豬克隆技術(shù)的研究進(jìn)展

李兆龍 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013

1 動物克隆技術(shù)簡介

動物克隆是一種不經(jīng)過有性生殖過程， 生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體相同動物個體的技術(shù)， 就叫做動物克隆。到目前為止，已經(jīng)報道了6 種不同的方法來生產(chǎn)克隆動物[1-2]。

1.1 胚胎分割克隆技術(shù) 胚胎分割是動物克隆早期的一種技術(shù)， 它將一個沒有著床的早期胚胎運用顯微方法一分為二、四或更多，然后將其移植給受體進(jìn)行分娩（見圖1）。 通常一個胚胎可以克隆兩個以上的后代，且后代的遺傳性狀完全相同。 當(dāng)前，用胚胎二分法克隆的動物包括鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛和馬。我國除了馬，以上克隆動物都有。 該技術(shù)較為原始，容易破壞細(xì)胞[3-5]。

1.2 胚胎細(xì)胞核移植 將未植入的早期胚胎細(xì)胞（有絲分裂球）通過顯微手術(shù)分離，然后將其單個胚胎細(xì)胞導(dǎo)入去除染色質(zhì)的未受精成熟卵母細(xì)胞。 然后采用電融合法充分融合，分化發(fā)育成新胚胎。再將新胚胎移植到受體子宮中分娩（見圖2）。 目前，國外有鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛和猴成功移植。我國也克隆了鼠、兔、山羊、綿羊、豬和牛。 這項技術(shù)比胚胎分割更進(jìn)一步，將克隆更多的動物[6-7]。

圖1 胚胎分割克隆技術(shù)

圖2 胚胎細(xì)胞核移植

1.3 胚胎干細(xì)胞核移植 胚胎或胎兒原生細(xì)胞被抑制分化后， 細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長， 但細(xì)胞沒有分化，每個細(xì)胞具有發(fā)育成個體能力[8]。 將單細(xì)胞導(dǎo)入成熟的卵母細(xì)胞克隆胚胎中，然后移植到受體上，產(chǎn)生妊娠、產(chǎn)仔和克隆出動物（見圖3）。 胚胎干細(xì)胞被引入早期胚胎時，ES 細(xì)胞具有多能性的體外增殖能力，并形成嵌合體[9-10]。交配生殖系嵌合體后，可以獲得來自ES 細(xì)胞的動物[11]。 在小鼠中，ES 細(xì)胞和基因靶向技術(shù)已經(jīng)成為將期望的遺傳變化引入基因組的常規(guī)程序[12]。除了鼠之外，還報道了ES 細(xì)胞，如倉鼠、兔、鼠、豬、恒河猴、牛和人類[13-14]。 有限數(shù)量的報告通過在鼠體內(nèi)產(chǎn)生嵌合體驗證了ES 細(xì)胞的多能性，但沒有證實生殖系嵌合體。 因此，目前ES 細(xì)胞只能用于克隆動物的產(chǎn)生或小鼠的靶向突變。

圖3 胚胎干細(xì)胞核移植

1.4 胎兒成纖維細(xì)胞核移植 孕早期從胎兒中分離出胎兒成纖維細(xì)胞，通過核移植，移植受體，妊娠仔豬和克隆個體克隆胚胎（見圖4）。 英國在1996 年報告克隆了三只山羊[15]。

圖4 胎兒成纖維細(xì)胞核移植

1.5 體細(xì)胞核移植 對動物的體細(xì)胞進(jìn)行抑制和休眠， 然后通過核移植將去除染色質(zhì)的成熟卵母細(xì)胞導(dǎo)入胚胎，然后移植到受體、妊娠和出生來克隆動物（見圖5）。 理論上，該方法能不受限制地克隆個體。這一技術(shù)的突破在科學(xué)和生產(chǎn)應(yīng)用價值上，可以與原子彈的初始爆炸相當(dāng)[16]。

1.6 胚胎嵌合 將兩個胚胎細(xì)胞（同種或異種動物胚胎）融合，共同發(fā)育成一個稱為嵌合胚胎[17]。 然后將嵌合胚胎轉(zhuǎn)移到受體妊娠， 生產(chǎn)具有上述兩種動物胚胎的動物稱為嵌合動物 （見圖6）。 嵌合體這個詞起源于希臘神話，指的是一頭獅子的頭，一只羊的身體，還有一條龍的尾巴的怪物。 像一只黑老鼠和一只白老鼠的胚胎嵌合體一樣， 黑白花老鼠誕生了。不同種類的綿羊與山羊胚胎細(xì)胞嵌合，可產(chǎn)生綿羊，兼有兩種羊的特征。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)動物模型的研究。

