20±6.37）mm-2，對(duì) 照 組LC3 陽(yáng) 性 細(xì) 胞 數(shù) 為（3.00±1.58）mm-2和（2.80±1.92）mm-2，模型組為（25.20±2.16）mm-2和（39.20±4.38）mm-2，PTSD 模型組beclin 1 和LC3 陽(yáng)性神經(jīng)元均顯著多于對(duì)照組（P＜0.01）；低、高劑量Gen 組及氟西汀組beclin 1 和LC3 陽(yáng)性神經(jīng)元均少于同時(shí)段PTSD 模型組（P＜0.01），見圖2。

4 Gen 降低PTSD 大鼠海馬組織beclin 1 和LC3 蛋白水平

Western blot 結(jié)果顯示，PTSD 模型組beclin 1 蛋白水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值均高于對(duì)照組（P＜0.01），低、高劑量Gen 組及氟西汀組beclin 1 蛋白水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值均低于模型組（P＜0.01），見圖3、4。

5 Gen提高PTSD大鼠海馬組織5-HT的含量

ELISA 結(jié)果顯示，第7、14天PTSD 模型組海馬組織5-HT 含量較對(duì)照組顯著降低（P＜0.01）；低、高劑量Gen 組海馬組織5-HT 含量顯著高于同時(shí)段PTSD模型組（P＜0.01），且14 d 組高于7 d 組（P＜0.05），高劑量Gen 組在14 d 高于同時(shí)段氟西汀組（P＜0.05），見表4。

6 海馬組織5-HT 含量與beclin 1 和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值之間存在顯著負(fù)相關(guān)

Pearson 相關(guān)性分析顯示，各時(shí)段各組大鼠海馬組織5-HT 含量與beclin 1 和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值之間呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.75 和r=-0.71（P＜0.01），見圖5、6。

討論

基于動(dòng)物模型探究PTSD 發(fā)病機(jī)理和尋找藥物治療靶點(diǎn)是目前PTSD 研究的一大熱點(diǎn)，本研究采用連續(xù)單一應(yīng)激和足底電擊相結(jié)合的方法建立PTSD大鼠模型，實(shí)驗(yàn)大鼠先后經(jīng)歷了禁錮、溺水、麻醉和電擊4 種應(yīng)激刺激，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高價(jià)十字迷宮實(shí)驗(yàn)和僵立行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)探索性行為的次數(shù)顯著減少，焦慮、恐懼樣行為表現(xiàn)顯著增加，并出現(xiàn)逃避創(chuàng)傷相關(guān)環(huán)境等典型的PTSD 樣精神和行為表現(xiàn)，說明該模型能較好地模擬PTSD 的發(fā)病環(huán)境，是研究PTSD 發(fā)病機(jī)制及尋求藥物治療靶點(diǎn)較為理想的動(dòng)物模型。

Gen又稱染料木素，是一種來源于大豆和紅三葉草等植物的多酚類化合物，具有抗炎、抗抑郁、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)等功能，對(duì)心血管疾病、圍絕經(jīng)期抑郁、骨質(zhì)疏松癥、老年性癡呆等疾病有一定改善作用[10]。而Gen 是否具有抗PTSD 作用鮮見報(bào)道。本研究通過構(gòu)建PTSD 大鼠模型，觀察Gen 的抗PTSD作用，并探討Gen 的抗PTSD 機(jī)制。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PTSD 模型組相比，低、高劑量Gen 組大鼠探究性行為顯著增加，焦慮恐懼樣行為顯著減少，提示Gen 具有減少大鼠PTSD 樣行為的效應(yīng)，對(duì)PTSD 癥狀有明顯調(diào)節(jié)作用。

研究顯示，最初創(chuàng)傷記憶影響與PTSD 的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制有關(guān)，包括海馬、杏仁核、前額葉及下丘腦-垂體-腎上腺軸等結(jié)構(gòu)和功能改變。海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，位于大腦、丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間，是調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的重要部位，同時(shí)也是受應(yīng)激影響最嚴(yán)重的腦區(qū)[11]。PTSD 患者海馬體積縮小，海馬神經(jīng)元存在異常丟失或死亡等病理改變[12-13]。本研究觀察到PTSD 大鼠海馬神經(jīng)元存在不同程度的萎縮，細(xì)胞外形不規(guī)則，數(shù)量減少，排列松散，核固縮現(xiàn)象明顯；而低、高劑量Gen 組海馬神經(jīng)元核固縮現(xiàn)象減輕，神經(jīng)元排列趨向整齊，提示Gen 具有促進(jìn)海馬神經(jīng)元增殖和減緩PTSD 海馬病理進(jìn)程的作用。神經(jīng)遞質(zhì)失衡尤其是5-HT 能神經(jīng)功能不足是PTSD主要病理特征之一[14-15]。中樞5-HT 能神經(jīng)元主要分布于腦干中縫核團(tuán)內(nèi)，包括中縫背核和中縫大核[16]。中縫背核位于中腦尾側(cè)和腦橋顱側(cè)平面，含有的5-HT 能神經(jīng)元數(shù)量最多，中縫背核的5-HT 能神經(jīng)纖維廣泛投射到海馬等與PTSD 病變密切相關(guān)的重要腦區(qū)，海馬組織內(nèi)含有豐富的5-HT 能投射纖維，這些投射纖維的末梢釋放5-HT，作用于海馬神經(jīng)元上的5-HT受體，海馬神經(jīng)元胞膜上含有多種5-HT受體亞型，由海馬神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)纖維則廣泛投射到額葉皮質(zhì)、杏仁核等與情感有關(guān)的腦區(qū)，參與情感、鎮(zhèn)痛、睡眠等機(jī)制的調(diào)節(jié)[16]。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA 法檢測(cè)了各組大鼠海馬組織5-HT 含量，結(jié)果顯示，PTSD 模型組海馬組織5-HT 含量低下，且隨造模后隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng)呈不斷下降趨勢(shì)，較之模型組，低、高劑量Gen 組和氟西汀組大鼠海馬組織5-HT 含量均有顯著升高，高劑量Gen 組大鼠14 天時(shí)的5-HT含量居各組最高值。這提示Gen 和氟西汀均具有提高PTSD大鼠海馬組織5-HT含量的作用。

