降香黃檀與東京黃檀木材解剖特征及抽提物化學成分的可區(qū)別性*

劉 衡 施福軍 黎韋水 韋中綿 馬若克 劉志高李英健 符韻林

(1.廣西大學林學院 南寧 530004； 2.南寧樹木園 南寧 530031)

降香黃檀(Dalbergiaodorifera)俗稱海南黃花梨，是我國明清家具主要用材，同時其心材還是一味名貴中藥(Zhengetal., 2011; Wangetal., 2000; Beldjoudietal., 2003; Zhangetal., 2004; Choietal., 2009)。東京黃檀(Dalbergiatonkinensis)木材自20世紀90年代從越南進口，由于其材質(zhì)、結(jié)構(gòu)、氣味等與降香黃檀非常相近，于是市場上將來自于海南的降香黃檀木材稱海南黃花梨，把來自越南的東京黃檀木材稱為越南黃花梨。起初人們認為越南黃花梨與海南黃花梨有區(qū)別，提出了多種區(qū)分海南黃花梨和越南黃花梨的方法、經(jīng)驗，如認為海南黃花梨“鬼臉”豐富、顏色較深、降香氣味更濃郁，而越南黃花梨“鬼臉”較少、顏色較淺、降香氣味較淡等(黃華等, 2004; 嚴恪, 2015)； 部分專家也認為二者在木射線等木材解剖構(gòu)造上有差異(李桂蘭等, 2008; 羅真付等, 2012)。但以上觀點未見進一步的研究佐證。

2012年，在法國、越南發(fā)現(xiàn)越南黃花梨的樹木標本，學名為“東京黃檀”，也稱“越南黃檀”，其拉丁學名與降香黃檀完全不同，屬于不同樹種(李英健, 2012; 張耀麗, 2012)。即使已發(fā)現(xiàn)降香黃檀與東京黃檀的樹木模式標本，二者拉丁學名不同，但是二者在木材材色、氣味、結(jié)構(gòu)、密度等均非常相似，是否為一種木材仍在爭論(鄧雪松, 2014)。木材商、生產(chǎn)商及市場上有2種觀點：一是認為其為同一樹種木材，另一方認為其為不同樹種木材。植物學及木材學專家亦有不同觀點：從木材構(gòu)造及解剖特征來看，一是認為二者有區(qū)別，但總結(jié)不出區(qū)別明顯的具有重復性檢驗的特征(李桂蘭等, 2008; 羅真付等, 2012)，另一認為其差異不明顯(黃向黨等, 2018)； 從木材化學成分來看，雖然楊柳等(2016)、張禮行等(2018)以及侯思潤等(2018)均通過比較降香黃檀和東京黃檀抽提物化學成分的差異準確鑒別出2種木材，但楊柳等(2016)在東京黃檀中檢測到張禮行等(2018)認為不存在的化合物環(huán)氧化蛇麻烯，同時，這些研究所用樣品均取自家具及工藝品，樣品的產(chǎn)地未知，所以并不能排除生長環(huán)境對木材化學成分的影響； 從DNA條形碼來看，也有不同觀點，汪奕衡等(2015)通過測定分析降香黃檀和東京黃檀的ITS序列，認為二者應屬于同一物種，而Yu等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體trnH-psbA存在7個穩(wěn)定的差異位點，可以將降香黃檀和東京黃檀區(qū)分開來。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

降香黃檀和東京黃檀的樹木形態(tài)研究及木材樣品采集在中國海南、廣西及越南等地進行，均為成熟林木。具體產(chǎn)地信息見表1。

1.2 儀器和試劑

儀器設備：切片機(Thermo Scientific公司，HM430型)； 熒光顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)有限公司，BA400EF-UPR9100型)； 恒溫水浴鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠，HHS型)； 萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司，DFT-200型)； 萬分之一天平(奧克斯儀器有限公司，MS 105DU型)； 真空干燥箱(上海丙林電子科技有限公司，DZF-6050-T型)； 篩網(wǎng)(40目、60目)、索氏提取器(上海歐蒙實業(yè)有限公司，OM-6A型)； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(南寧藍天實驗設備有限公司，N-1200B型)； 氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國布魯克公司，SCION TQ型)； 超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司，UPLCI-CLASS-XEVOG2-XSQTOF型)。試劑：無水乙醇(AR)，超純水(自制，成都越純科技有限公司)，番紅(AR)，中性樹膠(AR)，TO透明液，苯(AR)，甲醇(Optim，美國fisher公司)。

