冷凍雙束掃描電鏡的開放與管理

李曉敏

(清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084)

清華大學(xué)儀器設(shè)備采用先進(jìn)的全生命周期管理模式[1]，本文涉及的大型儀器帶冷凍傳輸系統(tǒng)的雙束掃描電鏡，正是處于該管理模式下. 該儀器自采購(gòu)、到貨安裝以來(lái)，在科學(xué)高效的管理模式下，已成為包括生命、醫(yī)學(xué)、食品、化學(xué)、材料等多個(gè)學(xué)科研究的重要輔助手段之一. 該儀器不僅可觀察處于溶液、凝膠狀態(tài)樣品在原生態(tài)的形貌，還可進(jìn)行樣品的精細(xì)聚焦離子束加工，尤其是應(yīng)用聚焦離子束技術(shù)制備的細(xì)胞或組織樣品的冷凍超薄切片，可與冷凍透射電子顯微學(xué)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)原位生物大分子高分辨結(jié)構(gòu)的解析，這也是目前國(guó)際相關(guān)研究領(lǐng)域的前沿發(fā)展技術(shù). 總之，該類型儀器可實(shí)現(xiàn)多種技術(shù)功能，系統(tǒng)配備選擇多樣化，目前商業(yè)化的儀器包括Thermo Fisher Scientific(賽默飛，原FEI)、HITACHI(日立)、ZEISS(蔡司)、TESCAN等廠家的雙束掃描電鏡，配套的冷凍傳輸系統(tǒng)可選擇英國(guó)Quorum和德國(guó)Leica等公司產(chǎn)品，Thermo Fisher Scientific近年推出一體式冷凍聚焦離子束顯微鏡Aquilos系列. 前些年我校安裝使用的儀器多為分體式的模式，電鏡主體和冷凍傳輸系統(tǒng)分屬不同的廠家，雖然在儀器使用和維護(hù)方面積累了一定經(jīng)驗(yàn)，但存在兼容性問(wèn)題. 近兩年我校新購(gòu)置了一體式儀器，兼容性強(qiáng)，儀器的使用和維護(hù)方面還需進(jìn)一步摸索.

總之，探究帶冷凍傳輸系統(tǒng)雙束掃描電鏡的開放與維護(hù)機(jī)制，總結(jié)儀器故障類型與起因，對(duì)于實(shí)現(xiàn)儀器共享[2-3]，提高同類儀器的管理效率[4-5]，具有較為重要的意義[6]. 本文將以開放共享使用4年的分體式冷凍雙束掃描電鏡為例，介紹包括開放管理模式與成效、儀器故障與維護(hù)等相關(guān)內(nèi)容.

1 儀器的基本配置

Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)的型號(hào)為Helios NanoLab G3 UC的雙束掃描電鏡，在配置方面較為全面，包括場(chǎng)發(fā)射掃描電子束和離子束. 其中電子束部分配有elstar 電子槍，為Schottky熱量場(chǎng)發(fā)射器，燈絲壽命可用3年. 離子束為Tomahawk Ga離子槍，每支離子源壽命可使用1 000 h. 在圖像信號(hào)采集方面，掃描電子顯微成像配備多種探頭，適用于不同的樣品和工作模式：(1)Everhart-Thornley Detector(ETD)和Through Lens Detector(TLD)，可分別探測(cè)最高采集效率的二次電子(Secondary Electrons，SE)和背散射電子(Backscatter Electrons，BSE). (2)In Column Detector(ICD )可更高效率地探測(cè)BSE，適用于低電壓. (3)可伸縮的背散射電子探頭(DBS)，適用于高電壓、原子序數(shù)大的樣品. (4)可伸縮的STEM探頭，觀察透射樣品. (5)配合減速模式(Beam Deceleration，BD)使用的Mirror Detector(MD)探頭，位于物鏡鏡筒中. 離子束成像時(shí)也配備ETD、TLD和ICE(in Chamber Electron & ion detector)多個(gè)探頭. 另外，該儀器還配備有Pt氣體沉積源(GIS Injection)、放電中和(Charge Neutralizer)、等離子清洗(Plasma cleaner)和切片提取控制系統(tǒng)(Easylift)等. 除上述電鏡的基本配置外，該儀器同時(shí)還配備冷凍傳輸設(shè)備：英國(guó)Quorum PP3010T，如圖1(b)所示. 其包括電腦控制系統(tǒng)、液氮雪泥制備艙、樣品制備艙室、樣品傳輸桿、抽真空和氣流管路、電鏡艙室內(nèi)配套的冷凍樣品臺(tái)等，可實(shí)現(xiàn)樣品的快速冷凍、斷裂、升華、濺射鍍膜以及樣品傳輸?shù)纫幌盗袘?yīng)用. 該系統(tǒng)為帶有渦輪分子泵的高真空系統(tǒng)，樣品制備腔室的真空度可與掃描電鏡冷凍狀態(tài)下的高真空相匹配，有效避免電鏡艙室的污染.

