大孔吸附樹(shù)脂純化樺褐孔菌三萜類(lèi)化合物工藝優(yōu)化

檀琪，阮文輝，楊官娥，劉海萍，郭素萍，王進(jìn)東,

1. 山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（太原 030001）；2. 山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院（太原 030001）；3. 山西省藥品監(jiān)督管理局技術(shù)審評(píng)中心（太原 030001）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）又稱(chēng)白樺茸，是一種藥用真菌[1-4]，主要分布在歐洲及北美地區(qū)[5]。樺褐孔菌的主要成分有三萜類(lèi)、多糖類(lèi)、甾類(lèi)、多酚類(lèi)等[6-11]。樺褐孔菌是一種天然的藥食兩用型真菌，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)樺褐孔菌的提取分離技術(shù)及藥效等研究越來(lái)越重視，關(guān)于樺褐孔菌化學(xué)成分的研究較多，其中三萜類(lèi)成分不僅是樺褐孔菌子實(shí)體中的主要成分，也是其活性成分[12-14]。研究顯示，樺褐孔菌里的三萜類(lèi)成分具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、增強(qiáng)免疫活性等功能，同時(shí)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量小、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[15-20]。

原料經(jīng)過(guò)提取得到的粗提物化學(xué)成分較為復(fù)雜，需要進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，常見(jiàn)三萜類(lèi)化合物的純化方法有大孔樹(shù)脂、ODS柱、硅膠、凝膠色譜法等[21-24]。三萜類(lèi)化合物分離純化最常用的方法是色譜法，亦是最有效的方法。大孔吸附樹(shù)脂色譜是一種不含交換基團(tuán)、有大孔結(jié)構(gòu)的有機(jī)高聚物吸附劑，具有吸附和分子篩雙重作用，因其成本低、吸附容量大、選擇性好、樹(shù)脂再生簡(jiǎn)便、解吸容易、洗脫率高、可再生等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)純化有效成分領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛[25-27]。此次試驗(yàn)采用大孔樹(shù)脂對(duì)樺褐孔菌粗提物進(jìn)行純化，得到一種高效、快速、可靠的樺褐孔菌中三萜類(lèi)化合物的提取、富集工藝，為樺褐孔菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌子實(shí)體粉末（安徽亳州）；白樺脂醇對(duì)照品（HPLC純度＞97.6%，Chroma Dex，批號(hào)20151008）。香草醛（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；冰醋酸、高氯酸、異丙醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇（均為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；AB-8、DM130、D101、HPD100、LSA-21大孔樹(shù)脂（西安藍(lán)曉科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOMATE 3S紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Thermo Fisher）；BSN-220.3電子天平（北京塞多利斯有限公司）；HH-6電熱恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）；GZX-9140電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；LYNX-6000離心機(jī)（Thermo Fisher）；振動(dòng)式藥物超微粉碎機(jī)（濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樺褐孔菌總?cè)拼痔嵛锏闹苽?/p>

在前期研究基礎(chǔ)上[28]，取干燥后的樺褐孔菌粉末，加22倍的異丙醇于80 ℃回流提取1次，時(shí)間為2.5 h，離心（3 500 r/min，10 min），備用。

1.3.2 三萜類(lèi)化合物檢測(cè)

采用紫外-可見(jiàn)分光光度法[29]。準(zhǔn)確稱(chēng)取4.0 mg干燥恒質(zhì)量的白樺脂醇對(duì)照品于25 mL的容量瓶中，加入無(wú)水乙醇溶解，稀釋至刻度搖勻，即可得到質(zhì)量濃度0.16 mg/mL的對(duì)照品溶液。精確吸取0.1，0.15，0.25，0.30，0.35，0.40，0.50和0.55 mL白樺脂醇對(duì)照品溶液，分別置于10 mL具塞試管，在100 ℃水浴上蒸干后加入0.20 mL新配制的5 g/100 mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80 mL高氯酸溶液，搖勻，于70 ℃水浴保溫反應(yīng)15 min，冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯定量至5 mL，搖勻，同時(shí)作試劑空白，在550 nm處測(cè)定吸光度，以白樺脂醇質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.008 5X-0.021 9，R2=0.999 4。用于三萜類(lèi)化合物的檢測(cè)。