1.3 樣品處理

在木材正常生長輪部位截取10 mm(長)×10 mm(寬)×20 mm(高)的木塊，用于木材切片。

采集10 g左右樣品，粉碎后過40、60目篩，收集40～60目木粉，然后置于真空干燥箱(60 ℃，0.1 MPa)中干燥24 h，得到干燥后的樣品。

1.4 木材微觀構(gòu)造特征觀察

木材玻片制作流程與工藝參考李桂蘭等(2008)的研究。采用熒光顯微鏡拍攝木材微觀圖片，其中，切片橫切面放大5倍，徑切面和弦切面放大40倍。隨機拍攝30張完整清晰弦切面切片照片用于統(tǒng)計木射線種類和高度。

1.5 木材抽提物的提取

木材抽提物的提取依據(jù)GB/T2677.6—1994《造紙原料有機溶劑抽出物含量的測定》的相關(guān)規(guī)定進行。抽提液經(jīng)過濾后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干溶劑，然后加入甲醇溶解，在10 mL容量瓶中定容，稀釋相應倍數(shù)后過0.22 μm濾膜，用于1.6、1.7檢測。

1.6 氣質(zhì)聯(lián)用測定抽提物成分

氣相色譜主要用來檢測可揮發(fā)性化合物。氣相色譜表征條件：HP-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)； 載氣為He； 不分流進樣； 流速為1.0 mL·min-1； 進樣量為1.0 μL。程序升溫：柱溫50 ℃，保留3 min，以20 ℃·min-1升至280 ℃，保留2 min。質(zhì)譜條件：電離方式EI； 電離能量70 eV； 離子源溫度230 ℃； 溶劑延遲3 min； 掃描范圍5～500 amu。NIST17譜庫檢索。試驗重復3次。采用SPSS23軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.7 超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定抽提物成分

超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀主要用來檢測黃酮類化合物。色譜條件：色譜柱 Waters UPLC C18 柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)； 流動相A 為 0.1%甲酸水，B為乙腈(100%)； 梯度洗脫，90%～80%A、0～1 min，80%～70%A、1～3 min，70%～55%A、3～7 min，55%～30%A、7～12 min，30%～10%A、12～15 min，10%～90%A、15.1～16 min； 流速0.4 mL·min-1； 柱溫40 ℃； 進樣量0.2 μL。質(zhì)譜條件：ESI離子源； 正離子模式； 掃描模SEM，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500； 質(zhì)量校正質(zhì)核比m/z556.277 1。試驗重復3次。采用Markerlynx4.1軟件進行數(shù)據(jù)處理。

The authors declare no competing financial interests.

2 結(jié)果與分析

2.1 樹木形態(tài)分析

降香黃檀與東京黃檀的樹木形態(tài)對比分析如圖1、表2所示。

圖1 降香黃檀(A)和東京黃檀(B)植物形態(tài)Fig. 1 Dalbergia odorifera (A) and D. tonkinensis (B) plant morphology

表2 降香黃檀和東京黃檀樹木形態(tài)特征比較Tab.2 Morphological differences between Dalbergia odorifera and D. tonkinensis

2.2 木材構(gòu)造分析

2種木材的構(gòu)造特征如圖2、表3所示。

表3 木材主要構(gòu)造差異Tab.3 Main structural differences in wood

降香黃檀：具有深褐色條紋。散孔材至半環(huán)孔材，單管孔，少數(shù)徑列復管孔(2～5個)。軸向薄壁組織豐富，環(huán)管狀、翼狀、聚翼狀、帶狀(寬3～6個細胞)。木纖維、導管、軸向薄壁組織、木射線均疊生。木射線單列射線較少，多列射線2～4個細胞； 射線組織同形單列、多列(2～4細胞)，極少數(shù)異形Ⅱ型和異形Ⅲ型。波痕可見。具有濃郁辛辣氣味。

東京黃檀：偶見深褐色條紋。散孔材至半環(huán)孔材，單管孔, 少數(shù)徑列復管孔(2～3個)。軸向薄壁組織豐富，環(huán)管狀、翼狀、聚翼狀、帶狀(寬2～6個細胞)。木纖維、導管、軸向薄壁組織、木射線均疊生。木射線單列射線較少，多列射線2～4個細胞； 射線組織同形單列、多列(2～4細胞)，極少數(shù)異形Ⅱ型和異形Ⅲ型。波痕可見。具有濃郁辛辣氣味。