圖1 帶冷凍系統(tǒng)的雙束掃描電鏡配置(a) 雙束掃描電鏡Thermo Fisher Scientific Helios Nano Lab G3 UC, (b) 冷凍傳輸系統(tǒng)Quorum PP3010T各部分組成Fig. 1 Dual beam (SEM/FIB) electron microscope with cryo-preparation system(a) dual beam (SEM/FIB) electron microscope Thermo Fisher Scientific Helios Nano Lab G3 UC, (b) component parts of cryo-preparation system Quorum PP3010T

2 儀器開放共享與成效

2. 1 儀器開放服務(wù)內(nèi)容與權(quán)限

本儀器目前面向校內(nèi)外用戶廣泛開放共享，開放測(cè)試服務(wù)的內(nèi)容包括：(1)實(shí)現(xiàn)生物樣品在大尺度范圍自動(dòng)化連續(xù)切片并掃描成像(Serial Block Face Imaging)[如圖2(a)所示]，實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞水平的高分辨率三維數(shù)據(jù)采集和重構(gòu)[7]. (2)與PP3010T冷凍傳輸系統(tǒng)配套使用，除可以實(shí)現(xiàn)生物、食品、材料等樣品原生態(tài)下表面或者斷面的精細(xì)形貌、結(jié)構(gòu)等[如圖2(b)所示]的觀察和分析外，更重要的是能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞、晶體等樣品在冷凍條件下原位切割減薄[如圖2(c)所示]，制備100～200 nm厚度的薄片(lamella)，以進(jìn)行高分辨冷凍透射電鏡數(shù)據(jù)的采集和分析[8-9]. (3)常溫生物樣品和其他材料表面精細(xì)形貌和超微結(jié)構(gòu)的觀察和分析，可實(shí)現(xiàn)樣品大尺度圖像的采集和拼接[如圖2(d)所示]，可實(shí)現(xiàn)與熒光顯微鏡(常溫和冷凍狀態(tài)成像)之間的有效關(guān)聯(lián).

圖2 帶冷凍系統(tǒng)的雙束掃描電鏡可實(shí)現(xiàn)的幾種功能(a) 常溫SEM/FIB，常溫包埋塊樣品自動(dòng)化連續(xù)切片并掃描成像的圖像代表，線蟲頭部?jī)?nèi)部結(jié)構(gòu), (b) 冷凍SEM，乳液樣品的冷凍掃描電鏡觀察, (c) 冷凍SEM/FIB，冷凍含水載網(wǎng)樣品的聚焦離子束減薄技術(shù)應(yīng)用，大圖是減薄后的冷凍掃描電鏡低倍成像，右上角是減薄后的冷凍聚焦離子束成像, (d) 常溫掃描電鏡圖像的大圖拼接(應(yīng)用Maps軟件 )Fig. 2 Several functions of dual beam (SEM/FIB) electron microscope with cryo-preparation system(a) SEM/FIB at room temperature. Serial block face imaging for the embedding resin block sample. The image is the section of C. elegans head. (b) cryo-SEM. The cryo-SEM imaging of the emulsion sample. (c) cryo SEM/FIB. The application of cryo-FIB milling for the vitrified sample on the grid. The large picture is cryo-SEM image at low magnification after milling, the inset is cryo-FIB image after milling. (d) montage of SEM images at room temperature (with Maps software)

