以淀粉為原料雙酶法生產(chǎn)海藻糖的研究進(jìn)展

曹 媛

（南京凱通糧食生化研究設(shè)計有限公司，江蘇 南京210012）

海藻糖（C12H22O11）廣泛存在于自然界中，是兩分子D-吡喃葡萄糖的異頭碳原子（C1）上的半縮醛羥基之間去水縮合而成的非還原性雙糖，微甜，常以二水化合物的形式存在。海藻糖的生物保護(hù)機(jī)制顯著，在一些惡劣條件下能夠穩(wěn)定細(xì)生命體的胞膜和蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持生物特征和生命過程[1]。海藻糖可以改善壓力作用下益生菌的疏水性，并提高益生菌類飲料的儲存穩(wěn)定性[2]。海藻糖可以抑制細(xì)胞外冰晶對細(xì)胞的抑制作用[3]，從而作為保護(hù)劑在冷凍食品[5]和飼料[5]中使用。同時海藻糖在維持植物體內(nèi)滲透壓，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等方面發(fā)揮了重要作用，對作物栽培和育種改良有著重要的意義[6]。鑒于上述特殊的生物保護(hù)特性，海藻糖在食品、醫(yī)藥、化妝品、保健品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣闊的市場前景。

海藻糖的生產(chǎn)方法主要包括發(fā)酵法[7]、提取法[8,9]、酶合成法[10,11]和基因重組法[12,13]等。其中酶合成法根據(jù)所用原料的不同可以分為葡萄糖合成法、蔗糖合成法、淀粉合成法和麥芽糖合成法；葡萄糖合成法和蔗糖合成法普遍存在收率過低的問題。酶法根據(jù)是否磷酸化又可以分為磷酸化途徑和非磷酸化途徑，前者難以實現(xiàn)工業(yè)化，后者主要包括單酶法和雙酶法。單酶法是指利用海藻糖合成酶將底物麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖；雙酶法指在兩種酶的共同作用下將直鏈淀粉轉(zhuǎn)化為海藻糖；文章重點介紹發(fā)展較早的以淀粉為原料的雙酶法。

1 雙酶法在日本的發(fā)展

酶法制備海藻糖的研究依據(jù)于海藻糖在自然界的合成促進(jìn)。最早發(fā)現(xiàn)的海藻糖酶促途徑常需要以磷酸鹽為代表的高能化合物的參與，反應(yīng)過程較復(fù)雜，不利于工業(yè)化。20世紀(jì)90年代，日本林原生化研究所和日本麒麟公司的研究者從節(jié)桿菌（Arthrabactersp.Q36）、嗜酸熱硫化葉菌（Sulfolbusacidocaldarius）和硫礦硫化葉菌中純化出和海藻糖形成相關(guān)的酶系統(tǒng)，并進(jìn)一步探究該酶系統(tǒng)作用下的海藻糖合成機(jī)理。該酶系統(tǒng)包括低聚麥芽糖基海藻糖合成酶（Maltooligosyl Trahalose Synthase,MTSase,EC 5.4.99.15）和低聚麥芽糖基海藻糖水解酶（Maltooligosyl Trahalose Trahalohydrolase,MTHase,EC 3.2.1.141），MTSase可以作用于DP≥3的麥芽寡糖、麥芽糊精或直鏈淀粉，在其末端生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的а,а-1,1-葡萄糖苷鍵；MTHase將上述а,а-1,1-葡萄糖苷鍵特異性的從直鏈末端切掉轉(zhuǎn)化成海藻糖，參見圖1。該合成途徑被稱為TreY/TreZ途徑[13]，因為有兩種酶的協(xié)同參與，所以常被稱為雙酶法。雙酶法可以使用多種淀粉作為底物，如小麥淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉和玉米淀粉等；酶反應(yīng)后除海藻糖外還有葡萄糖、麥芽糖、麥芽寡糖、а-葡萄糖基海藻糖和а-麥芽糖基海藻糖等副產(chǎn)物，可以采用糖化酶（葡萄糖淀粉酶）將上述副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為葡萄糖和海藻糖后再分離[15]。雙酶法合成海藻糖的整個過程無需高能化合物的參與，對磷酸鹽無依賴性，極具工業(yè)化潛力。

圖1 淀粉雙酶法生產(chǎn)海藻糖反應(yīng)過程[2]Fig.1 Principle of trehalose production by double-enzyme method from starch[2]

