酒石酸唑吡坦在模擬失重狀態(tài)下SD大鼠體內(nèi)十二指腸吸收特性*

張旸，井娟，趙軍，張瑞濤，徐媛，劉雪英，王慶偉

(1.中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，西安 710038；2.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)士官學(xué)校，石家莊 050081；3.中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)教研室，西安 710032)

航天員進入太空后，由于晝夜頻繁更迭會造成生物鐘紊亂，容易引起睡眠障礙。酒石酸唑吡坦(zolpidem tartrate，ZPD)用于治療失眠癥，可選擇性與苯二氮 ω1受體結(jié)合，常規(guī)治療期內(nèi)極少產(chǎn)生耐受性和身體依賴性，唑吡坦的不良反應(yīng)發(fā)生率較其他鎮(zhèn)靜催眠藥物低[1]，例如肝腎功能、心血管疾病方面的不良反應(yīng)發(fā)生率十分罕見[2]，撤藥后反跳反應(yīng)及戒斷反應(yīng)也少于其他鎮(zhèn)靜催眠藥物，更多地不良反應(yīng)則以頭痛和頭暈、口干、便秘等現(xiàn)象為主[3]。因此，安全性比較高的酒石酸唑吡坦類藥物適于作為航天員在失重環(huán)境下調(diào)整睡眠的一線用藥。但是由于航天失重環(huán)境會引起機體生理功能改變，進而影響到藥物的藥動學(xué)及藥效學(xué)特征，從而給航天用藥帶來隱患[4]。同時十二指腸是酒石酸唑吡坦在體內(nèi)的主要吸收部位[5]，因此需要考察模擬失重狀態(tài)下酒石酸唑吡坦在十二指腸中吸收如何改變。

1 材料與方法

1.1儀器 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；BP221S型萬分之一電子分析天平(德國塞多利斯，感量：0.01 mg)；BT100-1F 型蠕動泵驅(qū)動器(保定蘭格恒流泵有限公司)；RWD510 型動物麻醉系統(tǒng)(深圳市瑞德沃生命科技有限公司)；Milli-Q Advantage A10超純水機(德國默克密理博)；KH5200DV超聲儀(浙江昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 酒石酸唑吡坦對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量：97.2%，批號：171258-201602)；酒石酸唑吡坦原料(上海曙燦實業(yè)有限公司，批號：99295-93-6，純度85.0%)；自制純水；甲醇和磷酸為色譜純；其余試劑為市售分析純；水為色譜用水和純化水。

1.3動物 清潔級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(220±20)g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供，動物質(zhì)量合格證號：醫(yī)動字第08-005號，動物許可證號：SCXK(軍)2014-007。在實驗室溫度約25 ℃以及適宜濕度的條件下喂養(yǎng)7 d，實驗前一天間隔12 h不投放飼料，但可以正常飲水。

1.4方法

1.4.1模擬失重大鼠模型的建立 將SD大鼠隨機分為4組模型(模擬失重1，2，3，4周)，每組6只。將模型組大鼠尾部清潔后基部剔毛，乙醇消毒并風(fēng)干，涂抹松香酊，稍晾干，兩側(cè)用醫(yī)用膠布貼合并橫向固定，膠布末端系繩，連接可裝卸式鏈條，鏈條另一端固定至籠頂?shù)牟讳P鋼轉(zhuǎn)環(huán)；調(diào)整繩子的長度使大鼠后肢懸垂剛剛脫離水平面，身體與水平面成30 °～40 °夾角，而大鼠仍可自由旋轉(zhuǎn)及自由飲食，每日光照和黑暗時間各12 h，每只大鼠單獨飼養(yǎng)[6]。

1.4.2Krebs-Ringer(K-R)試液 稱取氯化鈣0.37 g、葡萄糖1.4 g，先加入少量純化水使溶解，然后分別稱取氯化鈉7.8 g、氯化鎂0.02 g、氯化鉀0.35 g、磷酸二氫鉀0.32 g與碳酸氫鈉1.37 g，加入純化水不斷攪拌溶解后再與氯化鈣及葡萄糖溶液混勻，用純化水稀釋并定容至1 L，所得溶液即為K-R試液，臨用前使用1.0 mol·L-1NaOH或1.0 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH值。

1.4.3對照品溶液 分別精密稱定酒石酸唑吡坦對照品4.0 mg，加入K-R液超聲并充分溶解后用10 mL棕色量瓶中定容，制得400 μg·mL-1酒石酸唑吡坦對照品儲備液。取對照品儲備液2 mL，稀釋定容至8.0 mL，制得100 μg·mL-1酒石酸唑吡坦對照品溶液。

1.4.4供試液 分別精密稱定酒石酸唑吡坦原料藥5.0 mg，用K-R溶液溶解至50 mL量瓶中，制得100 μg·mL-1供試液。

1.4.5空白對照液 吸取K-R試液適量，按照大鼠在體單向腸灌流(single pass intestinal perfusion，SPIP)實驗操作方法，將流出腸灌流液收集即得。