在儀器的操作權(quán)限方面，實(shí)行分級(jí)設(shè)置：(1)普通用戶可在經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單培訓(xùn)之后，進(jìn)行樣品臺(tái)移動(dòng)、調(diào)焦、拍照等基本操作. (2)中級(jí)用戶可在普通用戶操作基礎(chǔ)上，進(jìn)行常溫狀態(tài)真空艙室的放氣、更換常溫樣品以及樣品臺(tái)的安裝等操作. (3)高級(jí)用戶可在中級(jí)用戶操作基礎(chǔ)上，進(jìn)行冷凍系統(tǒng)的準(zhǔn)備，冷凍樣品的裝載與傳輸，GIS Pt保護(hù)層噴鍍、離子束減薄相關(guān)操作.

對(duì)于有較多測(cè)試需求的用戶，我們一般推薦其經(jīng)過(guò)培訓(xùn)與考核兩個(gè)過(guò)程后，獲得對(duì)應(yīng)的操作權(quán)限等級(jí). 中級(jí)和高級(jí)用戶可在任意時(shí)間段自行預(yù)約機(jī)時(shí)，進(jìn)行常溫樣品的測(cè)試. 僅高級(jí)用戶可在任何時(shí)間段自行預(yù)約機(jī)時(shí)，進(jìn)行冷凍樣品相關(guān)的測(cè)試項(xiàng)目. 對(duì)于測(cè)試需求較少的用戶，可不必獲取操作權(quán)限等級(jí)，但無(wú)自主預(yù)約機(jī)時(shí)權(quán)限，需要提前同儀器管理員協(xié)商合適的測(cè)試時(shí)間，由管理員輔助進(jìn)行測(cè)試項(xiàng)目.

另外，由于本儀器在進(jìn)行離子束減薄應(yīng)用時(shí)，需耗費(fèi)較長(zhǎng)的機(jī)時(shí)，一般在正常的工作時(shí)段內(nèi)無(wú)法完成所有測(cè)試工作. 針對(duì)這種情況，除了培訓(xùn)常用用戶通過(guò)高級(jí)操作考核之外，我們還培訓(xùn)了具備高級(jí)操作權(quán)限的學(xué)生助管，可在非工作時(shí)段協(xié)助用戶，完成冷凍離子束減薄后的樣品傳輸與回收. 通過(guò)上述分級(jí)開放的管理形式[10]，既減少了儀器故障率，又延長(zhǎng)了儀器有效測(cè)試機(jī)時(shí)，從而有效提高了儀器的運(yùn)維效率[11-12]. 同時(shí)，分級(jí)開放實(shí)驗(yàn)的工作模式，也提高了學(xué)生的實(shí)踐能力[13]，進(jìn)一步加深學(xué)生對(duì)儀器工作原理的理解，為本儀器在科研應(yīng)用方面的拓展和功能開發(fā)奠定基礎(chǔ).

