人類輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械精子毒性檢驗(yàn)

【作 者】連環(huán)，陳虹，韓倩倩

中國食品藥品檢定研究院，北京市，102629

0 引言

為配合人類輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，人類輔助生殖用醫(yī)療器械的開發(fā)層出不窮，其涵蓋了所有與精子、卵母細(xì)胞或胚胎直接或間接接觸的培養(yǎng)基類及器具/耗材類產(chǎn)品，而精子毒性檢測是此類產(chǎn)品安全有效性評價(jià)中不可或缺的一環(huán)?，F(xiàn)有的YY/T 1535規(guī)定了人精子存活試驗(yàn)的相關(guān)細(xì)節(jié)[1]，但對于其不適用的精子優(yōu)選類和精子制動類產(chǎn)品還需進(jìn)一步探索各自特定的性能指標(biāo)及檢測方法。同時(shí)為了加快產(chǎn)品檢驗(yàn)流程，避免對人精子資源的浪費(fèi)和倫理審查之類的煩瑣流程，人精子替代試驗(yàn)也是值得關(guān)注的方向。

1 人類輔助生殖技術(shù)及相關(guān)醫(yī)療器械的種類、風(fēng)險(xiǎn)與監(jiān)管

人類輔助生殖技術(shù)（human assisted reproductive technology，ART）是20世紀(jì)70年代興起的，通過運(yùn)用醫(yī)學(xué)技術(shù)和方法對配子、合子、胚胎進(jìn)行人工操作，從而使不育夫婦妊娠的技術(shù)，涵蓋了人工授精（artificial insemination,AI）和體外受精-胚胎移植（in vitrofertilization and embryo transfer,IVF-ET）技術(shù)及其各種衍生技術(shù)[2-4]。ART相關(guān)醫(yī)療器械類產(chǎn)品主要有各種培養(yǎng)液、沖洗液、緩沖液、冷凍液等培養(yǎng)基類產(chǎn)品；還有各種培養(yǎng)皿、取卵針、顯微注射針以及其胚胎移植導(dǎo)管等耗材器具類產(chǎn)品。這些產(chǎn)品在ART操作過程中均與人類配子和/或胚胎發(fā)生直接或間接接觸，因此不孕不育患者在使用它們的同時(shí)也面臨著巨大的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)槠浒踩圆粌H影響著患者，還有可能影響患者后代的健康和發(fā)育安全[5-6]。綜上所述，亟須對此類產(chǎn)品加大監(jiān)管力度，以保障廣大民眾的用械健康，而我國也對ART相關(guān)醫(yī)療器械給予了高度的重視，并建立了特殊的監(jiān)管體制[7-9]。由于目前在我國市場上使用的各類產(chǎn)品中培養(yǎng)液及保存液類產(chǎn)品主要為進(jìn)口產(chǎn)品，國內(nèi)大多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)還處于起步階段但發(fā)展迅速，多數(shù)產(chǎn)品現(xiàn)處于申請注冊前檢驗(yàn)或申請注冊階段，所以我國也正在積極推進(jìn)人類輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械的標(biāo)準(zhǔn)化工作，以期為相關(guān)產(chǎn)品的順利注冊以及行業(yè)的健康發(fā)展保駕護(hù)航[10-12]。

2 相關(guān)器械針對人精子的安全性檢測以及功能性檢測

2.1 人精子存活試驗(yàn)是可用于大多數(shù)產(chǎn)品安全性的檢測試驗(yàn)

ART類醫(yī)療器械的安全性評價(jià)因?yàn)槠渑R床用途的特殊性，往往需要增加其對人類配子（如精子）的影響。2017年國家食品藥品監(jiān)督管理局就發(fā)布了《人類體外輔助生殖用醫(yī)療器械 生物學(xué)評價(jià) 人精子存活試驗(yàn)》（YY/T 1535-2017），用于評價(jià)ART器械中與精子、卵母細(xì)胞或胚胎直接接觸的培養(yǎng)基類及器具/耗材類產(chǎn)品可能產(chǎn)生的毒性風(fēng)險(xiǎn)[1]。人精子存活試驗(yàn)就是利用人類精子與供試品或其浸提液共孵育后人精子活力的變化來間接判斷受試物對精子、卵子或胚胎的潛在毒性，其中對于人精子的活力用試驗(yàn)中前向運(yùn)動精子（progressive motility，PR）占全部精子（前向運(yùn)動，不活動和非前向運(yùn)動精子的總和）數(shù)量的百分比來表征，也即：精子活力=（前向運(yùn)動精子/精子總數(shù)）×100%。