1.3.3 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

1.3.3.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂（AB-8、D101、DM130、HPD100、LSA21）于100 mL錐形瓶中，分別加入50 mL已測(cè)定質(zhì)量濃度的樺褐孔菌三萜樣品液，置于搖床中以100 r/min振蕩12 h，吸附平衡后過(guò)濾，測(cè)定吸光度并計(jì)算溶液中三萜類(lèi)化合物質(zhì)量濃度。計(jì)算5種樹(shù)脂對(duì)三萜類(lèi)化合物的比吸附容量以及吸附率。按式（1）和式（2）計(jì)算。

式中：Qe為比飽和吸附量，mg/g；C0為吸附前樣液質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為吸附前樣液體積，mL；C1為吸附過(guò)濾后樣液質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為吸附過(guò)濾后樣液體積，mL；M為大孔樹(shù)脂質(zhì)量，g。

1.3.3.2 靜態(tài)解吸試驗(yàn)

將按1.3.3.1項(xiàng)下吸附飽和的樹(shù)脂加入140 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%的乙醇中，置于搖床中以100 r/min振蕩12 h進(jìn)行解吸，過(guò)濾測(cè)定吸光度并計(jì)算溶液中三萜類(lèi)化合物質(zhì)量濃度，計(jì)算5種樹(shù)脂對(duì)三萜類(lèi)化合物的解吸率。按式（3）計(jì)算。

式中：C0為吸附前樣液質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為吸附前樣液體積，mL；C1為吸附過(guò)濾后樣液質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為吸附過(guò)濾后樣液體積，mL；C2為解吸液質(zhì)量濃度，mg/mL；V2為解吸過(guò)濾后樣液體積，mL。

1.3.4 動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

1.3.4.1 動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂，裝入玻璃柱中，將質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL樺褐孔菌三萜粗提液以1 mL/min的流速進(jìn)行連續(xù)上樣，收集流出液（每1 BV為1份），測(cè)定每份流出液的吸光度，計(jì)算流出液中總?cè)频暮?，以流出液體積為橫坐標(biāo)，有效物質(zhì)質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線。

1.3.4.2 上柱液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂，分別裝入玻璃柱中，以對(duì)三萜類(lèi)化合物吸附量為考察指標(biāo)，取1.3.1項(xiàng)下樣品溶液，分別稀釋至質(zhì)量濃度為0.02，0.05，0.1，0.15和0.2 mg/mL，共5份，相同流速上柱，測(cè)定吸附后的吸光度并計(jì)算溶液中三萜化合物的含量，以分析樣品質(zhì)量濃度對(duì)大孔樹(shù)脂吸附的影響。

1.3.4.3 上柱流速對(duì)吸附效果的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂，分別裝入玻璃柱中，取相同體積和質(zhì)量濃度三萜化合物樣品溶液，分別以1.0，2.0和3.0 mL/min的流速上進(jìn)行上樣，收集流出液（每1 BV為1份），測(cè)定每份流出液的吸光度，計(jì)算流出液中總?cè)频暮?，以分析上樣流速?duì)大孔樹(shù)脂吸附的影響。

1.3.4.4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂，分別裝入玻璃柱中，裝柱按優(yōu)選的上樣量進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，待吸附完成后，分別以體積分?jǐn)?shù)30%，50%，60%，70%和90%的乙醇溶液以2 mL/mim進(jìn)行洗脫，收集流出液（每1 BV為1份），測(cè)定每份流出液的吸光度，計(jì)算洗脫液中總?cè)频暮浚苑治鱿疵搫w積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響。

1.3.4.5 洗脫劑用量對(duì)解吸率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂，分別裝入玻璃柱中，按優(yōu)選的上樣量進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，待吸附完成后，用60%乙醇溶液洗雜2 BV，加入體積分?jǐn)?shù)為90%乙醇進(jìn)行洗脫，收集流出液（每1 BV為1份），測(cè)定每份流出液的吸光度，計(jì)算洗脫液中總?cè)频暮?，以分析洗脫劑用量?duì)解吸效果的影響。