2. 2 儀器開放共享成效

隨著儀器測(cè)試服務(wù)項(xiàng)目的完善和開放共享的實(shí)行，有效使用機(jī)時(shí)基本逐年增加，共享服務(wù)范圍和比例呈現(xiàn)擴(kuò)大趨勢(shì). 以2017年和2018年清華大學(xué)冷凍雙束掃描電鏡的機(jī)時(shí)開放年時(shí)數(shù)為例[如圖3(a)所示]，2017年的有效使用機(jī)時(shí)為1 612 h，常溫SEM成像、常溫FIB應(yīng)用、冷凍SEM成像、冷凍FIB應(yīng)用4種不同的測(cè)試項(xiàng)目所占比例分別為9%、50%、20%、21%. 2018年的有效使用機(jī)時(shí)為3 073 h，上述比例分別為2%、21%、18%、59%. 與2017年相比，2018年的開放年時(shí)數(shù)提高近一倍. 2017年測(cè)試項(xiàng)目中，常溫FIB(常溫包埋塊樣品的連續(xù)切片并掃描成像)為該儀器的主要應(yīng)用功能，測(cè)試機(jī)時(shí)占50%. 而自2017年末起，儀器管理人員針對(duì)冷凍FIB(冷凍含水樣品的原位減薄)技術(shù)進(jìn)行了方法學(xué)開發(fā)與探索應(yīng)用，該測(cè)試項(xiàng)目在2018年和2019年總機(jī)時(shí)中占比分別為59%和72%，成為儀器的主要應(yīng)用功能. 與2018年相比，2019年的總機(jī)時(shí)略有下降，共約2 700 h，原因可能在于：其一，冷凍FIB機(jī)時(shí)占比提高， 冷凍FIB應(yīng)用每天均需要進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的回溫，以保持較好的真空狀態(tài)，該回溫過(guò)程未計(jì)入有效機(jī)時(shí). 其二，可連續(xù)工作的應(yīng)用項(xiàng)目—常溫FIB相對(duì)機(jī)時(shí)占比降低.

圖3 雙束掃描電鏡Helios的開放測(cè)試機(jī)時(shí)分析(a) 2017～2019年雙束掃描電鏡開放年時(shí)數(shù)對(duì)比,包括常溫SEM成像、常溫FIB應(yīng)用、冷凍SEM成像、冷凍FIB應(yīng)用4種不同的測(cè)試項(xiàng)目, (b) 2017～2019年雙束掃描電鏡開放比例,包括校內(nèi)測(cè)試機(jī)時(shí)和校外測(cè)試機(jī)時(shí)Fig. 3 Analysis of opening times for dual beam (SEM/FIB) electron microscope(a)the comparison of opening times for dual beam (SEM/FIB) electron microscope, within the years of 2017, 2018 and 2019, including SEM imaging at room temperature, FIB application at room temperature, cryo-SEM imaging, cryo-FIB application. (b) the opening percentage of dual beam (SEM/FIB) electron microscope, within the years of 2017, 2018 and 2019, including the internal and external opening times

本文討論的儀器測(cè)試用戶范圍從零基礎(chǔ)開始逐漸發(fā)展擴(kuò)大. 從圖3(b)可以看出，在2017年和2018年對(duì)外服務(wù)比例較低，校外測(cè)試機(jī)時(shí)比例分別為10%和3%，服務(wù)用戶范圍有限. 而到 2019年，校外測(cè)試機(jī)時(shí)比例有較大改變，比例提高至20%，并且測(cè)試用戶的范圍也有所擴(kuò)大. 目前校外測(cè)試用戶不僅包括北京地區(qū)的科研院所和高校，而且有較多來(lái)自其他地區(qū)科研單位的廣大用戶. 校外用戶的測(cè)試項(xiàng)目主要集中在冷凍SEM觀察(比如乳液等樣品的冷凍掃描電鏡分析)和常溫FIB應(yīng)用(常溫包埋塊樣品的連續(xù)切片并掃描成像)，其中冷凍SEM在2017、2018、2019年度校外測(cè)試機(jī)時(shí)中占比分別為62.8%、40.4%、57.6%，常溫FIB應(yīng)用在上述兩年年校外測(cè)試機(jī)時(shí)中占比分別為0%、27.7%、41.6%. 從上述數(shù)據(jù)中分析可以看出，常溫FIB應(yīng)用測(cè)試的機(jī)時(shí)比例穩(wěn)中有升，這在一定程度上反映出用戶對(duì)本儀器相關(guān)性能的認(rèn)可和儀器對(duì)外服務(wù)的功能拓展.