但值得注意的是，此試驗(yàn)并不適用于精子制動液（因?yàn)槠湓斐删舆\(yùn)動能力的明顯下降）、透明質(zhì)酸酶（影響精子膜進(jìn)而影響精子運(yùn)動）及配子/胚胎冷凍復(fù)蘇液（明顯不利于精子運(yùn)動）等產(chǎn)品的檢測。

2.2 對于人精子存活試驗(yàn)不適用的產(chǎn)品可根據(jù)其產(chǎn)品特性制定其功能性試驗(yàn)

對于以上這些ART產(chǎn)品，可采用鼠胚試驗(yàn)替代人精子存活試驗(yàn)[13]，且應(yīng)當(dāng)根據(jù)其各自特殊的功能，研究增加其特定的性能指標(biāo)，制定相關(guān)功能性檢測試驗(yàn)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。比如說在《人類體外輔助生殖技術(shù)用液注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》中就規(guī)定了，對于精子密度梯度分離液等密度梯度離心介質(zhì)及組織培養(yǎng)油，還需制定其密度指標(biāo)[14]；組織培養(yǎng)油和精子制動液等產(chǎn)品還需制定其黏度要求等理化指標(biāo)。同時(shí)對于精子密度梯度分離液等精子優(yōu)選產(chǎn)品應(yīng)制定活動精子回收率、處理后精子活力提升率等指標(biāo)，精子制動液也應(yīng)制定精子制動性能等功能性指標(biāo)[15-16]。

精子活力提升試驗(yàn)是基于存活試驗(yàn)的拓展，通過模擬精子優(yōu)選類產(chǎn)品的臨床使用過程，來研究經(jīng)過產(chǎn)品處理后及處理前的精子活力的差異——精子活力提升率，也即：精子活力提升率=處理后精子活力-處理前精子活力。

并根據(jù)活力提升率的大小來說明相關(guān)產(chǎn)品是否能實(shí)現(xiàn)其描述的功能[17-18]。當(dāng)然對于此類產(chǎn)品，僅僅是精子活力提升率一個指標(biāo)還不足夠，因?yàn)槿绻涫沟镁訑?shù)目劇烈下降而不足以滿足臨床使用要求時(shí)，該產(chǎn)品的有效性也是值得商榷的[19-20]。因此我們添加了另一個指標(biāo)——活動精子回收率，也即：活動精子回收率=（處理后活動精子總數(shù)/處理前活動精子總數(shù)）×100%。

通過這兩個指標(biāo)，就可以比較完整地描述精子優(yōu)選類產(chǎn)品的有效性。

而精子制動類產(chǎn)品的主要功能是在對精子進(jìn)行顯微操作時(shí)人為降低精子活動力從而達(dá)到便于操作的目的，因此評價(jià)方法與指標(biāo)也要做出相應(yīng)調(diào)整[21]。需要注意的是，此時(shí)我們選擇的表征量是精子活動力而不是精子活力，因?yàn)榫踊盍Φ亩x僅僅是試驗(yàn)中前向運(yùn)動精子占全部精子數(shù)量的百分比，不足以細(xì)節(jié)化描述精子運(yùn)動情況[22-23]。精子活動力一般用精子的直線運(yùn)動速率表示，可通過顯微鏡同計(jì)數(shù)板配合進(jìn)行目視測量，也可使用計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)（computer-aided sperm analysis,CASA）對其進(jìn)行更快捷、客觀計(jì)量[24-26]。類似于精子優(yōu)選類產(chǎn)品，精子制動類產(chǎn)品的制動性能可通過經(jīng)產(chǎn)品處理后的精子活動力或者精子制動率來表示，也即：精子制動率=（處理后精子活動力/處理前活動活動力）×100%。

這些功能性試驗(yàn)不僅僅可以驗(yàn)證相應(yīng)產(chǎn)品的安全性，還可以間接反映其有效性，因此也是未來試驗(yàn)開發(fā)重點(diǎn)研究方向。