Figure 2. Distribution（A，B）and numbers（C，D）of beclin 1（A，C）and LC3（B，D）positive neurons in hippocampus of the rats（immunofluorescence labeling，scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs PTSD group.圖2 大鼠海馬beclin 1和LC3陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)與分布

Figure 3. Expression of beclin 1 protein in hippocampal tissue of each group. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs PTSD group.圖3 各組大鼠海馬組織beclin 1蛋白的表達(dá)

Figure 4. Expression of LC3 protein in hippocampal tissue in each group. Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs PTSD group.圖4 各組大鼠海馬組織LC3蛋白的表達(dá)

表4 各組大鼠海馬組織5-HT含量Table 4. 5-HT concentration in hippocampal tissue in each group（μg/L. Mean±SD. n=5）

有研究顯示，在PTSD 發(fā)病過程中，海馬神經(jīng)元存在異常凋亡和自噬現(xiàn)象，這可能是PTSD 海馬腦區(qū)體積縮小的原因之一[15，17]。自噬是細(xì)胞的自我更新現(xiàn)象，對(duì)維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝必不可少，并且也參與一些疾病的發(fā)生過程。LC3 和beclin 1 是哺乳動(dòng)物的自噬相關(guān)蛋白。LC3 存在2 種形式：胞漿型（LC3-Ⅰ）和膜結(jié)合型（LC3-Ⅱ）。LC3-Ⅱ是自噬體的標(biāo)志分子，LC3-Ⅱ總量或者LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變的比率與自噬泡的形成數(shù)量呈正相關(guān)[18-19]。beclin 1 參與自噬體的早期形成過程，可以正向調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生[20]。在成年大鼠海馬神經(jīng)元上存在beclin 1 的表達(dá)[21]。然而，PTSD 發(fā)病過程中海馬神經(jīng)元是否存在異常自噬現(xiàn)象，鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。氟西汀為臨床抗PTSD 的一線藥物，具有抑制海馬神經(jīng)元過度自噬的作用[22-23]。本研究設(shè)氟西汀為陽(yáng)性對(duì)照藥，通過免疫熒光標(biāo)記和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元自噬水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組海馬beclin 1 和LC3 標(biāo)記的陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量較對(duì)照組有顯著增多，beclin 1 和LC3 蛋白的表達(dá)水平也顯著升高，而低、高劑量Gen組和氟西汀組海馬beclin 1和LC3標(biāo)記的陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量不斷減少，beclin 1 和LC3 蛋白表達(dá)水平也不斷下降，提示Gen 和氟西汀均具有抑制PTSD 大鼠海馬神經(jīng)元過度自噬的作用。

海馬組織5-HT 水平與海馬神經(jīng)元自噬之間是否有關(guān)聯(lián)？本研究的Pearson 相關(guān)性分析顯示，海馬組織5-HT 含量與beclin 1 和LC3 蛋白水平之間存在顯著負(fù)相關(guān)。由此，我們推測(cè)海馬組織5-HT 含量不足可能與PTSD大鼠海馬神經(jīng)元過度自噬有關(guān)。

綜上所述，PTSD 大鼠海馬組織5-HT 水平低下，海馬神經(jīng)元自噬增強(qiáng)，5-HT 含量與神經(jīng)元自噬之間存在顯著負(fù)相關(guān)。Gen 可能通過提高海馬組織5-HT含量，調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元異常自噬，進(jìn)而改善大鼠PTSD 樣行為。至于5-HT 如何調(diào)控海馬神經(jīng)元自噬的發(fā)生以及Gen 干預(yù)海馬神經(jīng)元自噬的具體機(jī)制仍有待深入研究。

Figure 5. Correlation analysis between 5-HT level and beclin 1 protein level in hippocampal tissues.圖5 海馬組織5-HT水平與beclin 1蛋白水平的相關(guān)性分析

Figure 6. Correlation analysis between 5-HT level and LC3 protein level in hippocampal tissues.圖6 海馬組織5-HT水平與LC3蛋白水平的相關(guān)性分析