總之，該儀器開放成效顯著，測(cè)試應(yīng)用的全面化和共享服務(wù)的優(yōu)質(zhì)化，促使儀器影響范圍逐漸擴(kuò)大，開放效率逐步提高. 自開放共享以來(lái)，依托本文討論的儀器，支撐科研項(xiàng)目30余項(xiàng)，發(fā)表論文近20篇，涉及領(lǐng)域包括生物、食品、機(jī)械、航空航天、化學(xué)、材料等，論文刊登在包括Cell Research、PNAS、Angew Chem Int Ed、Food Hydrocolloids等影響力較大的期刊上.

3 儀器常見(jiàn)故障及解決方案

由于本臺(tái)雙束掃描電鏡組成較為復(fù)雜，包括掃描電子束、聚焦離子束部分(ThermoFisher Scientific 公司)以及冷凍傳輸系統(tǒng)(Quorum公司)，因此將對(duì)這三部分的常見(jiàn)故障及排除方法分別闡述.

3. 1 電子束及電鏡主體常見(jiàn)故障

3. 1. 1 電子束FEG場(chǎng)發(fā)射燈絲故障

本臺(tái)儀器配備的是場(chǎng)發(fā)射UC燈絲，一般具有3～5年壽命. 在平時(shí)的維護(hù)過(guò)程中，可通過(guò)觀察燈絲的發(fā)射電流值大致判斷其壽命是否到極限. UC燈絲發(fā)射電流值的正常范圍是80～150 μA，一旦接近壽命極限，該電流值會(huì)在一段時(shí)間內(nèi)逐漸變小，當(dāng)小于20 μA時(shí)，電子束將徹底無(wú)法成像. 因此，在檢查到燈絲發(fā)射電流值低于正常范圍并逐步減小時(shí)，應(yīng)及時(shí)聯(lián)系廠家維修工程師，提前安排燈絲的訂貨和更換事宜. 另外，UC燈絲的儲(chǔ)存條件要求比較高，到貨后須盡早安裝. 燈絲更換時(shí)，需要進(jìn)行烘烤，整個(gè)更換過(guò)程一般需要3天時(shí)間.

3. 1. 2 電子束物鏡極靴污染

本儀器配備的離子束進(jìn)行樣品加工時(shí)會(huì)產(chǎn)生碎屑等，同時(shí)冷凍傳輸系統(tǒng)的應(yīng)用也容易引入污染，因此電子束物鏡極靴被污染的概率較高. 一旦物鏡極靴被污染，導(dǎo)致后果最明顯的是掃描電子束成像時(shí)象散不穩(wěn)定，這將給連續(xù)切片并掃描成像過(guò)程的自動(dòng)化運(yùn)行帶來(lái)極大挑戰(zhàn)，這需要不定時(shí)地進(jìn)行象散的消除，以保證成像質(zhì)量. 在物鏡極靴污染較為嚴(yán)重，通過(guò)軟件或控制面板等無(wú)法實(shí)現(xiàn)象散的校正的情況將導(dǎo)致不能正常成像.

如果出現(xiàn)上述污染情況，需聯(lián)系廠家工程師對(duì)物鏡部分進(jìn)行清理. 在一般情況下，初次清理后效果較為明顯，可維持一段時(shí)間內(nèi)的掃描電子束成像效果穩(wěn)定. 如果污染非常嚴(yán)重，清理后成像效果改善不明顯，則需要更換電子束部分的物鏡，一般價(jià)格較為昂貴. 因此，在日常的使用和維護(hù)時(shí)，要格外注意避免污染的發(fā)生. 本文將在后續(xù)儀器的維護(hù)部分介紹相關(guān)注意事項(xiàng).