圖5 體細(xì)胞核移植

圖6 胚胎嵌合

2 豬的胚胎克隆

2.1 豬克隆技術(shù)簡介 豬的克隆技術(shù)不僅有助于提高優(yōu)勢動物的產(chǎn)量， 而且也有助于生產(chǎn)具有不含異種移植抗原器官的敲除動物， 或分析分離的人類基因的功能。 生產(chǎn)克隆豬的策略見圖7。 目前，豬克隆技術(shù)已逐漸從胚胎克隆轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞克隆， 主要包括細(xì)胞活化、選擇供體細(xì)胞、胚胎培養(yǎng)和誘導(dǎo)與維持妊娠等方面：（1）供體細(xì)胞的收集。 從屠宰場采集的卵巢中可以獲得大量的未成熟卵母細(xì)胞， 通過體外成熟和體外受精獲得成熟卵母細(xì)胞和胚胎。（2）卵母細(xì)胞分離、篩選和去核。 威拉德森實驗證明，MⅡ階段成熟卵母細(xì)胞比受精卵更適合克隆[18]。因此，所有豬克隆都選擇MⅡ期卵母細(xì)胞作為核移植受體細(xì)胞。通過盲吸、半卵或功能性去核來去除細(xì)胞核。（3）核細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和核提取。豬的核供體細(xì)胞可分為胚胎細(xì)胞（受精卵)和體細(xì)胞(乳腺細(xì)胞、耳皮細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等）兩類。 細(xì)胞核通常通過顯微手術(shù)吸出。（4）胚胎的重建。短時間內(nèi)吸出供體核，打入受體卵細(xì)胞，然后融合重建的胚胎，促進(jìn)核卵重組。（5）重建胚胎的移植。 將重建的胚胎在體外培養(yǎng)一定時間， 直到發(fā)育到囊胚階段， 然后將其移植到發(fā)情母豬的子宮和輸卵管中， 使母豬懷孕并生產(chǎn)新的克隆個體。

圖7 豬克隆技術(shù)

2.2 豬克隆研究進(jìn)展 伴隨1997 年“多利”羊的誕生，開創(chuàng)了動物克隆的新歷史。作為與人類關(guān)系密切的豬，自然也引起了科學(xué)家研究的興趣?？寺∝i最早報道是在1981 年，Hoppe 等采用顯微去核和病毒介導(dǎo)方法， 將一個4 細(xì)胞期卵裂球的核移入一個去核的卵母細(xì)胞中獲得克隆豬[11]。 2001 年，澳大利亞科學(xué)家在墨爾本一家醫(yī)院宣布成功培育出澳大利亞第一頭克隆豬，同年又培育了一頭克隆豬[19]，其GT 基因被成功“關(guān)閉”[19]；同年，賴良學(xué)采用基因敲除技術(shù)先培育出7 頭不帶“排斥基因”的克隆豬[20]；同年10 月，美國密蘇里大學(xué)培育出4 頭含有熒光水母基因的小豬[21]。 2002 年異種器官移植研究領(lǐng)域的一個重要進(jìn)展是英國PPL 醫(yī)療公司培育出5 頭體內(nèi)有一個基因被關(guān)閉的新型轉(zhuǎn)基因克隆豬。 2002 年4 月， 美籍華裔楊向中教授和臺灣大學(xué)教授鄭登貴成功將人類第九凝血因子及豬乳鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入到豬體內(nèi)，生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因克隆豬[23]；同年7 月，日本研究人員將豬皮細(xì)胞的核移植入未受精的卵細(xì)胞，電刺激融合，移植到子宮，成功培育出一頭雌性克隆豬[24]；同年8 月，韓國研究人員采用體細(xì)胞克隆方法生產(chǎn)出5 頭雌性小豬[25]。 2003 年中國臺灣的研究人員將成年豬的一個完整細(xì)胞植入一個原有遺傳物質(zhì)已經(jīng)被抽空的受精卵中，成功克隆出4 頭小豬。2004年7 月， 日本科學(xué)家將綠色熒光蛋白質(zhì)的水母基因植入豬的體細(xì)胞中，然后通過體細(xì)胞克隆技術(shù)，生產(chǎn)出含有水母基因的轉(zhuǎn)基因克隆豬[25]。 2005 年中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獨立自主完成首例體細(xì)胞克隆小香豬[26]；2006 年采用體細(xì)胞克隆技術(shù)成功“克隆”出我國東北民豬[27]。2007 我國運用體細(xì)胞克隆技術(shù)，成功克隆出醫(yī)用小型豬。2008 年中國農(nóng)大試驗用同一頭母豬作為移植受體克隆出健康歐洲哥廷根小型豬， 克隆效率達(dá)到了國際先進(jìn)水平[28]。 2010 年魏紅江團(tuán)隊運用體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得世界第一頭版納微型豬近交系克隆豬[29]；2014 年，我國又獲得世界第一頭孤雌生殖克隆豬；2015 年我國與美方合作首次獲得了滅活了內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的克隆豬。2020 年四川運用體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得23 頭克隆青峪豬[30]。

