日本血吸蟲平衡型核苷轉運蛋白3基因(SjENT3)的RNA干擾研究

吳洛濱，任雨琪，秦芳林，劉金明，金亞美

(1.上海師范大學 生命科學學院, 上海 200234; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院 上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點實驗室, 上海 200241)

血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的一種僅次于瘧疾的常見熱帶寄生蟲病，常發(fā)于中東，南美和東南亞部分地區(qū)，尤其是在撒哈拉以南的非洲地區(qū)發(fā)病率很高[1]；據(jù)保守估計，至2018年全世界仍至少有2.3億人感染血吸蟲[2].目前治療血吸蟲病主要是應用化學藥品，如使用吡喹酮對感染血吸蟲病的個體進行治療，可取得良好的治療效果[3]，但化學藥物治療不能預防再次感染，且化療藥物的大量廣泛使用可能導致耐藥性蟲株的出現(xiàn)[4].

血吸蟲蟲體線性，雌雄異體，雌蟲所產(chǎn)大量蟲卵不僅會造成宿主嚴重的病理損害，排出體外也會造成疾病的再傳播[5].在血吸蟲的正常發(fā)育過程中，雌蟲的生殖發(fā)育需要與雄蟲的持續(xù)合抱，來自雄蟲的刺激對雌蟲的發(fā)育與保持雌蟲的繁殖能力必不可少.單性感染的雌蟲處于生殖系統(tǒng)不完善的發(fā)育阻遏狀態(tài)，兩性感染的合抱雌蟲一旦與雄蟲分開，也會出現(xiàn)個體逐漸變小，生殖器官退化等現(xiàn)象.血吸蟲雄蟲通過一種非精子傳遞的方式調(diào)控著雌蟲的生長發(fā)育，但其影響雌蟲生長發(fā)育的具體機理尚不清楚[6].

實驗室前期對單性感染和兩性感染雄蟲的蛋白質組比較研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲平衡型核苷轉運蛋白3(SjENT3)在18，21，23，25d 4個檢測時間點合抱雄蟲體內(nèi)的表達皆高于其在單性感染雄蟲體內(nèi)的表達，推測該蛋白可能會與血吸蟲雌雄合抱，雌雄蟲間信息傳遞有關，并進而影響血吸蟲雌蟲的生長生殖發(fā)育.

平衡型核苷轉運蛋白(Equilibrative Nucleoside Transporters, ENTs)是一類存在于大多數(shù)真核生物細胞中的膜蛋白，能夠介導核苷、核堿基和其他核苷類似物的轉運[7].ENTs通過跨膜轉運核苷參與和調(diào)節(jié)著生物體內(nèi)諸多生理、生化反應，例如能量代謝、信號轉導、神經(jīng)發(fā)育、細胞和組織發(fā)育等[8]；其傳遞核苷類似物穿透生物膜的功能對于許多用于抗癌和抗病毒的核苷類似藥物的跨膜轉運起著重要作用[9].ENTs家族包含ENT1，ENT2，ENT3和ENT4 4個成員[10-11].ENT3蛋白含有一個相對較長的親水N-端區(qū)域，其在酸性條件下(pH5.5～6.5)具有最大的轉運活性[12].ENT3蛋白除廣泛存在于人體器官外，還存在于人體的核內(nèi)質溶酶體系統(tǒng).Hyde等[13]和Baldwin等[14]發(fā)現(xiàn)ENT3蛋白能夠有效轉運嘧啶和嘌呤類核苷以及抗癌類藥物，其介導的抗癌和抗病毒的核苷類似藥物穿線粒體膜的轉運可能與核苷藥物的線粒體毒性有著密切聯(lián)系.

為了研究SjENT3在血吸蟲生長發(fā)育中的作用，我們利用qRT-PCR技術分析了其在血吸蟲生長發(fā)育的不同時間、血吸蟲雌雄蟲體內(nèi)以及單性感染雄蟲與兩性感染合抱雄蟲體內(nèi)的轉錄水平，并通過RNA干擾技術敲降SjENT3基因的轉錄，分析其轉錄水平下降對血吸蟲生長發(fā)育及生殖能力的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

Hieff qPCR SYBR Green Master Mix, Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自上海翊圣生物科技有限公司；TRIzol reagent購自上海英濰捷基生物公司；siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；qRT-PCR引物由上海擎科生物科技有限公司合成.