3. 1. 3 循環(huán)水系統(tǒng)故障

電鏡配備了冷卻循環(huán)水機(jī)(現(xiàn)在常用的是風(fēng)冷式)，一旦該機(jī)器出現(xiàn)故障，或者所處房間空調(diào)故障等，都有可能引起水溫異常(常見(jiàn)的是水溫升高)，某些型號(hào)的循環(huán)水機(jī)會(huì)自動(dòng)報(bào)警. 同時(shí)電鏡的電腦界面會(huì)提示“l(fā)ens off”等信息，電鏡將無(wú)法正常使用. 出現(xiàn)上述故障時(shí)，應(yīng)立即對(duì)電鏡真空艙室放氣，停止分子泵的運(yùn)轉(zhuǎn). 在排查時(shí)，一般需要首先檢查循環(huán)水機(jī)所處房間的空調(diào)制冷是否正常，再檢查循環(huán)水機(jī)的水位. 排除上述因素后，最簡(jiǎn)單的處理辦法是先嘗試關(guān)閉電源，待水溫自然下降后，再開啟機(jī)器進(jìn)行重置，觀察水溫能否下降，一般正常工作水溫在18～20 ℃范圍內(nèi). 另外，如果配備的是水冷式循環(huán)水機(jī)，則要注意觀察室外機(jī)是否有灰塵、飛絮等引起水循環(huán)回路堵塞的情況. 總之，循環(huán)水系統(tǒng)故障是電鏡維護(hù)過(guò)程中最常發(fā)生的故障之一，因此在日常的維護(hù)中需要定期做好故障隱患的排查.

3. 1. 4 電路板或其他元件故障

在掃描電子束成像部分的使用和維護(hù)過(guò)程中，還可能出現(xiàn)由于電路板或其他元件故障引起的報(bào)錯(cuò)[14]，一般更換對(duì)應(yīng)的部件后，即可排除故障. 比如本文介紹的儀器發(fā)生過(guò)以下幾種故障：電子束光闌位置感應(yīng)頭故障，導(dǎo)致無(wú)法更換電子束的束流. 成像探頭的高壓板故障，引起成像不正常. 真空系統(tǒng)故障，導(dǎo)致真空狀態(tài)不能維持，從而無(wú)法成像等.

3. 2 離子束部分常見(jiàn)故障

3. 2. 1 離子束無(wú)法維持長(zhǎng)時(shí)間加熱狀態(tài)

離子束的使用與維護(hù)中最需要注意的是離子束加熱維持時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題. 應(yīng)用聚焦離子束進(jìn)行常溫或冷凍含水樣品的加工減薄時(shí)，需要離子束維持較長(zhǎng)時(shí)間的加熱狀態(tài). 尤其是在常溫包埋塊樣品連續(xù)切片并掃描成像技術(shù)應(yīng)用的過(guò)程中，一旦離子束由于加熱時(shí)長(zhǎng)不足導(dǎo)致不能繼續(xù)工作，將無(wú)法保證切片數(shù)據(jù)的連續(xù)性.

如果在使用過(guò)程出現(xiàn)離子束加熱中斷的狀況，在排除真空系統(tǒng)故障和離子源使用壽命極限的因素后(一般每支離子源的使用壽命在1 000 h左右)，首先可嘗試直接加熱離子源(在UI界面點(diǎn)擊“Beam on”或者“wake up”). 如果不成功，則進(jìn)入service模式，在離子槍應(yīng)用控制系統(tǒng)中(I Gun)，先將離子源置為“IDLE”狀態(tài)，再進(jìn)行“HEAT”. 若仍不成功，則可嘗試對(duì)離子槍應(yīng)用控制系統(tǒng)進(jìn)行硬件重啟或者對(duì)電鏡系統(tǒng)進(jìn)行“standby”，重啟后再嘗試“HEAT”(此處需要注意的是，如果該故障發(fā)生在應(yīng)用Quorum PP3010T冷凍傳輸系統(tǒng)進(jìn)行樣品加工試驗(yàn)的過(guò)程中，則不能直接進(jìn)行standby，原因是冷凍條件下該系統(tǒng)冷臺(tái)無(wú)法進(jìn)行大幅度旋轉(zhuǎn)，而進(jìn)行電鏡standby后樣品臺(tái)需要進(jìn)行旋轉(zhuǎn)和平移以完成“home”過(guò)程). 假設(shè)上述方法均不成功，則需要聯(lián)系廠家維修工程師. 在相關(guān)的硬件更換方面，可能包括更換新的離子源、更換離子槍真空系統(tǒng)、更換離子槍控制柜、更換source end乃至整個(gè)離子槍部分.