1.3.4.6 洗脫流速對(duì)解吸率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂，徑高比為1∶4，分別裝入玻璃柱中，按優(yōu)選的上樣量進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，待吸附完成后，分別以1.0，2.0和3.0 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集流出液（每1 BV為1份），測(cè)定每份流出液的吸光度，計(jì)算洗脫液中總?cè)频暮浚苑治鱿疵搫┝魉賹?duì)解吸效果的影響。

2 結(jié)果和分析

2.1 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附性能比較及篩選

篩選合適的樹(shù)脂是大孔吸附樹(shù)脂分離純化的第一步，亦是關(guān)鍵步驟之一。根據(jù)大孔樹(shù)脂分離純化的基本原理，選取了5種樹(shù)脂進(jìn)行試驗(yàn)，以靜態(tài)吸附法對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行篩選，結(jié)果如表1所示。LSA21對(duì)樺褐孔菌三萜的吸附率較低，HPD100、LSA21和D101解吸率明顯低于其他2種樹(shù)脂；相對(duì)來(lái)說(shuō)，AB-8具有較好的吸附性能和解吸性能，比飽和吸附量為9.67 mg/g，解吸率為87.09%。因此，選擇AB-8樹(shù)脂進(jìn)行下一步的動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)。

2.2 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線

在大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附過(guò)程中，當(dāng)上樣條件一定時(shí)，上樣液流過(guò)樹(shù)脂，三萜類(lèi)化合物會(huì)被樹(shù)脂吸附，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，三萜類(lèi)化合物在樹(shù)脂與上樣液中分配達(dá)到平衡，即溶液中的三萜類(lèi)化合物不斷被樹(shù)脂吸附，同時(shí)吸附在樹(shù)脂上的三萜類(lèi)化合物又不斷脫附，當(dāng)吸附達(dá)到平衡時(shí)，出現(xiàn)泄漏[30]。在樹(shù)脂吸附過(guò)程中，一般認(rèn)為泄漏點(diǎn)為流出溶液中三萜類(lèi)化合物濃度為原上樣濃度的1/10時(shí)對(duì)應(yīng)的流出液體積。由圖1可知，當(dāng)流出液體積為4 BV時(shí)，出現(xiàn)泄漏點(diǎn)。隨著上樣量的增加，樺褐孔菌三萜從開(kāi)始就有少量泄漏，AB-8樹(shù)脂對(duì)總?cè)频男孤┞食试黾于厔?shì)；當(dāng)上樣體積低于14 BV時(shí)，收集液濃度均在20 μg/mL以下并且增長(zhǎng)緩慢；在14 BV后，泄露明顯；繼續(xù)上樣將產(chǎn)生更大的泄漏。所以選擇14 BV為最佳上樣量。

表1 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附性能比較

圖1 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線

2.3 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

由圖2可知，隨著上樣液質(zhì)量濃度的提高，三萜類(lèi)物質(zhì)的吸附率不斷升高，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，吸附量達(dá)到最大，為7.666 mg/g。從理論上講，上樣液質(zhì)量濃度越高，吸附率應(yīng)該越高，因?yàn)橘|(zhì)量濃度差越大越有利于擴(kuò)散。但試驗(yàn)前期研究樣品溶解度等綜合因素，發(fā)現(xiàn)樣品質(zhì)量濃度不宜超過(guò)0.2 mg/mL。綜上，上樣液質(zhì)量濃度選擇0.2 mg/mL。

圖2 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)三萜類(lèi)化合物吸附量的影響

2.4 上樣流速對(duì)吸附的影響

由圖3可知，當(dāng)上樣流速為1.0，2.0和3.0 mL/min時(shí)，上樣終點(diǎn)（流出液質(zhì)量濃度為上樣液質(zhì)量濃度的1/10時(shí)）分別出現(xiàn)在15，3和2 BV附近。當(dāng)上樣流速為2 mL/min時(shí)，上樣終點(diǎn)出現(xiàn)最早，原因是上柱流速過(guò)快會(huì)使傳質(zhì)過(guò)程無(wú)法完全進(jìn)行，從而引起泄露。如果流速較慢，有效成分被大孔樹(shù)脂充分接觸，吸附量增加，但吸附時(shí)間增加會(huì)造成生產(chǎn)過(guò)程過(guò)長(zhǎng)。綜合考慮吸附效果和工作效率，最終選擇1 mL/min上樣流速。

