響應(yīng)面優(yōu)化法利用棗汁發(fā)酵生成甘油的工藝

尹蓉，殷龍龍，張倩茹，王賢萍，梁志宏

1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所，果樹種質(zhì)創(chuàng)制與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（太原 030031）；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)功能食品研究院（太原 030031）

甘油（丙三醇，CHOHCHOHCHOH）是眾多民生領(lǐng)域如食品、洗護(hù)化妝、醫(yī)藥保健、紡織等行業(yè)的必備原料，但我國(guó)甘油生產(chǎn)缺口大，一大部分依賴于進(jìn)口[1]。近年來(lái)合成甘油大幅度發(fā)展，而皂化甘油由于肥皂產(chǎn)業(yè)的萎縮導(dǎo)致產(chǎn)量大幅度下降，雖然二者和甘油性質(zhì)相似，但只限于某些行業(yè)可以替代[1-2]。在此種條件下，發(fā)酵甘油因其廣泛的應(yīng)用范圍引起了關(guān)注[2-3]。發(fā)酵甘油的原材料來(lái)源廣泛且價(jià)格低廉，可以是淀粉類或糖類物質(zhì)，也可以是某些含淀粉、含糖的副產(chǎn)物，而且生產(chǎn)難度較低、有害物生成少，適合于一些中小企業(yè)生產(chǎn)，可緩解我國(guó)甘油供應(yīng)緊張的問題[2,4-5]。

甘油是釀酒酵母（Saccharamyces cerevisiae）酒精發(fā)酵中僅次于乙醇、CO2的副產(chǎn)物，甘油的產(chǎn)量可因酵母對(duì)亞硫酸的適應(yīng)而顯著提高[6-8]。研究表明，堿性條件下在5%的糖溶液中，加入亞硫酸鈉，用葡萄酒酵母進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，可得到轉(zhuǎn)化率為51%產(chǎn)量的甘油（以發(fā)酵糖計(jì)量），用紫外線照射的啤酒酵母突變株較未照射的菌甘油產(chǎn)量可提高20%～25%[2]。酵母菌種、發(fā)酵液pH、含氮物、SO2加量、通風(fēng)、發(fā)酵溫度等因素均可對(duì)甘油的形成產(chǎn)生影響。康毅等[9]研究表明，在初始葡萄糖質(zhì)量濃度216 g/L、果糖質(zhì)量濃度144 g/L、發(fā)酵溫度32 ℃、pH 3.0、SO2添加量40 mg/L的條件下，經(jīng)釀酒酵母D254發(fā)酵，獲得的甘油最高產(chǎn)量達(dá)655.64 μmol/L。王秀菊等[10]研究得出發(fā)酵溫度、銨鹽的添加及SO2劑量均對(duì)蘋果酒、梨酒甘油產(chǎn)量有一定的影響，但同種條件下梨汁發(fā)酵產(chǎn)生的甘油要高于蘋果汁。Chen等[11]研究磷酸氫二銨（DAP）的添加對(duì)荔枝酒發(fā)酵的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加0.5 mmol/L的DAP在荔枝酒在發(fā)酵早期顯著提高了其甘油和酒精的含量，且甘油產(chǎn)量的增長(zhǎng)量高于酒精。

紅棗是山西多個(gè)地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)。近些年，種種原因?qū)е乱恍┍镜仄贩N尤其是產(chǎn)量最大的木棗存在嚴(yán)重滯銷浪費(fèi)現(xiàn)象，再加上當(dāng)?shù)貧夂蛟斐傻拇罅繗埓螚?、落棗、劣棗[12-14]，如何利用過(guò)剩紅棗資源成為一個(gè)重要課題。紅棗含有很高的糖分[15-16]，而干棗儲(chǔ)備可不受季節(jié)供應(yīng)的影響，因此可將過(guò)剩紅棗作為原料進(jìn)行發(fā)酵甘油的生產(chǎn)。試驗(yàn)以干紅棗熱提汁作為甘油發(fā)酵的原料，利用傳統(tǒng)甘油發(fā)酵的原理，在棗汁中添加亞硫酸鈉（Na2SO3），在堿性條件下發(fā)酵，研究發(fā)酵條件的影響，并結(jié)合響應(yīng)面分析法，摸索到成效最佳的實(shí)驗(yàn)室工藝條件，為初步利用紅棗汁生產(chǎn)甘油奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木棗，購(gòu)于山西省呂梁市臨縣，要求棗果無(wú)病蟲害、無(wú)腐爛；國(guó)光高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司，市售。乙腈（色譜純）、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、甘油（分析純）、屈臣氏純凈水。