3. 2. 2 電路板或其他元件故障

與電子槍部分類似，在離子槍的使用和維護(hù)過(guò)程中，也可能出現(xiàn)由于電路板或其他元件引起的故障，一般更換對(duì)應(yīng)部件后也可排除.

3. 3 冷凍傳輸系統(tǒng)常見(jiàn)故障

3. 3. 1 冷凍系統(tǒng)氣體管路結(jié)冰堵塞的問(wèn)題

對(duì)于帶冷凍傳輸系統(tǒng)的雙束掃描電鏡，氣體管路結(jié)冰后會(huì)導(dǎo)致氣流不暢、管路堵塞，冷臺(tái)和冷阱的溫度將由于氣流不足而持續(xù)上升. 目前Quorum的PP3010T冷凍傳輸系統(tǒng)、Thermo Fisher Scientific 的Aquilos冷凍雙束掃描電鏡系統(tǒng)均可能出現(xiàn)如上問(wèn)題. 尤其是在多雨季節(jié)，環(huán)境空氣濕度較大，冷凍系統(tǒng)在使用過(guò)程中出現(xiàn)氣流管路結(jié)冰堵塞的情況較為頻繁. 另外，由于所需要的氮?dú)饬枯^大，而在國(guó)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室一般沒(méi)有配備專門的供氣管道，用于提供氮?dú)鈿饬鞯氖亲栽鰤菏揭旱?或中壓液氮罐)，因此當(dāng)液氮中的含水量較高時(shí)更容易出現(xiàn)管路結(jié)冰的情況. 值得注意的是，一旦出現(xiàn)如上問(wèn)題，將無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行冷凍樣品的加工減薄和觀察實(shí)驗(yàn)，必須立即回收樣品，避免因升溫過(guò)高導(dǎo)致樣品損毀.

為了盡可能避免在使用過(guò)程中出現(xiàn)氣流管路堵塞的問(wèn)題，一方面盡量選擇含水量低的液氮供應(yīng)廠家，另一方面可在自增壓液氮罐出氣口的后方連接干燥裝置，進(jìn)一步降低氮?dú)庵械暮? 再有，在外界環(huán)境濕度大時(shí)加開除濕裝置，可有效控制環(huán)境的濕度.

3. 3. 2 冷臺(tái)溫度不足的問(wèn)題

應(yīng)用聚焦離子束對(duì)冷凍含水的生物樣品(細(xì)胞、組織等)進(jìn)行減薄加工，原位制備100～200 nm的冷凍超薄切片是帶冷凍傳輸系統(tǒng)雙束掃描電鏡最為重要的功能應(yīng)用之一. 而要制備加工理想的冷凍超薄切片，最為重要的因素是保證所處冷臺(tái)的溫度足夠低，并且樣品夾載梭與冷臺(tái)的接觸良好、導(dǎo)溫效果佳，從而保證樣品在加工過(guò)程中維持足夠低的溫度. 一般而言，冷凍系統(tǒng)所帶的溫度傳感器位于冷臺(tái)位置，而樣品夾載梭與冷臺(tái)是通過(guò)緊密接觸進(jìn)行溫度傳導(dǎo)的. 因此，溫度傳感器的顯示值并不代表樣品在電鏡艙室內(nèi)的真實(shí)維持溫度. 在儀器維護(hù)時(shí)需要定期檢查樣品夾載梭和冷臺(tái)之間的接觸性，并用測(cè)溫臺(tái)監(jiān)測(cè)樣品夾載梭的實(shí)際溫度. 對(duì)于本文討論的儀器，經(jīng)過(guò)測(cè)試發(fā)現(xiàn)在最大氣流下，降溫40 min后，樣品夾載梭上的真實(shí)溫度能夠達(dá)到最低，約-160 ℃左右. 假設(shè)樣品維持溫度不足，隨著在電鏡艙室內(nèi)停留時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品會(huì)出現(xiàn)不同程度的脫水現(xiàn)象，在加工過(guò)程中可能會(huì)觀察到樣品薄片彎折現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)可以看到失水后細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間的空隙.