日本是最早實現(xiàn)以淀粉為原料工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖的國家。1995年，林原生化研究所利用雙酶法工藝實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖，比起早期的酵母提取法，雙酶法的生產(chǎn)成本大幅度降低，使海藻糖的價格由每千克2萬多日元下降到350日元；截至2000年底，年產(chǎn)量達(dá)到24000t，林原公司成為當(dāng)時海藻糖最大的生產(chǎn)商。

最初的雙酶法酶促反溫度較低，容易出現(xiàn)雜菌污染、生產(chǎn)控制難度大的問題。林原公司不斷完善雙酶法工藝，發(fā)現(xiàn)制備了重組型耐熱性海藻糖水解酶和耐熱性非還原性糖質(zhì)生成酶，其反應(yīng)溫度分別為75℃（pH值7）和60℃（pH值5.5）[16]；利用上述耐熱型MTSase和MTHase，并配合使用淀粉脫支酶（異淀粉酶或直鏈淀粉酶）、葡萄糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、一種天然型或重組型環(huán)狀糊精葡萄糖苷基轉(zhuǎn)移酶（Cyclomaltodextrin Glucanotransferase，CGTase）或其突變體等[17]，海藻糖產(chǎn)率得到顯著提高。酶促反應(yīng)液經(jīng)過滅酶、精制、濃縮后得到高純度的海藻糖漿；并進(jìn)一步采用控制冷卻法得到二水合海藻糖結(jié)晶粉末[19]；CGTase參與下的反應(yīng)液經(jīng)過除酶、脫色脫鹽及濃縮后，所得海藻糖漿的海藻糖純度高達(dá)86%（以無水物計），必要時可以不用經(jīng)過層析分離，直接進(jìn)行結(jié)晶離心分離，固體產(chǎn)品中純度為98%[20]。

2 雙酶法在國內(nèi)的研究進(jìn)展

2.1 酶的提取和酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)

鑒于淀粉原料來源廣、價格低以及海藻糖的特殊生物功能和高經(jīng)濟(jì)價值等原因，淀粉雙酶法生產(chǎn)海藻糖的技術(shù)一直受到關(guān)注。國內(nèi)對海藻糖的研究和生產(chǎn)起步略晚，隨著酶技術(shù)和基因科學(xué)的發(fā)展，酶法制備海藻糖的研究逐漸興起，但對于雙酶法的研究報道遠(yuǎn)少于單酶法，且研究方向集中在酶的制備提取和酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)上。

1999年，黃日波等從硫礦硫化葉菌（Sulfolobus sotfataricus GX×05T）中克隆到MTSase和MTHase基因并表達(dá)成功。2000年，南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司利用此酶系成功開發(fā)出酶法轉(zhuǎn)化木薯淀粉生產(chǎn)海藻糖的工藝，使我國成為世界上第二個酶法工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖的國家。

北京化工大學(xué)的孫長慧利用產(chǎn)MTSase和MTHase的微球菌，以淀粉為原料，在30℃、pH值8.0、反應(yīng)時間24h和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%條件下，得到海藻糖質(zhì)量濃度52.76g·L-1，淀粉轉(zhuǎn)化率52.7%[21]。陳曉斌等將從嗜熱硫礦硫化葉菌ATCC35092基因組中擴(kuò)增得到編碼MTSase和MTHase的基因并轉(zhuǎn)入大腸桿菌重誘導(dǎo)表達(dá)，所得MTSase和MTHase的酶活產(chǎn)率分別為313U·g-1（wetcell）和403U·g-1（wetcell）；但在75℃、pH值5.0條件下時，海藻糖轉(zhuǎn)化率最高僅為53.6%[22]。在工業(yè)上，不足60%的轉(zhuǎn)化率難以滿足生產(chǎn)需求，不具備競爭優(yōu)勢。同時，兩種酶的制備技術(shù)難度較大、且反應(yīng)溫度普遍較低，前期報道的適用溫度多在50℃以內(nèi)，最高不超過60℃[13,18]，以早期Nakada等從節(jié)桿菌Arthrobacter SP.Q36中提取的野生MTSase和野生MTHase為例，其最適溫度也分別為40和45℃。反應(yīng)溫度低，意味著在實際生產(chǎn)中容易染菌污染、加大了生產(chǎn)難度和成本，阻礙了雙酶法的工業(yè)應(yīng)用。為了提高酶活、底物轉(zhuǎn)化率以及酶耐高溫性能，近年來眾多研究者采用基因工程手段改造或重建MTSase和MTHase，越來越多不同來源的低聚麥芽糖基海藻糖合成酶和低聚麥芽糖基海藻糖水解酶被開發(fā)。