1.1.2 生物材料

日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供.通過將陽性釘螺暴露在光下可以獲得具有活力的尾蚴.雄性BALB/c小鼠(n=70；年齡: 4～6周)采購于上海杰思捷實驗動物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 蟲體的收集

BABL/c小鼠以腹部貼片法感染日本血吸蟲[15]，分別在感染后7，14，18，21，25，28，35，42d剖殺，以肝門靜脈灌注法收集蟲體；將感染后18，21，25，28，35，42天的部分合抱雌雄蟲人為分離，分別收集雌蟲與雄蟲蟲體；使用雄性尾蚴感染小鼠，收集18，21，23，25天單性感染雄蟲蟲體.所收集蟲體均用磷酸鹽緩沖液(PBS, pH7.4；137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 10mmol/L Na2HPO4, 2mmol/L KH2PO4)洗滌3次，除去殘留宿主碎片后凍存于液氮中備用.

1.2.2 SjENT3蛋白的氨基酸序列分析

利用ProtParam工具計算SjENT3蛋白質(TNN11866.1)的理論分子量、等電點以及氨基酸組成.利用SignalP3.0分析蛋白質有無信號肽；利用TMHMM服務器分析蛋白有無跨膜結構；通過BLAST搜索到SjENT3在小鼠以及人類體內(nèi)的同源蛋白質序列(Mouse，NP_076085.1；Humans，NP_060814.4)，通過DNAMAN軟件對其進行同源性分析.

1.2.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用TRIzol從收集的日本血吸蟲中提取總RNA，然后使用PrimeScript RT試劑盒反轉錄為cDNA.根據(jù)SjENT3的基因序列(AY814163.1)，利用NCBI Primer BLAST設計引物(正向)5’-CACCGACTGATGGTTGGTACA-3’和(反向)5’-AGCAGCGTTCTTTACCACTTG-3’；對所得的cDNA進行qRT-PCR分析，擴增產(chǎn)物的大小為80bp；使用NADPH基因作為內(nèi)源性對照，引物(正向)5’-CGAGGACCTAACAGCAGAGG-3’和(反向)5’-TCCGAACGAACTTTGAGACC-3’，擴增產(chǎn)物的大小為174bp；使用ABI PRISM 7500實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)采用熒光染料法進行熒光定量PCR，每個反應均做3孔重復，使用ABI 7500 V2.0.5軟件分析結果，用2-ΔΔCt法計算基因相對表達情況.

1.2.4 RNA干擾

上海吉瑪基因有限公司(中國上海)設計并化學合成了針對SjENT3基因不同區(qū)域的3種特異性siRNA(S1，S2，S3)和對照siRNA(NC)(表1).小鼠經(jīng)腹部皮膚感染大約200條日本血吸蟲尾蚴，并分為5組(每組兩只).感染后第22天時通過尾靜脈給小鼠注射siRNA(S1，S2，S3和NC)，每次注射2.5nmol siRNA(凍干狀態(tài)的siRNA先用125μL DEPC水溶解)，同時設置PBS(pH7.4)對照，48h后收集蟲體，提取蟲體RNA并反轉錄為cDNA后，利用qRT-PCR評估S1，S2，S3的干擾效果.

表1 SjENT3基因siRNA序列

12只BABL/c小鼠，平均分為3組，每組4只小鼠.于感染后第4天，選擇S1，S2，S3中干擾效果最佳的siRNA，每組小鼠尾靜脈分別注射該siRNA、PBS、NC，每4d干擾一次，共干擾10次，42d后剖殺收集蟲體并計數(shù)，qRT-PCR檢測干擾效果.

1.2.5 肝組織蟲卵計數(shù)

收集肝臟并稱重，加入PBS(pH7.4)，用勻漿機混勻后，定容至20mL，取1mL肝臟勻漿液，加入等體積10%(密度)NaOH，37℃水浴鍋中消化30min，消化完全后混勻取3份50μL樣品，鏡檢計數(shù)蟲卵，計算成蟲數(shù)和每克肝臟荷卵數(shù)及它們對應的減少率.每克肝臟荷卵數(shù)減少率=(對照組每克肝臟荷卵數(shù)-處理組每克肝臟荷卵數(shù))/對照組每克肝臟荷卵數(shù)×100%；每雌蟲肝臟荷卵數(shù)=肝臟荷卵數(shù)/雌蟲數(shù)；每雌蟲肝臟荷卵數(shù)減少率=(對照組每雌蟲肝臟荷卵數(shù)-處理組每雌蟲肝臟荷卵數(shù))/對照組每雌蟲肝臟荷卵數(shù)×100%.