對降香黃檀和東京黃檀的木射線差異已有較多報道，本研究發(fā)現(xiàn)，二者心材木射線均為疊生，同形單列、多列(2～4細胞)，極少數(shù)異形Ⅱ型、Ⅲ型； 單列射線約占24%～30%，2列射線約占62%～75%，3列及3列以上射線約占1%～4%，并不存在明顯差異。圖3可以進一步比較二者木射線的差異。從圖3A可以看出，無論是降香黃檀還是東京黃檀，木射線類型均以2列木射線為主，單列木射線次之，3列及3列以上木射線較少，只有降香黃檀H3的3列及3列以上木射線平均值超過5%，這可能是生長環(huán)境導致的。同時，通過圖3A可以發(fā)現(xiàn)，降香黃檀和東京黃檀無論是單列木射線、2列木射線還是3列及3列以上木射線，差異微小。從圖3B可以看出，降香黃檀和東京黃檀中同形射線組織百分比均在95%以上，異形Ⅱ型射線組織在0～1.99%之間，對于異形Ⅲ型射線組織，東京黃檀心材(1.6%～2.31%)略多于降香黃檀心材(0.04%～1%)。

圖3 木射線類型比較Fig. 3 Comparison of wood ray typesSW: 邊材; TW: 過渡材; HW: 心材。SW: Sapwood; TW: Transition wood; HW: Heartwood.

2.3 抽提物GC-MS分析

通過計算機NIST譜庫檢索，從降香黃檀和東京黃檀抽提物中共鑒定出相對百分含量大于0.1%的化學成分31種(表4、表5)，其中，降香黃檀心材共檢出25種，東京黃檀心材25種，降香黃檀過渡材25種，東京黃檀過渡材26種，降香黃檀邊材22種，東京黃檀邊材22種。降香黃檀樣品心材含量最高的組分均為反式橙花叔醇(23.13%、20.76%、19.68%)，與之前的研究結(jié)果(郭清泉等, 2008)一致； 東京黃檀樣品心材含量最高分別為美迪紫檀素(Y1，20.11%)、3,4-二甲氧基苯乙烯(Y2，13.49%)和刺芒柄花素(Y3，16.96%)，同時，反式橙花叔醇含量也處于較高的水平(12.59%、9.27%、4.396%)。降香黃檀過渡材含量最高的組分也為反式橙花叔醇(49.04%、18.5%、22.14%)； 東京黃檀樣品過渡材含量最高分別為喬松素(Y1，23.637%)、3,4-二甲氧基苯乙烯(Y2，16.97%； Y3，21.17%)。降香黃檀邊材含量最高的組分分別為磷酸三丁酯(H1，74.63%； H2，17.56%)、紅沒藥醇(H3，9.186%)； 東京黃檀樣品邊材含量最高分別為鄰苯二甲酸丁基酯2-乙基己基酯(Y1，23.637%)、棕櫚酸(Y2，29.82%)、硬脂酸(Y3，34.30%)。

表4 各譜峰化學成分的確認Tab.4 Identification of compounds of each chromatographic peak

表5 各樣品抽提物成分的百分含量測定結(jié)果①Tab.5 The composition of each wood extraction %

運用SPSS軟件以31種化合物含量為分析變量，采用平方Euclidean distance計算準則，進行聚類分析，樣品距離越近說明它們相似度越高(毛運芝等, 2019)。如圖4所示，當類間距離di=5時，6個心材樣品可分為4類：第1類包括H2和H3，第2類包括Y2和Y3，第3類為Y1，H1聚為第4類。由此可知，H2和H3以及Y2和Y3的較為相似，H1與其他5個樣品相似度最低。結(jié)合木材產(chǎn)地進行分析，發(fā)現(xiàn)H2和H3的緯度相近，Y2和Y3緯度相近，這可能是它們聚為一類的原因，推測木材化學成分的差異與產(chǎn)地緯度密切相關(guān)，即使同種樹種在不同緯度其化學成分也存在較大差異。6個過渡材樣品可分為5類，6個邊材樣品也可分為5類，但過渡材和邊材的聚類沒有明顯的規(guī)律，這可能是因為木材抽提物開始產(chǎn)生時不存在規(guī)律，在抽提物不斷累積過程中受產(chǎn)地的影響，木材的化學成分逐漸產(chǎn)生較大差異。

圖4 降香黃檀和東京黃檀木材抽提物化學組分的聚類分析Fig. 4 Cluster analysis of chemical compositions in D. odorifera and D. tonkinensis wood extractsa: 邊材; b: 過渡材; c: 心材。a: Sapwood; b: Transition wood; c: Heartwood.