2.3 豬的克隆技術(shù)

2.3.1 卵母細(xì)胞的體外成熟、 受精和培養(yǎng) 豬的克隆技術(shù)主要分為四個步驟， 首先是卵母細(xì)胞的體外成熟、受精和培養(yǎng)。直到最近，還很難通過體外成熟、受精和培養(yǎng)從未成熟卵母細(xì)胞中產(chǎn)生豬囊胚。 最突出的障礙之一是通過體外受精獲得的正常受精卵母細(xì)胞很少。 從卵巢卵泡中解放出來的未成熟卵母細(xì)胞在培養(yǎng)過程中幾乎都能恢復(fù)減數(shù)分裂，達(dá)到中期。雖然成熟的卵母細(xì)胞可以通過遺精在體外滲透，但觀察到雄性原核形成率低，多精子發(fā)生率高。結(jié)果表明， 豬穿透卵母細(xì)胞雄性原核形成的失敗可歸因于卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的不完全成熟， 成熟條件得到了改善。用于豬卵母細(xì)胞成熟的培養(yǎng)基通常輔以血清，如胎犢血（FCS）、新生小牛血清和豬血清。 然而，據(jù)報道，F(xiàn)CS 抑制豬卵母細(xì)胞在添加FSH 的改良Krebs-Ringer 碳酸氫鹽溶液中的成熟， 不能改善精子體外穿透后的雄性原核形成。相反，當(dāng)卵母細(xì)胞在豬濾泡液(FF)中成熟時，添加FSH 的卵母細(xì)胞在體外受精，81%穿透卵母細(xì)胞中的雄性原核表達(dá)也表明， 在改良的組織培養(yǎng)基-199 中添加10%FCS 或Newborn-仔豬血清似乎不利于細(xì)胞質(zhì)成熟， 因為雄性原核形成低于10%PFF 或0.4%聚乙烯醇[31]。

通過控制處理精子和卵母細(xì)胞受精的培養(yǎng)基條件，可以降低多精子率。當(dāng)精子與輸卵管細(xì)胞預(yù)孵育2.5 h 時，多精子率降低，而穿透率沒有明顯降低。此外，單在精子預(yù)孵育過程中，在mTCM-199 中加入0.4%牛血清白蛋白（BSA） 可降低多精子癥的發(fā)生率。 最近，據(jù)報道，采用改良的Tris 緩沖培養(yǎng)基作為受精培養(yǎng)基， 在不預(yù)孵化精子的情況下抑制了多精子[32]。

豬囊胚體外產(chǎn)生的另一個問題是受精卵的發(fā)育在4 細(xì)胞階段受阻。為了克服這種發(fā)育停滯，研究了各種因素對活體受精豬卵母細(xì)胞體外發(fā)育的影響。草酰乙酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸或乳酸可作為早期卵裂期小鼠胚胎的唯一能源。 乳酸和丙酮酸通常包括在培養(yǎng)基中，乳酸被認(rèn)為是最佳發(fā)育所必需的，然而，在豬中，乳酸抑制胚胎發(fā)育，胚胎發(fā)育不需要乳酸或丙酮酸。在沒有乳酸和丙酮酸的情況下，葡萄糖和谷氨酰胺支持胚胎發(fā)育到Morula 和囊胚階段。低?；撬峄蚺；撬岬募尤腼@著改善了體外胚胎發(fā)育。 基于這些結(jié)果，開發(fā)了一種指定的NCSU-23 培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)豬體內(nèi)受精胚胎到囊胚期。NCSU-23不僅可用于體外胚胎的培養(yǎng)， 還可用于未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟。 添加透明質(zhì)酸刺激胚泡形成體內(nèi)受精胚胎和電活化卵母細(xì)胞或體外受精胚胎， 這些胚胎已在體外成熟。 最近， 據(jù)報道， 牛血清白蛋白(BSA)是豬胚胎發(fā)育的一個重要因素：本質(zhì)上不含脂肪酸的BSA 支持發(fā)育，但V 級BSA 具有脫胎效應(yīng)。此外，在晚胚乳期/早期囊胚期添加FCS 刺激囊胚孵化，盡管FCS 對發(fā)育有害，直到胚胎到達(dá)晚胚/早期囊胚期[33]。