1.2 儀器及試劑

WATERS e2695凝膠液相色譜儀（2141RI檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站、SMH G18SMH018G色譜恒溫箱、SUPELCOGEL Ag2樹脂型糖分析柱）；0.45 μm水系溶劑針筒過(guò)濾器（天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超聲波清洗儀（中國(guó)昆山市超聲儀器公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)流程

干紅棗→清洗→切割（將每顆棗切割三刀）→加熱提汁（加入5倍體積純凈水，加熱至70 ℃后停止，常溫靜置提汁12 h）→過(guò)濾（孔徑0.048 mm篩網(wǎng)）→調(diào)糖度（濃縮或加入水，根據(jù)試驗(yàn)需要）→將棗汁pH調(diào)制7以上→菌種活化及接種（以0.4 g/L的濃度稱取活性干酵母，加入適量濃度為2%的葡萄糖溶液，置于37℃水浴鍋中連續(xù)攪拌15min，而后加入棗汁中，并混合均勻[17-18]）→發(fā)酵→取樣測(cè)定

1.3.2 色譜條件

流速1 mL/min，壓力上限4 000 PSI，輸送體積50μL，總流量1 mL，加速到10 mL/min所需的時(shí)間2 min，目標(biāo)柱溫30 ℃，柱溫范圍±5 ℃，甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)柱溫保留10 min，棗酒樣品保留40 min。

1.3.3 甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用分析純甘油、乙腈分別配制5，10，15，20，25和30 g/L的甘油溶液，在上述條件下，甘油大約在5.51 min出峰，以甘油質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

1.3.4 樣品前處理及測(cè)定

棗汁發(fā)酵完成后，取棗發(fā)酵液，用0.45 μm水系溶劑針筒過(guò)濾器過(guò)濾，之后以1∶3比例與乙腈混合，充分混勻，靜置4 h 后，取上清液再次用0.45 μm水系溶劑針筒過(guò)濾器過(guò)濾[17,19-20]，加入液相進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、Designer-Expert 10.0.7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

圖1 甘油溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 單一發(fā)酵參數(shù)試驗(yàn)

2.1.1 pH對(duì)棗汁甘油生成量的影響

調(diào)整棗汁糖度至20 °Brix，取350 mL置于三角瓶中，加入2%亞硫酸鈉（Na2SO3），以NaOH和鹽酸調(diào)pH，分別將pH調(diào)至7.2，7.5，7.8，8.1和8.4，每個(gè)處理重復(fù)3次，接入活化好的國(guó)光酵母，于30 ℃發(fā)酵至殘?zhí)堑陀? g/L，測(cè)定棗發(fā)酵液中甘油質(zhì)量濃度。pH對(duì)棗汁發(fā)酵甘油生成量的影響如圖2所示。發(fā)酵中初始pH對(duì)棗汁甘油生成量影響很大，一開始隨著pH的升高，甘油產(chǎn)量逐漸提高，pH在7.4～8.1時(shí)，甘油產(chǎn)量維持在高水平；pH＞8.1時(shí)，甘油產(chǎn)量大幅度下降。說(shuō)明pH升高到一定的水平會(huì)明顯抑制甘油生成。因此，生產(chǎn)中宜將pH控制于7.4～8.1之間。

圖2 pH對(duì)棗汁發(fā)酵甘油生成量的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)棗汁甘油生成量的影響