2.4 抽提物HPLC-TOF-MS分析

因GC-MS對高沸點、揮發(fā)性差、高分子量的化合物難以檢測，為更全面地分析降香黃檀和東京黃檀抽提物的差異，本研究采用HPLC-TOF-MS對抽提物進一步分析。

直觀對比降香黃檀和東京黃檀心材、過渡區(qū)和邊材的總離子流圖(圖5、圖6、圖7)發(fā)現(xiàn)，降香黃檀和東京黃檀樣品的出峰時間和峰形上基本一致，說明它們的化合物成分相似，同時，種間和種內(nèi)均存在一些差異，差異不具有明顯的規(guī)律性，不能夠有效區(qū)分2種木材。因此采用無監(jiān)督的主成分(PCA)分析法進一步分析數(shù)據(jù)。PCA分析能夠反映數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，可以直觀地表達出不同樣品的整體差異性(Maetal., 2015)，通過MarkerLynx XS得到2種木材抽提物的PCA得分圖(圖8)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論在邊材、過渡材還是心材抽提物PCA模型中，降香黃檀和東京黃檀均不能較好地分組，有明顯的交集，尤其心材樣品間的空間距離更為相近，這說明二者不能較好地區(qū)分，與GC-MS的分析結(jié)果一致。

圖5 邊材抽提物超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀總離子流Fig. 5 HPLC-TOF-MS total ion chromatogram of sapwood extraction

圖6 過渡材抽提物超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀總離子流Fig. 6 HPLC-TOF-MS total ion chromatogram of transition wood extraction

圖7 心材抽提物超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀總離子流Fig. 7 HPLC-TOF-MS total ion chromatogram of heartwood extraction

3 討論

從樹木形態(tài)分析可以發(fā)現(xiàn)，降香黃檀和東京黃檀在花、果、葉的形態(tài)特征上相似，不具有明顯的可區(qū)分性。

從木材構(gòu)造分析，二者木材構(gòu)造相似，但在顏色和管孔、木射線方面存在一些微小差異。在紋理方面，降香黃檀樣品均具有深褐色條紋，而東京黃檀僅有樣品Y2具有深褐色條紋，這可能是降香黃檀“鬼臉”多于東京黃檀的原因； 在管孔類型方面，相較于東京黃檀，降香黃檀的半環(huán)孔材趨勢更明顯； 在木射線方面，降香黃檀和東京黃檀木材的單列木射線、2列木射線、3列及3列以上木射線、同形射線組織及異形Ⅱ型射線組織百分比均在相同區(qū)間內(nèi)，僅異形Ⅲ型射線組織占比東京黃檀心材(1.6%～2.31%)略多于降香黃檀心材(0.04%～1%)。綜上，降香黃檀和東京黃檀木材構(gòu)造雖然存在一些差異，但這些差異過于微小，不具有明顯的可區(qū)分性。

從抽提物化學成分分析：1)從GC-MS的測定結(jié)果來看，雖然降香黃檀和東京黃檀含量最高的組分存在顯著差異，但降香黃檀含量最高的組分在東京黃檀中也存在且其含量可能還高于某個降香黃檀樣品； 同時，這種差異不僅存在于2種木材之間，不同產(chǎn)地的同種木材也存在顯著差異。利用SPSS對數(shù)據(jù)進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地降香黃檀和東京黃檀木材邊材、過渡材抽提物聚類沒有明顯規(guī)律，緯度相近的木材心材抽提物聚為一類，與樹種關(guān)系不明顯。2)從HPLC-TOF-MS的測定結(jié)果來看，降香黃檀和東京黃檀木材抽提物總離子流圖基本一致； 在PCA模型中，降香黃檀和東京黃檀木材分組有明顯的交集。因此，根據(jù)木材抽提物化學成分不能區(qū)別降香黃檀和東京黃檀木材。

4 結(jié)論

本文通過比較分析降香黃檀和東京黃檀的樹木形態(tài)、木材構(gòu)造以及化學成分的異同，探究二者的可區(qū)分性。結(jié)果表明：在樹木形態(tài)上，降香黃檀與東京黃檀的花、果、葉形態(tài)近乎一致； 在木材構(gòu)造上，相較于東京黃檀，降香黃檀紋理略豐富，管孔類型更趨近于半環(huán)孔材，心材具有略少的異形Ⅲ型木射線組織，但這些差異難以量化，并不能很好地區(qū)別二者，同時，其他構(gòu)造特征不存在可區(qū)別性； 在化學成分上，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，相同緯度的木材聚為一類，與樹種無關(guān)，通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，二者的分組存在明顯交集，不存在可區(qū)別性。綜上認為，降香黃檀和東京黃檀的樹木形態(tài)、木材解剖特征和抽提物化學成分方面不存在明顯的可區(qū)別性。至于降香黃檀和東京黃檀是否同種木材，仍需進一步研究確認。