2.3.2 核轉(zhuǎn)移 用postembryonic 基因組激活階段核重組的豬核移植胚胎的體外發(fā)育能力非常有限，到目前為止，只有一頭仔豬是由于核移植而產(chǎn)生的。仔豬MS 來源于單4 細(xì)胞胚體與中期LI 卵母細(xì)胞的融合，是88 個已轉(zhuǎn)移的重建胚胎之一。結(jié)果表明，豬核移植胚胎由8 至16 個細(xì)胞期核重組，成熟卵母細(xì)胞在體外裂解的速率為36%～43%， 但Morula 期以外的發(fā)育速率僅為4.5%～7%。 最近報告，28%的核移植胚胎與Morula 期細(xì)胞核重組，15%發(fā)育形成囊胚，采用預(yù)激活卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞，并在電激活后6 h 誘導(dǎo)囊胚與細(xì)胞融合， 去除細(xì)胞質(zhì)脂后冷凍保存。

2.3.3 胚胎移植 目前， 仔豬尚未通過體外從未成熟卵母細(xì)胞中產(chǎn)生的囊胚轉(zhuǎn)移獲得。 當(dāng)從體內(nèi)或體外受精卵母細(xì)胞體外發(fā)育的囊胚被轉(zhuǎn)移到受體雌性中時， 從體內(nèi)受精卵母細(xì)胞中獲得的胚胎會產(chǎn)生后代， 但從體外受精卵母細(xì)胞中獲得的胚胎的轉(zhuǎn)移并不會導(dǎo)致懷孕。 另一方面，研究表明，體外成熟的胚胎和受精的卵母細(xì)胞在2 細(xì)胞階段轉(zhuǎn)移到受體時，可以發(fā)育成仔豬。 這些結(jié)果表明，如果體外成熟、受精和培養(yǎng)的任何系統(tǒng)都不完整，卵母細(xì)胞/胚胎的活力在所有階段都會受到影響[34]。 當(dāng)采用體外成熟/受精或體外培養(yǎng)時，胚胎可以在移植后發(fā)育成仔豬，因為損傷量相對較小。 然而，通過體外成熟、受精和培養(yǎng)產(chǎn)生的胚胎損傷是廣泛的，它們不會發(fā)育到后代。

2.3.4 孵化囊胚 孵化的囊胚衍生細(xì)胞與體外成熟卵母細(xì)胞融合。一般來說，由平行絲組成的腔室已被用于融合， 但該腔室不適合融合孵化的囊胚衍生細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞。 相反，當(dāng)細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合物被夾在排列在一條直線上的電線之間時， 融合胚胎的百分比很高（未公布的數(shù)據(jù)）。 在體外培養(yǎng)重建胚胎時，其中一些胚胎被切割并發(fā)育到囊胚階段。在進(jìn)一步進(jìn)行的試驗中， 重建的胚胎被轉(zhuǎn)移到受體實體中，以檢查它們發(fā)育成后代的能力[35]。

4 存在的問題與不足

雖然豬克隆的意義深遠(yuǎn)， 但其應(yīng)用研究進(jìn)展相對緩慢，相關(guān)技術(shù)仍很不完善。 比如體外受精，體外培養(yǎng)體系和體外成熟技術(shù)還很不成熟， 核分離和卵母細(xì)胞去核化水平也有待提高。 因為基礎(chǔ)理論研究在我國相對薄弱， 對一些早期胚胎發(fā)生和發(fā)育機制缺乏深入了解，此外，對一些基因組重編程的機制尚不清楚， 對核移植后基因組重編程的影響也有待進(jìn)一步闡明。盡管困難和問題較多，但是作為種質(zhì)資源擴繁和異種移植的巨大前景， 仍將激勵更多的投入和付出。 總之，豬克隆技術(shù)將得到進(jìn)一 步改進(jìn)和發(fā)展，基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實踐的應(yīng)用將更加廣泛。

5 結(jié) 論

克隆豬的生產(chǎn)系統(tǒng)不僅對于提高優(yōu)勢動物的產(chǎn)量非常重要， 而且對于生產(chǎn)具有不含異種移植抗原器官的Imockout 動物，或分析分離的人類基因的功能也非常重要，但有效的系統(tǒng)尚未開發(fā)。一個突出的障礙是缺乏支持這項研究所需的基本技術(shù)信息，這些基本技術(shù)需要發(fā)展到一個令人滿意的水平， 然后才能開發(fā)克隆豬的生產(chǎn)系統(tǒng)。