3. 3. 3 其他硬件故障

其他可能出現(xiàn)的故障包括：真空泵故障、管路漏氣、電鏡艙室與冷凍系統(tǒng)樣品制備艙室之間的連通閥門故障等.

4 儀器維護(hù)的注意事項(xiàng)

在雙束掃描電鏡的維護(hù)方面，主要包括以下幾個(gè)方面：(1)定期添加循環(huán)水(專門的補(bǔ)充液或者超純水等)，保證循環(huán)水的液位. (2)電鏡艙室放氣破真空時(shí)，通入高純氮?dú)?，避免雜質(zhì)的引入. (3)保持儀器房間的潔凈，定期清理電鏡艙室，可用無(wú)紡布蘸取少量酒精擦拭艙室內(nèi)部，也可用電鏡配備的等離子清洗儀(plasma cleaner)對(duì)艙室內(nèi)部或樣品進(jìn)行清潔. (4)嚴(yán)格把控送入電鏡艙室內(nèi)的樣品特性，保證樣品無(wú)磁性、無(wú)毒性、無(wú)揮發(fā)性，盡量避免觀察含油的樣品，常溫樣品要保證必須經(jīng)過(guò)干燥處理，并且在進(jìn)入電鏡艙室前用氣體噴槍反復(fù)吹掃確保潔凈. (5)定期進(jìn)行電子束和離子束的合軸. (6)離子源、拔出極、抑制極、離子束光闌、GIS Pt源都屬于耗材，需定期更換，離子源的使用壽命為1 000 h左右，每個(gè)離子源更換的同時(shí)需更換拔出極，每更換2～3個(gè)離子源需要更換一次離子束光闌(根據(jù)具體使用情況而定)，每更換3個(gè)離子源需更換一次抑制極，Pt源使用壽命為100 h，消耗較為緩慢，一般可使用5年以上.

在冷凍傳輸系統(tǒng)的維護(hù)方面，需要對(duì)樣品傳輸桿進(jìn)行定期的保養(yǎng)，對(duì)各種樣品梭進(jìn)行清洗. 樣品制備艙室的導(dǎo)電層濺射靶材也屬于耗材，但一般消耗較慢. 進(jìn)行冷凍樣品的斷裂時(shí)，在樣品制備艙室內(nèi)會(huì)積累斷裂下來(lái)的雜質(zhì)，為避免樣品傳輸時(shí)將雜質(zhì)帶入電鏡艙室污染物鏡，也需定期對(duì)樣品制備艙室進(jìn)行清理.

如果提前接到停電通知，在儀器配有UPS不間斷電源的前提下，將冷凍傳輸系統(tǒng)關(guān)機(jī)，并將電鏡艙室放氣以停掉分子泵，將電鏡轉(zhuǎn)入standby狀態(tài)，控制電腦關(guān)機(jī). 來(lái)電后，先將循環(huán)水、空調(diào)依次開啟后，再將電鏡開機(jī)即可. 另外，為保證電鏡系統(tǒng)的運(yùn)行流暢，日常維護(hù)時(shí)每間隔半個(gè)月可進(jìn)行一次電鏡的standby和重啟，以及控制電腦的重啟.

5 結(jié)語(yǔ)

帶冷凍系統(tǒng)的雙束掃描電鏡是目前科研工作中非常重要的大型精密儀器，儀器實(shí)現(xiàn)科學(xué)管理水平將直接影響科研的進(jìn)度和發(fā)展水平[15-16]，這既包括日常維護(hù)與故障排除，也包括儀器的開放共享效率. 本文以Thermo Fisher Scientific 公司的Helios NanoLab G3 UC為例，重點(diǎn)介紹了儀器的開放預(yù)約與共享成效、故障排除與日常維護(hù)等方面的內(nèi)容，為同類型儀器的高效有序管理提供參考，從而保障相關(guān)科研工作的順利進(jìn)行.