1.4.6HPLC色譜條件 Intertsil ODS-3色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，加預(yù)柱：Waters X Terra C18柱；流動相：乙腈-甲醇-磷酸緩沖液(0.15%磷酸、0.15%三乙胺)按20：17：63比例配制，等度洗脫，洗脫時間15 min。檢測波長為254 nm。柱溫：25 ℃。流速為1.0 mL·min-1，進樣量：10 μL。

1.4.7方法學(xué)考察

①專屬性。精密量取對照品溶液、“1.4.4”項下腸灌流液、空白對照液按“1.4.6”項下色譜條下進樣分析。

②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密量取“1.4.3”項下酒石酸唑吡坦對照品儲備液，用K-R液稀釋為5，10，20，50，100，200 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述溶液按“1.4.6”項下色譜條件進樣分析，以酒石酸唑吡坦峰面積(Y)對濃度(X，μg·mL-1)進行線性回歸。

③精密度。分別吸取酒石酸唑吡坦低、中、高不同濃度(5，50，200 μg·mL-1)的對照品溶液，按“1.4.6”項下色譜條件每個濃度溶液連續(xù)進樣6次。

④穩(wěn)定性。取酒石酸唑吡坦腸灌流液分別在0，2，4，8，12，24 h按“1.4.6”項下色譜條件進樣測定。

⑤回收率。吸取已知含量的酒石酸唑吡坦腸灌流液9份，每份吸取0.5 mL，分成3組，一組3份。每組加入體積為0.2，0.25，0.3 mL濃度為100 μg·mL-1的對照品溶液，再加入K-R液稀釋至1.0 mL，按“1.4.6”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。

1.4.8大鼠在體單向腸灌流實驗 將模擬失重組SD大鼠和正常組SD大鼠禁食12 h以后麻醉，麻醉方式采用吸入異氟烷，仰臥方式固定在實驗臺，沿大鼠腹部中線打開腹腔，將供試腸段(十二指腸)分離出來，長度選取約為10 cm。將十二指腸兩端切口并插管用縫合線結(jié)扎，提前將0.9%氯化鈉溶液加熱到37 ℃并沖洗腸道內(nèi)容物。同時預(yù)熱供試液至37 ℃，然后以1.0 mL·min-1的流速灌流沖洗10 min，收集灌流液。隨后調(diào)整流速至0.2 mL·min-1，平衡30 min。灌流瓶加入供試液稱質(zhì)量并記錄質(zhì)量，在進口端以0.2 mL·min-1的流速進行灌流，收集液小瓶稱質(zhì)量并記錄，放在出口端每隔15 min收集一份腸灌流液，共計收集2 h。收集完成后稱質(zhì)量供試液小瓶與收集灌流液小瓶質(zhì)量并記錄。灌流實驗結(jié)束后剪下十二指腸段并測量其長度與內(nèi)徑。

灌流液3000×g離心10 min，離心后吸取上清液，再用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，最后進行樣品分析。由于腸道對灌流液水分吸收會造成體積改變，本實驗采用重量法對灌流液體積進行校正，并利用以下公式[7]計算藥物的吸收速率參數(shù)(Ka)和有效滲透系數(shù)(Peff)：

式中Vin與Vout分別為進口端與出口端的灌流液體積[灌流液密度預(yù)定為1 g·(cm3)-1]，Cin和Cout分別為進口端和出口端灌流液濃度，l與r分別為十二指腸腸段的長度與內(nèi)徑(cm)，Q為灌流速度。

2 結(jié)果

2.1專屬性 實驗結(jié)果顯示保留時間4.2 min處腸灌流液與對照品，并且空白對照液沒有雜質(zhì)干擾，見圖1。

A.空白對照液；B.對照品；C.腸灌流液。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線 腸灌流液中酒石酸唑吡坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=27.233 4X-10.572 2，r=0.999 9，表明酒石酸唑吡坦在5～200 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3精密度 通過對測得酒石酸唑吡坦低、中、高濃度的峰面積進行計算得到精密度RSD分別為0.41%，0.36%，0.23%(n=6)。

2.4穩(wěn)定性 通過對測得酒石酸唑吡坦峰面積進行計算得出樣品在24 h內(nèi)RSD為0.72%(n=6)，樣品含量變化符合要求，表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5回收率 酒石酸唑吡坦在K-R試液中平均回收率為99.63%，RSD為0.43%(n=9)。

2.6酒石酸唑吡坦SD大鼠十二指腸吸收動力學(xué) 酒石酸唑吡坦在模擬失重狀態(tài)下與正常組SD大鼠十二指腸段中的吸收情況見表1。結(jié)果表明酒石酸唑吡坦在模擬失重狀態(tài)下SD大鼠體內(nèi)十二指腸Peff和Ka均小于正常組SD大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且模擬失重2周時Ka最小，第4周時趨于正常，但仍小于正常組吸收參數(shù)。因此模擬失重狀態(tài)對會減少酒石酸唑吡坦在SD大鼠十二指腸段吸收程度和吸收速度。

表1 十二指腸的吸收參數(shù)