1.2.6 蟲卵孵化

取4mL肝臟勻漿液于細頸平底燒瓶中，加入去氯水，并用一薄層棉花覆蓋在液面下5cm處，26℃孵化6h后收集棉花上層清液，轉移至15mL離心管中，加入50μL碘酊染液固定毛蚴，4000×g離心5min，吸去上清，定容至2mL，混勻取3份50μL樣品，鏡檢計數(shù)尾蚴，計算孵化率和孵化率減少率.孵化率=總毛蚴數(shù)/總蟲卵數(shù)；孵化率減少率=(對照組孵化率-處理組孵化率)/對照組孵化率×100%.

1.2.7 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差(SD).所有統(tǒng)計分析經(jīng)過t-test檢驗.P≤0.05被認為具有統(tǒng)計學意義.

2 結 果

2.1 SjENT3蛋白氨基酸序列分析

SjENT3蛋白的理論分子量為63.3kDa，等電點為8.60，具有信號肽與10個跨膜結構域，將SjENT3蛋白與小鼠和人類體內(nèi)的同源蛋白序列進行氨基酸序列比對，同源性分別為21.76%、22.09%(圖1，第114頁).

圖1 SjENT3蛋白質序列比對分析

2.2 qRT-PCR分析SjENT3基因轉錄水平分析

使用TRIzol試劑從收集的7，14，18，21，25，28，35，42d日本血吸蟲蟲體中提取總RNA，然后使用Prime Script RT試劑盒進行反轉錄.利用qRT-PCR分析SjENT3基因的轉錄水平，結果表明，SjENT3基因從7d到21d逐漸上升，并在21d達到最高，之后逐漸下降，在42d降到最低(圖2(a)，第114頁).將分開收集的18，21，25，28，35，42d的曾合抱雌、雄蟲體提取總RNA并反轉錄，對SjENT3基因在其中的轉錄水平進行qRT-PCR分析，結果表明，SjENT3基因在各檢測時期雄蟲體內(nèi)的轉錄水平明顯高于雌蟲，在不同時間點雄蟲體內(nèi)和雌蟲體內(nèi)的轉錄態(tài)勢和其在不同發(fā)育時間點蟲體內(nèi)的轉錄態(tài)勢一致(圖2(b)，第114頁).對處在不同感染狀態(tài)雄蟲蟲體進行分析，發(fā)現(xiàn)SjENT3基因在感染后21，23，25d合抱雄蟲體內(nèi)的轉錄水平皆顯著高于其在同時段單性感染雄蟲體內(nèi)的表達，其在感染后18d兩種感染狀態(tài)蟲體間的轉錄水平?jīng)]有顯著性差異(圖2(c)，第114頁).

圖2 SjENT3基因在日本血吸蟲體內(nèi)轉錄水平分析

2.3 SjENT3基因RNA干擾實驗

2.3.1 特異性siRNA對SjENT3基因轉錄水平的影響

通過小鼠尾靜脈注射不同的siRNA，利用qRT-PCR分析各組中SjENT3相對內(nèi)參基因SjNADPH的表達量時發(fā)現(xiàn)：相對于PBS組與NC組，S1干擾組轉錄水平分別下降64.4%與65.4%；S2干擾組轉錄水平分別下降64.7%與65.6%；S3干擾組轉錄水平分別下降35.4%與37.1%(圖3(a)).相對于PBS組與NC組，S2 siRNA長期干擾組SjENT3基因的轉錄水平分別下降75.9%與76.2%(圖3(b)).

圖3 qRT-PCR 檢測siRNA干擾效果

2.3.2 長期干擾SjENT3基因的表達對血吸蟲生長、生殖的影響

用干擾效果較好的S2 siRNA對血吸蟲體內(nèi)SjENT3基因進行長期干擾，對受干擾蟲體的生存能力和繁殖能力進行比較分析，結果發(fā)現(xiàn): 相對于PBS組和NC組，SjENT3基因表達被長期干擾會引起小鼠體內(nèi)成蟲存活能力下降18.07%和24.45%，其產(chǎn)卵引起的每克肝臟荷卵數(shù)下降61.71%和57.47%；雌蟲產(chǎn)卵能力下降57.28%和42.28%，干擾SjENT3基因的轉錄水平對蟲卵的孵化能力沒有明顯的影響(表2).

