Wnt7a在兔腓腸肌急性鈍挫傷后修復(fù)過程中的作用

李嫚嫚 馬惠昇，2 穆靜

骨骼肌是人體最大的組織，直接參與人體的各項生命活動。而骨骼肌損傷在日常生活中也尤為常見，其中90%的骨骼肌損傷是骨骼肌鈍挫傷，是由鈍器擊打或碰撞引起皮內(nèi)或皮下以及軟組織局部水腫、出血、肌纖維斷裂、溶解等為主要改變的閉合性損傷[1，2]。骨骼肌損傷后的修復(fù)質(zhì)量是由肌纖維再生和結(jié)締組織重塑的協(xié)調(diào)性決定的，瘢痕組織過度增生則會影響整個骨骼肌的收縮功能[3，4]。本研究通過建立日本大耳兔骨骼肌急性鈍挫傷模型，觀察損傷后不同時間點(diǎn)的腓腸肌組織形態(tài)，初步分析以Wnt7a 為代表的非經(jīng)典Wnt 信號通路表達(dá)水平的變化與骨骼肌鈍挫傷后修復(fù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇6月齡日本大耳兔40 只, 體重1.75～2.20kg，雌雄各半，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器主要試劑：4%多聚甲醛（上海尚寶生物科技公司）；蘇木精-伊紅（HE）染液、Trizol、DEPC 水（北京索萊寶科技有限公司）；異丙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；HiFiScript 快速去除基因組cDNA 第一條鏈合成試劑盒[康為世紀(jì)（Cat.NO.CW2582M）]；UltraSYBR Mixture 熒光定量試劑盒[康為世紀(jì)（Cat.NO.CW0957H）]。

主要儀器：臺式高壓蒸汽滅菌鍋、生物顯微鏡、圖像采集系統(tǒng)（Olympus）、低溫離心機(jī)、全波長酶標(biāo)儀（BioTek）、渦旋振蕩儀（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems）、生物分光光度計（Eppendorf）。

1.3 骨骼肌急性鈍挫傷模型建立自制軟組織鈍挫傷重力砸傷器，砝碼（直徑7.0cm,長10cm，質(zhì)量3kg），固定導(dǎo)管（直徑8.0cm，高50cm）。從50cm 處落下，重力29.4N，產(chǎn)生重力勢能14.7J。造模前用剃毛器將實驗兔右腿內(nèi)側(cè)皮膚被毛剔除。水合氯醛麻醉后，將實驗兔右后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，打擊部位為右小腿內(nèi)側(cè)面（其皮下為腓腸肌中段，中心點(diǎn)在跟骨上約7cm 處），將導(dǎo)管垂直置于實驗兔距腓腸肌受打擊中心表面50cm 高度，砝碼在導(dǎo)管上端，沿導(dǎo)管內(nèi)自由落體下落致一次性打擊傷并標(biāo)記。造模后通過大體觀察、觸診及病理學(xué)檢測，腓腸肌有一定收縮功能障礙且無骨折，屬急性腓腸肌鈍挫傷模型。砸傷器由同一人操作，以保證打擊力度、損傷部位及程度的一致性。

1.4 分組及取材40 只日本大耳兔適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后，隨機(jī)選取5 只作為對照組，其余35 只制備腓腸肌急性鈍挫傷模型，然后隨機(jī)分為7 組(n=5)，各組分別在造模后1d、2d、3d、4d、5d、7d、14d 取材。取材前，耳緣靜脈注射水合氯醛麻醉，解剖并分離左側(cè)腓腸肌，迅速將離體的腓腸肌放在干凈的濾紙上均分為2 份，一份置4%多聚甲醛中固定，以備石蠟包埋HE 染色；另一份置-80℃冰箱保存，以備RTPCR 檢測。