3 關(guān)于人精子試驗(yàn)替代方法的探索

ART的出現(xiàn)改變了人類傳統(tǒng)生育方式，在造福人類的同時(shí)也帶來了諸多倫理道德和社會法律問題，精子攜帶著人體一半的核酸信息，具有同卵子結(jié)合后發(fā)育成完整個體的潛能，因此涉及精子的使用往往需要通過多道倫理審查程序[7-9]。而且國內(nèi)精源短缺的現(xiàn)象十分普遍，在捐獻(xiàn)精子人數(shù)有限的情況下，使得眾多不孕不育家庭順利得到解決仍是個嚴(yán)峻的問題，因此業(yè)內(nèi)也有人表示采用人精子進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)是一種對資源的浪費(fèi)[27-29]。此時(shí)，尋找一個可替代的動物精子模型也成了新的發(fā)展趨勢。作為常見的家畜，豬牛兔的精子來源比較可靠，且其外部形態(tài)與人精子無明顯差異，均具有頭、頸、尾三個部分[30-31]。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)可知，豬、牛精子的頭頸長度比率與人精子類似，但尾部差異相對較大。特別是豬精子曾在多篇關(guān)于精子優(yōu)化方法和精子速率檢測的研究文章中被使用，其操作過程基本與人ART技術(shù)的一致，且試驗(yàn)結(jié)論也具有一定的可推廣性[32-34]，因此可作為人精子的替代生物材料進(jìn)行試驗(yàn)。但是因?yàn)槭莿游飦碓床牧?，仍需要對其病原體去除以及對精子獲能動力等過程進(jìn)行驗(yàn)證并與人精子比較，以確認(rèn)其適用性[35-36]。

除了使用動物精子模型替代人精子這個思路外，進(jìn)行其他替代試驗(yàn)也是另一個探索方向，比如上文提到的，制動液類產(chǎn)品不適用于精子存活試驗(yàn)時(shí)可用鼠胚試驗(yàn)代替[13]。因?yàn)榫哟婊钤囼?yàn)和鼠胚試驗(yàn)都能達(dá)到驗(yàn)證環(huán)境或材料對配子細(xì)胞或胚胎是否具有毒性的目的，因此二者被廣泛應(yīng)用于評估IVF-ET實(shí)驗(yàn)室及其配套儀器耗材質(zhì)量，比如說新安裝的培養(yǎng)箱就需要以已運(yùn)行培養(yǎng)箱為對照進(jìn)行精子存活或鼠胚試驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后才可以啟用[37]。但相較于鼠胚試驗(yàn)，因?yàn)榫哟婊钤囼?yàn)具有靈敏性高，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，是IVFET實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最為廣泛的質(zhì)控試驗(yàn)。且鼠胚試驗(yàn)雖進(jìn)行結(jié)果的判定，但無論是采用顯微鏡同計(jì)數(shù)板配合進(jìn)行目視測量還是計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)（CASA）都只能在同一時(shí)間觀察單個焦平面上的精子狀況，因此對于其整體狀況的評估也需要進(jìn)一步驗(yàn)證的質(zhì)量[38]。

4 思考與討論

隨著世界范圍內(nèi)人類輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，我國相關(guān)技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)化體系也有了長足的進(jìn)步。但不得不承認(rèn)的是相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制修訂工作仍存在著大片空白，比如說除人精子存活試驗(yàn)外其他適用于人精子優(yōu)選類產(chǎn)品或制動類產(chǎn)品的安全性及功能性試驗(yàn)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。特別是此類試驗(yàn)往往需要通過精子活力或精子活動力進(jìn)行結(jié)果的判定，但無論是采用顯微鏡同計(jì)數(shù)板配合進(jìn)行目視測量還是計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)（CASA）都只能在同一時(shí)間觀察單個焦平面上的精子狀況，因此對于其整體狀況的評估也需要進(jìn)一步驗(yàn)證后進(jìn)行約定。除此之外，談及人精子試驗(yàn)就一定無法回避倫理問題，因此進(jìn)一步探索人精子的替代試驗(yàn)也會是未來人類輔助生殖技術(shù)用產(chǎn)品毒性評價(jià)的重要方向。