取350 mL 20 °Brix棗汁置于三角瓶中，加入2%亞硫酸鈉（Na2SO3），以NaOH和鹽酸調(diào)pH至7.8，分別在28，30，32，34和36 ℃下恒溫發(fā)酵，每個(gè)處理重復(fù)3次，接入活化好的國(guó)光酵母，發(fā)酵至殘?zhí)堑陀? g/L，測(cè)定棗發(fā)酵液中甘油質(zhì)量濃度。發(fā)酵溫度對(duì)棗汁發(fā)酵甘油生成量的影響如圖3所示。棗汁發(fā)酵適宜溫度在28～36 ℃之間，不同的溫度對(duì)甘油最終生成量影響很小，但總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，甘油產(chǎn)量最高的發(fā)酵溫度為32 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)棗汁發(fā)酵甘油生成量的影響

2.1.3 棗汁初始糖度對(duì)棗汁甘油生成量的影響

通過(guò)濃縮或稀釋，分別將棗汁調(diào)至5，10，15，20和25 °Brix，取350 mL置于三角瓶中，加入2%亞硫酸鈉（Na2SO3），以NaOH和鹽酸調(diào)pH至7.8，分別在30 ℃下恒溫發(fā)酵，每個(gè)處理重復(fù)3次，接入活化好的國(guó)光酵母，發(fā)酵至殘?zhí)堑陀? g/L，測(cè)定棗發(fā)酵液中甘油質(zhì)量濃度。棗汁初始糖度對(duì)棗汁發(fā)酵甘油生成量的影響如圖4所示。棗汁初始糖度對(duì)甘油生成量影響較大，初始糖度＜20 °Brix時(shí)，初始糖度增加會(huì)使甘油最終生成量相應(yīng)增加，但高于20 °Brix時(shí)，甘油生成量開始下降，說(shuō)明高糖度導(dǎo)致滲透壓增加，影響了酵母的活性。因此20 °Brix是棗汁發(fā)酵甘油最適合的初始糖度。

2.1.4 Na2SO3添加量對(duì)棗汁甘油生成量的影響

取350 mL 20 °Brix棗汁置于三角瓶中，分別加入1%，2%，3%，4%和5%濃度的亞硫酸鈉（Na2SO3），以NaOH和鹽酸調(diào)pH至7.8，分別在30 ℃下恒溫發(fā)酵，每個(gè)處理重復(fù)3次，接入活化好的國(guó)光酵母，發(fā)酵至殘?zhí)堑陀? g/L，測(cè)定棗發(fā)酵液中甘油質(zhì)量濃度。發(fā)酵溫度對(duì)棗汁發(fā)酵甘油生成量的影響如圖5所示。Na2SO3添加量對(duì)棗汁發(fā)酵甘油的生成具有一定的影響，當(dāng)Na2SO3添加量為3%時(shí)，甘油生成量最大；高于3%時(shí)，甘油生成量開始下降?？赡苁且?yàn)楦邼舛鹊腘a2SO3會(huì)影響棗汁發(fā)酵液pH和滲透壓，從而抑制了發(fā)酵動(dòng)力。因此，3%的Na2SO3添加量最適合棗汁發(fā)酵甘油。

圖4 棗汁初始糖度對(duì)棗汁發(fā)酵甘油生成量的影響

圖5 Na2SO3添加量對(duì)棗汁發(fā)酵甘油生成量的影響

2.2 發(fā)酵參數(shù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，在較適宜的溫度范圍內(nèi)，發(fā)酵溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響小，因此選擇pH（A）、棗汁初始糖度（B）和Na2SO3添加量（C）為考察因子，利用Design-Expert 10.0.7設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，研究其在棗汁發(fā)酵甘油中的互作影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

2.2.2 模型方程的建立與顯著性分析

通過(guò)Design-Expert 10.0.7對(duì)表1結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到甘油質(zhì)量濃度（H）的回歸方程：H=46.02-0.41A+1.94B+0.98C-0.78AB+2.69AC+1.12BC-2.86A2-6.87B2-2.41C2。