圖3 不同上樣流速時(shí)的吸附效果

2.5 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇解吸液的解吸效果

由圖4可知，隨著洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，洗脫劑對(duì)樺褐孔菌三萜類(lèi)化合物的解吸能力增大，表現(xiàn)為三萜類(lèi)化合物的解吸率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增加。原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，極性越小，而弱極性的AB-8樹(shù)脂與極性較小的三萜類(lèi)化合物極性相似，越容易被洗脫下來(lái)，故三萜類(lèi)化合物的解吸率隨著乙醇的體積分?jǐn)?shù)升高而升高，但考慮到乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，不僅有效成分會(huì)洗脫出來(lái)，雜質(zhì)也會(huì)被洗脫下來(lái)，故確定用60%乙醇除去雜質(zhì)，再用90%乙醇富集三萜類(lèi)成分。

圖4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的解吸效果

2.6 動(dòng)態(tài)解吸曲線

由圖5可知，以90%乙醇洗脫，質(zhì)量濃度峰值出現(xiàn)在1～4 BV，其中洗脫液體積為2 BV時(shí)總?cè)坪孔罡撸?8 BV后三萜質(zhì)量濃度已經(jīng)很小，只有23.32 μg/mL。18 BV時(shí)已流出總解吸液95.78%的三萜化合物。綜合考慮，18 BV為合理的洗脫劑用量。

圖5 AB-8樹(shù)脂動(dòng)態(tài)解吸曲線

2.7 不同洗脫流速的洗脫效果

由圖6可知，以1.0 mL/min的速度洗脫時(shí)峰形較窄；而以2.0或3.0 mL/min的速度洗脫則峰形變寬。當(dāng)洗脫流速為1 mL/min時(shí)，洗脫率最高，2.0 mL/min與3.0 mL/min的解吸量差異小，但二者均顯著低于1.0mL/min。綜合考慮洗脫率和洗脫效率，1.0 mL/min的洗脫流速較為合理。

圖6 不同解吸流速時(shí)的解吸曲線

2.8 純化后三萜化合物的純度

樺褐孔菌三萜粗提物經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂吸附、90%乙醇洗脫、水浴揮干至恒質(zhì)量，得淡黃色粉末，即為樺褐孔菌三萜。純度可達(dá)85.13%，與純化前總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%，提高了2.04倍。說(shuō)明上述純化工藝效果明顯，具有實(shí)際應(yīng)用性。

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)采用大孔樹(shù)脂對(duì)樺褐孔菌提取物中的總?cè)七M(jìn)行純化，選擇AB-8大孔樹(shù)脂作為理想樹(shù)脂。經(jīng)過(guò)以上考察，得到最佳分離純化工藝條件：上樣液質(zhì)量濃度0.2 mg/mL，上樣流速1 mL/min，上樣體積14 BV，洗脫流速1 mL/min，最后用90%洗脫18 BV。在此條件下，三萜類(lèi)化合物的純化率可達(dá)到85.13%。結(jié)果表明，利用大孔吸附樹(shù)脂可以對(duì)植物內(nèi)的活性化合物實(shí)現(xiàn)高效富集，除去雜質(zhì)化合物以提高有效成分的含量，大孔吸附樹(shù)脂分離富集樺褐孔菌三萜化合物技術(shù)的應(yīng)用過(guò)程操作簡(jiǎn)單且可擴(kuò)大化生產(chǎn)。此次試驗(yàn)可為更好地研究和應(yīng)用這一藥用真菌、深入開(kāi)發(fā)利用這一資源、擴(kuò)大藥物的適用范圍、進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其藥理活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。