1.5 腓腸肌組織HE 染色及病理學(xué)評價HE 染色光鏡觀察損傷骨骼肌形態(tài)學(xué)變化：將腓腸肌組織切成1cm×1cm×0.5cm 大小，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后放入標(biāo)記好的包埋盒中，骨骼肌經(jīng)4%多聚甲醛固定24h 后，石蠟包埋，于腓腸肌肌腹中段處橫切5μm 厚的連續(xù)薄片，切片脫蠟復(fù)水，蘇木精染色，1%鹽酸-酒精分化，伊紅染色，梯度酒精脫水,二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6 RT-PCR 檢測Wnt7a mRNA 表達(dá)水平從-80℃冰箱取出各組家兔腓腸肌組織約30mg，研磨后加入1ml Trizol 離心管中，充分振蕩混勻，靜置5～10min；加入0.2ml 氯仿混勻15～30s，然后靜置3min；用高速離心機(jī)（4℃，12 000rpm 15min）；取水相到新的EP 管中，加入0.5ml 異丙醇，混勻，冰浴10min；離心（4℃，12 000rpm 10min）；傾倒上層液體，用75%冰乙醇沉淀（1ml），混勻；再次離心處理（4℃，12 000rpm 5min）并干燥。加入DEPC 處理水溶解RNA，測濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄體系調(diào)整RNA 濃度并計算逆轉(zhuǎn)錄所需上樣量，而后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1μlcDNA，0.6μl 上、下游引物以及10μl Mix 反應(yīng)液，并補(bǔ)水至25μl，構(gòu)建 RNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，行定量PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件: 95℃ 15min（預(yù)變性）、95℃ 10s（變性）、58℃ 30s（退火）、72℃ 30s（延伸）、72℃ 5min（再延伸）共 40 個循環(huán)。分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時在60℃～95℃進(jìn)行溶解曲線分析。

1.7 引物設(shè)計與合成檢索根據(jù)NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中Wnt7a 全長基因序列，應(yīng)用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計出Wnt7a 基因引物，上游引物 P1：5'-GCCAAGGTCTTTGTGGATG-3'；下游引物 P2：5'-AG CAGGTCTTAGTGGTGCA-3'。擴(kuò)增片段長度157bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以LSD 法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌急性鈍挫傷后腓腸肌組織變化情況對照組腓腸肌肌纖維呈鈍角多邊形，形狀規(guī)則且排列整齊，肌纖維間隙大小一致，肌絲排列整齊，胞核呈圓形或卵圓形，位于肌纖維的周邊。與對照組腓腸肌組織相比，鈍挫傷后1d 組可觀察到肌外膜完整性被破壞、損傷肌細(xì)胞變圓肥大，細(xì)胞間質(zhì)中存在大量的紅細(xì)胞和少量的炎性細(xì)胞，部分肌纖維斷裂；鈍挫傷后2d、3d 組有大量的炎性細(xì)胞浸潤，肌細(xì)胞仍然腫脹明顯，并可見空泡組織；鈍挫傷后4d 組紅細(xì)胞較前3d 減少、炎性細(xì)胞減少、巨噬細(xì)胞增多、肌纖維壞死；鈍挫傷后5d 組成纖維細(xì)胞增多、細(xì)胞排列紊亂；鈍挫傷后7d 組肌細(xì)胞腫脹減輕，鈍挫傷區(qū)內(nèi)可見部分新生肌細(xì)胞以及成纖維樣細(xì)胞，細(xì)胞排列紊亂，可見明顯的結(jié)締組織填充，炎細(xì)胞浸潤減輕；鈍挫傷后14d 組可見肌絲扭曲，肌纖維明顯恢復(fù)，纖維化增加，損傷部位初步愈合。見圖1。

2.2 急性鈍挫傷后骨骼肌Wnt7a mRNA 表達(dá)變化RT-PCR 結(jié)果顯示，家兔骨骼肌鈍挫傷在自然恢復(fù)過程中，Wnt7a mRNA 表達(dá)水平呈逐漸升高的趨勢。對照組的平均Cq 值為1.01±0.02，鈍挫傷后1d、2d、3d、4d、5d、7d 與14d 組的平均Cq 值分別為1.69±0.17、2.05±0.21、3.83±0.89、6.27±0.99、7.56±1.14、13.55±0.85 與8.22±0.29。與 對照組相比，鈍挫傷后1d 和2d 組的平均Cq 值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），鈍挫傷后3d、4d、5d、7d、14d 組的Cq 值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。并且在骨骼肌鈍挫傷后Wnt7a mRNA 表達(dá)水平逐漸升高，在第7 天表達(dá)最高，隨后開始下降，鈍挫傷后14d 組明顯低于鈍挫傷后7d 組（P<0.05）。