對(duì)二次回歸方程進(jìn)行方差分析，顯著性分析如表2所示。模型p＜0.01，說(shuō)明該模型各因素關(guān)系極顯著；失擬項(xiàng)p＞0.05，表現(xiàn)為不顯著，說(shuō)模型回歸方程能夠反映棗汁發(fā)酵甘油的生成與各因素的關(guān)系；3個(gè)因素對(duì)甘油生成濃度的影響分別是：pH（A）極顯著，棗汁初始糖度（B）和Na2SO3添加量（C）不顯著；AB、AC、BC中，A和C、B和C對(duì)響應(yīng)值的交互影響均為顯著；因素A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值的曲面效果全部極顯著；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.965 3，說(shuō)明有96.61%試驗(yàn)數(shù)據(jù)可變性可用此模型來(lái)解釋，說(shuō)明該回歸方程的擬合度良好，模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值關(guān)聯(lián)度高，該方程可適用。

表2 各試驗(yàn)因素的方差分析

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

圖6 各因素交互作用對(duì)棗汁甘油生成的等高線及響應(yīng)曲面圖

通過(guò)Design-Expert 10.0.7軟件處理，得到棗汁甘油生成的等高線及響應(yīng)曲面圖，見圖6。由圖6（a）可知：等高線呈橢圓形，響應(yīng)曲面坡度較陡峭，且pH一側(cè)的坡度更為陡峭，說(shuō)明二者的交互作用顯著，且pH對(duì)棗汁甘油生成的影響要高于棗汁初始糖度；由圖6（b）可知：等高線呈橢圓形，響應(yīng)曲面坡度較陡峭，且pH一側(cè)的坡度更為陡峭，說(shuō)明二者的交互作用顯著，且pH影響要高于Na2SO3添加量；由圖6（c）可知：等高線呈橢圓形，響應(yīng)曲面坡度陡峭，且Na2SO3添加量一側(cè)的坡度相對(duì)更為陡峭，說(shuō)明二者的交互作用顯著，而Na2SO3添加量的影響要高于棗汁初始糖度。

2.4 響應(yīng)面最佳參數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 10.0.7設(shè)計(jì)得到棗汁發(fā)酵甘油最佳優(yōu)化參數(shù)：pH 7.67、棗汁初始糖度19.58 °Brix、Na2SO3添加量2.81%，預(yù)測(cè)甘油生成量為46.62 g/L?？紤]可操作性，將參數(shù)數(shù)值保留1位小數(shù)，在pH 7.7、棗汁初始糖度19.6 °Brix、Na2SO3添加量2.8%、溫度32 ℃的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)設(shè)置3次，3次甘油生成實(shí)測(cè)值的平均數(shù)為46.29 g/L，與預(yù)測(cè)值偏差小，說(shuō)明該模型能較好預(yù)測(cè)棗汁發(fā)酵生成甘油的試驗(yàn)，具有較高的利用價(jià)值。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)棗汁發(fā)酵甘油的工藝進(jìn)行優(yōu)化分析。結(jié)果表明，pH、棗汁初始糖度和Na2SO3添加量在棗汁發(fā)酵甘油中起著重要的作用，其中pH的作用尤為顯著，各參數(shù)之間交互作用明顯。棗汁發(fā)酵甘油的最優(yōu)工藝參數(shù)為pH 7.7、棗汁初始糖度19.6 °Brix、Na2SO3添加量2.8%。在此參數(shù)下，甘油生成量可達(dá)46.29 g/L。在最優(yōu)工藝參數(shù)下，響應(yīng)面法預(yù)測(cè)理論值與實(shí)際值接近，說(shuō)明該模型具有實(shí)用價(jià)值。此次試驗(yàn)為棗汁發(fā)酵甘油提供一定的理論基礎(chǔ)，在豐富甘油傳統(tǒng)生產(chǎn)法發(fā)酵法途徑中，具備一定的實(shí)用意義和環(huán)保價(jià)值；還可為解決山西紅棗過(guò)剩、浪費(fèi)的現(xiàn)象提供可行性參考。