齊魯工業(yè)大學(xué)的薛樂平通過插入不同的連接肽及不同的融合順序，構(gòu)建產(chǎn)MTSase、MTHase的氧化桿菌融合酶菌株，得到了兩種酶的基因序列和編碼，重組的MTSase和MTHase的酶活分別為17.85U·mL-1和15.16U·mL-1。只是在40℃、pH值7.0、反應(yīng)24h、直鏈淀粉底物濃度4%條件下，海藻糖轉(zhuǎn)化率僅為45.87%，有待提高[23]。江南大學(xué)的王魁等首次將分支節(jié)桿菌Arthrobacter ramosus S34來源的編碼MTSase的treY基因和編碼MTHase的treZ基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后導(dǎo)入到大腸桿菌中表達(dá)，所得重組MTSase和MTHase的最適溫度分別為45℃和55℃，最適pH分別為7.0和6.0，總底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到67.7%[25]。江南大學(xué)的吳世雄等將來源于嗜酸熱硫化葉菌ATCC 33909的MTSas和MTHase在短芽孢桿菌中重組表達(dá)，并進(jìn)行了酶轉(zhuǎn)化實驗，發(fā)現(xiàn)在60℃、pH值5.5的條件下海藻糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到80.2%[24]，酶的耐溫性和活性都得到了顯著提高。

江南大學(xué)的吳敬等提供一系列麥芽寡糖基海藻糖水解酶突變體，并通過在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中表達(dá)和發(fā)酵優(yōu)化顯著提高了酶的產(chǎn)量[26]；并且利用角質(zhì)酶、芽寡糖基海藻糖合成酶和芽寡糖基海藻糖水解酶進(jìn)行多酶復(fù)配提高底物利用率，將海藻糖的轉(zhuǎn)化率提高了約5個百分點[27]。

除此之外，有研究采用酶固定化或細(xì)胞固定化技術(shù)來保護(hù)酶類，以提高酶的穩(wěn)定性[28]。如采用海藻酸鈣包埋麥芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，固定化后MTHase的最適反應(yīng)溫度和穩(wěn)定溫度都有所提高[29]。

利用基因技術(shù)構(gòu)建高效高穩(wěn)定耐溫的MTSase和MTHase，對降低進(jìn)一步完善雙酶法生產(chǎn)工藝具有重要意義，上述研究成果雖然多屬于實驗室階段，未見工業(yè)應(yīng)用的報道，但為雙酶法的完善和工業(yè)化提供了重要技術(shù)基礎(chǔ)。

2.2 雙酶法配套技術(shù)的發(fā)展

國內(nèi)外對海藻糖制備的研究主要集中在上游的酶提取和酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)上，對下游的海藻糖精制和分離提純過程以及雙酶反應(yīng)之前的預(yù)處理過程研究報道較少。

江南大學(xué)的韓少卿等采用超濾、納濾技術(shù)對海藻糖抽提液進(jìn)行處理，通過選型優(yōu)化，海藻糖總提取率高達(dá)85.6%[30]。李博等探討了利用超濾-滲濾技術(shù)除去蛋白質(zhì)、提取海藻糖的應(yīng)用研究，經(jīng)超濾-滲濾操作，海藻糖總收率在95%[31]。天津大學(xué)的鄭輝杰等采用離子交換樹脂對海藻糖提取液進(jìn)行處理，以除去雜質(zhì)鹽類及色素，處理后提取液的電導(dǎo)率從1700μs·cm-1下降至40μs·cm-1，脫色率98%，海藻糖收率為94%[32]。楊亞威等研究了利用模擬移動床色譜分離海藻糖和葡萄糖的工藝過程，得到SMB譜分離的最佳工藝參數(shù)[33]。

臺灣國立中興大學(xué)研究了在葡萄糖酸酶和葡萄糖氧化酶催化下麥芽糖連續(xù)轉(zhuǎn)化為葡萄糖和葡萄糖制備葡萄糖酸的過程，轉(zhuǎn)化后的葡萄糖酸可以很容易的與海藻糖分離，為工業(yè)化純化海藻糖提供一個新的方向[34,35]?；谠撍悸罚_灣大葉大學(xué)建立了PTTS生物生產(chǎn)系統(tǒng)，利用葡萄糖氧化酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化生成葡萄糖酸并經(jīng)過間歇/連續(xù)離子交換過程，將海藻糖可成功分離、結(jié)晶，純度為（92.6±0.02）%，回收率為94.2%[36]。