3 討論

大鼠在體SPIP技術(shù)十分成熟，重復(fù)性高，同時對大鼠腸黏膜的損傷較小，因此已經(jīng)成為FDA認(rèn)可的可用于研究藥物吸收的方法之一。該方法可以保證在實驗過程中實驗對象的神經(jīng)支配和血液供應(yīng)都得到較完整的保護，測得結(jié)果與人體腸道吸收近似[8-9]。本次實驗采用SPIP研究酒石酸唑吡坦在模擬失重狀態(tài)下SD大鼠體內(nèi)十二指腸吸收特性分析，通過與正常狀態(tài)SD大鼠十二指腸吸收參數(shù)進行比較，為航天中宇航員精準(zhǔn)用藥提供依據(jù)。

目前人體模擬失重的主要方法有浸水實驗、頭低位臥床等[10]。動物模擬失重模型主要有尾部懸吊模型。該方法是一種成熟的方法，可以創(chuàng)建基于地面的失重模型，模仿與太空飛行相關(guān)的許多生理變化[11]。故本實驗采用經(jīng)典Morey-Holton大鼠尾吊模型[6]，該造模方法為將SD大鼠尾部固定，并且調(diào)整長度使大鼠后肢懸垂脫離水平面，使大鼠身體與水平面夾角成30°。該模型能有效模擬真實太空飛行中宇航員的一系列生理變化，例如尿量增大，骨和肌肉萎縮，頭頸部水腫等改變。根據(jù)CHOWDHURY等[12]通過對比模擬失重動物模型中尾部懸掛與骨盆懸掛研究發(fā)現(xiàn)，該模型具有穩(wěn)定、創(chuàng)傷小，在實驗過程中動物可以保證正常的體質(zhì)量增長以及較少的骨骼畸變等優(yōu)點。所以，該方法被認(rèn)為是目前動物模擬失重的最理想造模方式之一。

建立酒石酸唑吡坦含量測定方法時，經(jīng)過對比不同型號色譜柱的保留時間以及樣品峰型，最終確定使用Intertsil ODS-3型色譜柱。同時考察了不同流動相以及流動相比例的效果。起初采用0.05 moL·L-1磷酸溶液作為流動相水相，但發(fā)現(xiàn)樣品峰型有拖尾現(xiàn)象，故采用加入三乙胺調(diào)節(jié)pH值，最終確定流動相水相中分別加入0.15%磷酸以及三乙胺時，色譜峰出峰時間以及峰型效果最佳。最初流動相比例為水相占83%，甲醇占7%，乙腈占10%，導(dǎo)致出峰時間在約27 min，出峰時間過長，故調(diào)整流動相比例最終為乙腈(20%)-甲醇(17%)-磷酸緩沖液(63%)，出峰時間顯著提前到約4.2 min。

灌流實驗中，腸道在吸收藥物的同時也會吸收或分泌水分，造成腸灌流液出口端的質(zhì)量濃度發(fā)生變化，所以需要對出口液體積進行校正。校正方法通常為酚紅法和重量法，但是研究發(fā)現(xiàn)酚紅在腸道內(nèi)會存在一定程度的吸收，對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，所以此次實驗采用重量法進行校正[13]。同時在實驗過程中，藥物會有部分吸附到灌流管路中，為了使灌流儀中管路等實驗器材對實驗結(jié)果的干擾最小，需要在正式實驗前預(yù)平衡30 min。

酒石酸唑吡坦由于不良反應(yīng)較少，是航天員在太空中治療失眠的一線用藥[13-14]。但由于失重狀態(tài)下會引起藥物在體內(nèi)吸收發(fā)生變化，進而導(dǎo)致藥物在體內(nèi)的藥動學(xué)及藥效學(xué)特征改變[16-17]，從而影響航天員用藥安全，根據(jù)微重力狀態(tài)下藥物代謝變化規(guī)律制定個體化給藥方案，是奠定航天中安全、高效用藥的重要基礎(chǔ)之一。實驗研究發(fā)現(xiàn)，失重狀態(tài)下十二指腸的Peff和Ka較正常組變化很大，均小于正常組大鼠。模擬失重2周時吸收速率參數(shù)最低，模擬失重4周時吸收參數(shù)趨于正常。文獻[18]報道，隨著模擬失重時間不斷增加，機體會產(chǎn)生較大應(yīng)激反應(yīng)，此時大鼠體液丟失、體質(zhì)量降低、蛋白質(zhì)合成減少以及肌肉萎縮等原因造成藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝以及排泄過程都發(fā)生了改變。因此當(dāng)失重時間達到2周的時候，大鼠機體正處于應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致酒石酸唑吡坦在大鼠體內(nèi)吸收降低。失重4周的時候大鼠已經(jīng)適應(yīng)了失重狀態(tài)，體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)減小，所以吸收參數(shù)較前3周趨于正常狀態(tài)。Peff和Ka是決定藥物在腸道吸收速度與程度的重要參數(shù)，本實驗說明在失重狀態(tài)下，SD大鼠對酒石酸唑吡坦吸收程度和吸收速度減少，如果航天員采用正常劑量服藥，可能會造成藥物藥效降低，無法起到治療失眠作用。但是具體如何調(diào)整還需要進一步進行藥動學(xué)以及藥物代謝酶相關(guān)研究。