圖1 腓腸肌急性鈍挫傷后組織形態(tài)學(xué)變化（HE 染色，×200）

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為經(jīng)筋具有約束骨骼主持運(yùn)動的功能，《黃帝內(nèi)經(jīng)·痿論》：“陽明者，五臟六腑之海，主潤宗筋，宗筋主束骨而利關(guān)節(jié)也?！闭f明經(jīng)筋是運(yùn)動系統(tǒng)的重要組成部分，并對周圍組織結(jié)構(gòu)起著保護(hù)作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨骼肌鈍挫傷主要表現(xiàn)為肌纖維的斷裂和肌細(xì)胞的溶解，目前研究認(rèn)為骨骼肌損傷后的修復(fù)有三個過程[5，6]：第一個階段為損傷變性期，在骨骼肌損傷后1～3d 出現(xiàn)，當(dāng)某些外力因素破壞肌肉的超微結(jié)構(gòu)和周圍血管時，導(dǎo)致肌肉內(nèi)血腫形成，損傷處的肌組織壞死退化，中性粒細(xì)胞開始浸潤。第二個階段為修復(fù)期，一般出現(xiàn)在骨骼肌損傷后的5～10d，巨噬細(xì)胞吞噬壞死的肌組織，損傷肌肉周圍的纖維基膜和漿膜間的肌衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖與分化，融合形成新的肌管細(xì)胞，伴有毛細(xì)血管增生。第三個階段為肌肉塑形期，瘢痕組織的形成一般在骨骼肌損傷后2～3 周內(nèi)發(fā)生，再生肌纖維分化成熟，受損的骨骼肌功能恢復(fù)。

Wnt7a 在骨骼肌損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。Wnt7a 可通過多條非經(jīng)典Wnt 信號通路，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和遷移，加速骨骼肌損傷修復(fù)過程[7]。以Wnt7a 為代表的非經(jīng)典Wnt 信號通路的激活，可有效促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞擴(kuò)增、遷移， 促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)。Wnt7a 對損傷骨骼肌再生的調(diào)控機(jī)制是通過Wnt7a 與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的受體FZD7 結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞極化，并選擇性增加對稱干細(xì)胞擴(kuò)增，促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的大量增殖[8]。Xu 等[9]通過對肌肉損傷后的大鼠給予rh-Wnt7a，表明rh-Wnt7a 的直接作用是促進(jìn)骨骼肌中的肌纖維增生。骨骼肌再生期間Wnt7a 過表達(dá)可顯著促進(jìn)損傷骨骼肌再生，增加了肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量；骨骼肌中Wnt7a 缺失時則表現(xiàn)為損傷骨骼肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量顯著降低；這表明Wnt7a 可作為刺激肌肉修復(fù)的有效促肌原性因子[10，11]。本實驗顯示家兔腓腸肌急性鈍挫傷后1d、2d 組的Wnt7a mRNA 表達(dá)水平無明顯變化，第3 天后Wnt7a mRNA 表達(dá)顯著性升高，并在第7 天時表達(dá)最高，隨后開始下降。HE 染色顯示新生肌管和成纖維細(xì)胞在鈍挫傷后5～7d 開始顯著增多，而Wnt7a 也在第7天時達(dá)到最高水平，Wnt7a 表達(dá)上調(diào)與肌細(xì)胞再生的病理過程在時間上有一致性，因此推斷這是因為骨骼肌組織在損傷狀態(tài)下，Wnt7a 參與肌衛(wèi)星細(xì)胞擴(kuò)增、遷移的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)短時間的Wnt7a 治療顯著刺激了組織的散布和植入，從而顯著改善了肌肉功能[12]。用Wnt7a 治療肌肉損傷可通過增加衛(wèi)星干細(xì)胞的數(shù)量以及最終增加整體衛(wèi)星細(xì)胞池來加速肌肉修復(fù)。

綜上所述，Wnt7a 可能參與骨骼肌損傷的早期修復(fù)過程，推測損傷修復(fù)的速度很可能與Wnt7a 的表達(dá)水平密切相關(guān)。本實驗只涉及了早期階段，不能對骨骼肌鈍挫傷修復(fù)全過程做出定論，Wnt7a 在骨骼肌鈍挫傷后修復(fù)后期階段的確切作用還有待進(jìn)一步研究。