表2 長期干擾SjENT3對日本血吸蟲存活和繁殖能力的影響

3 討 論

血吸蟲病流行歷史悠久，分布廣泛，危害嚴重，為人畜共患的重大疫病之一.雖然化學藥物吡喹酮對其有良好的治療效果，但其不能預防重復感染，且對童蟲期血吸蟲殺傷效果欠佳[16].日本血吸蟲的終宿主為哺乳類，中間宿主為淡水釘螺[17].日本血吸蟲毛蚴進入釘螺體內(nèi)可進行大量的無性繁殖，多批次逸出尾蚴，尾蚴可感染多達40種哺乳類動物，血吸蟲在終末宿主體內(nèi)可存活十數(shù)年，持續(xù)向外界環(huán)境中釋放蟲卵，造成血吸蟲病的再流行.日本血吸蟲的中間宿主釘螺生命力極強，個體小、數(shù)量大、繁殖快、難以消滅[17].水資源開發(fā)，氣候和環(huán)境變化，人口流動都可能導致釘螺滋生地范圍擴大，致使血吸蟲病傳播到新的地區(qū)[18]，且到目前為止血吸蟲病尚無可用疫苗，化療藥物吡喹酮又有導致產(chǎn)生抗藥蟲株的可能，因此亟待開發(fā)血吸蟲病防控新途徑.

ENT3蛋白作為核苷類似藥物穿膜的轉運分子被廣泛應用于抗癌和抗病毒治療.我們發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲ENT3蛋白與宿主相關蛋白同源性低，可否根據(jù)此特性篩選治療血吸蟲病的核苷類藥物則值得探討.本研究發(fā)現(xiàn)，隨著血吸蟲的生長發(fā)育，SjENT3轉錄水平逐漸上升，且其在同時期雄蟲體內(nèi)的含量顯著高于雌蟲，說明SjENT3在血吸蟲尤其是雄蟲的生長發(fā)育中有著重要的作用，可能為滿足其快速生長需要大量的核苷類物質和能量時提供幫助.前期研究發(fā)現(xiàn)在蛋白水平上，SjENT3在兩性感染雄蟲體內(nèi)表達量頗高，本研究在轉錄水平上分析了SjENT3在兩性感染雄蟲和單性感染雄蟲體內(nèi)的表達，21，23，25天的結果與蛋白質組學結果相符合.

隨著生物科學技術的日新月異，出現(xiàn)了多種基因功能研究手段[19]，但目前能應用于日本血吸蟲基因功能研究的仍是RNA干擾技術.RNA干擾是基因轉錄后的沉默過程，由雙鏈RNA觸發(fā)，能夠導致同源mRNA的不穩(wěn)定[20].本研究通過尾靜脈注射siRNA長期干擾宿主體內(nèi)日本血吸蟲SjENT3的轉錄，發(fā)現(xiàn)SjENT3的低表達會影響血吸蟲的生存能力，干擾導致宿主體內(nèi)蟲荷率下降24.44%，干擾SjENT3的表達還引起雌蟲產(chǎn)卵能力的下降，平均雌蟲產(chǎn)卵能力約下降42.28%，進而導致宿主肝臟荷卵數(shù)下降57.47%.我們的研究發(fā)現(xiàn)(表2)：SjENT3不僅在雄蟲體內(nèi)大量表達，其在雌蟲體內(nèi)也有一定的表達，且其在兩性感染和單性感染雄蟲體內(nèi)的差異表達說明該蛋白有可能參與血吸蟲雌雄蟲間的合抱、信息和物質傳遞等生理過程.干擾導致雌蟲產(chǎn)卵能力下降可能是由于雌蟲體內(nèi)SjENT3的水平下降，也可能是由于雄蟲體內(nèi)SjENT3水平的大幅度降低，間接影響雌雄蟲間相互作用而導致的.

本研究分析了SjENT3在血吸蟲體內(nèi)的表達情況，并觀察、統(tǒng)計分析了該基因沉默對血吸蟲生長生殖的影響，結果初步表明SjENT3基因參與了日本血吸蟲尤其是雄蟲的生長發(fā)育，并可能與血吸蟲雌雄蟲合抱及其相互間信息傳遞有一定的關系.