江南大學(xué)的田成福探討了雙酶反應(yīng)之前將淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糊精的轉(zhuǎn)化工藝，優(yōu)化了粗酶液轉(zhuǎn)化淀粉的最優(yōu)條件：pH值6.5、反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)時間30h，底物DE值11.9，濃度為10%的淀粉液化液[37]；從預(yù)處理角度為提高雙酶法生產(chǎn)效率提供了數(shù)據(jù)支撐。

3 雙酶法生產(chǎn)工藝應(yīng)用

雙酶法制備海藻糖雖然具有原料淀粉便宜、無需高能量化合物等優(yōu)點，但其反應(yīng)時間長、不易實現(xiàn)高溫反應(yīng)易染菌；盡管國內(nèi)有報道一些耐熱耐酸性酶，但在確保酶活性或?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)上仍有技術(shù)難度。同時該工藝淀粉酶用量較大，對副產(chǎn)品的控制以及副產(chǎn)品中麥芽糖和海藻糖的分離難度相對較大，工藝過程較為復(fù)雜，世界上只有少數(shù)公司企業(yè)或機(jī)構(gòu)擁有該生產(chǎn)工藝，以海藻糖主要生產(chǎn)國日本為例，已報道的日本海藻糖生產(chǎn)工藝見圖2。

圖2 雙酶法淀粉制造海藻糖工藝流程框圖Fig.2 Process of trehalose production from starch by double-enzyme with CGTase

該工藝以淀粉乳為原料，液化后在多種酶的協(xié)同作用下發(fā)生糖化酶促反應(yīng)得到海藻糖和副產(chǎn)物葡萄糖，再經(jīng)過滅酶過濾、脫色過濾、脫鹽、濃縮得到高純度海藻糖漿，根據(jù)需要色譜分離進(jìn)一步提純，或直接冷卻結(jié)晶、離心、干燥得到結(jié)晶海藻糖。

南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司采用雙酶法工藝，以木薯淀粉為原料，由α-淀粉酶、普魯蘭酶分解為短鏈糊精后，經(jīng)MTSase和MTHase作用轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖，再通過除酶、脫色、脫鹽、分離、濃縮、結(jié)晶后可制成含量為98.0%的食品級結(jié)晶海藻糖和含量為99%以上的高純度結(jié)晶海藻糖。2002年，我國結(jié)晶海藻糖產(chǎn)量200t，價格為79元·kg-1，海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)在國內(nèi)正式拉開序幕。

此后國內(nèi)報道的工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖主要以單酶法為主，雙酶法完整工藝過程的公開報道多在實驗室水平上或者中試規(guī)模上。2014年，山東天力藥業(yè)有限公司完成了淀粉法生產(chǎn)海藻糖項目的中試，并在專利CN103205475A中介紹了利用高溫淀粉酶、新型MTHase和MTSase以及普魯蘭酶以淀粉為原料生產(chǎn)海藻糖時的反應(yīng)工藝條件，至2020年天力藥業(yè)的海藻糖產(chǎn)量達(dá)3000t。專利CN108130350A公開了一種高含量、顆粒度小的海藻糖制備方法，制備過程包括：淀粉乳制備、液化、雙酶解、過濾去蛋白、脫色、脫鹽、納濾和色譜分離提純、濃縮結(jié)晶和分離干燥制得成品，海藻糖含量大于99.7%[38]。

4 結(jié)論與展望

雙酶法起源于日本，具有原料便宜易得、無需高能化合物等優(yōu)點，國際上已經(jīng)具備較完整的制備工藝。國內(nèi)對雙酶法工業(yè)化應(yīng)用報道較少，但雙酶法作為最早實現(xiàn)工業(yè)化酶法生產(chǎn)海藻糖的技術(shù)，或被忽略或低估，仍然具有工業(yè)價值。隨著基因工程技術(shù)日趨成熟，利用生物信息學(xué)和基因技術(shù)，通過基因重組或點突變技術(shù)對MTHase和MTSase進(jìn)行改造，以期獲得酶活和穩(wěn)定性更高的MTHase和MTSase，從而減少雙酶法反應(yīng)時間、提高反應(yīng)溫度、降低染菌可能和降低生產(chǎn)成本，是目前也是未來雙酶法的一個主要研究方向，對改進(jìn)雙酶法工藝具有重要意義。隨著生物制備下游分離精制技術(shù)的發(fā)展，尤其是模擬移動床色譜分離技術(shù)的發(fā)展，使海藻糖和麥芽糖等副產(chǎn)品的高效分離成為可能?？梢灶A(yù)見，在我國有望實現(xiàn)雙酶法的進(jìn)一步工藝完善和工業(yè)應(yīng)用。