誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法

張 格，朱 涵, 張婧雯，徐雨迪，段銘煊, 張 戈

0引言

視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)位于視網(wǎng)膜光感受器和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)之間,功能多樣，在促進(jìn)視網(wǎng)膜及其光感受器的功能中起著多種作用[1],成熟RPE細(xì)胞不具再生能力，RPE細(xì)胞的壞死、凋亡等功能異常是引起視網(wǎng)膜變性疾病的主要原因。視網(wǎng)膜變性類(lèi)疾病主要包括年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、視網(wǎng)膜劈裂癥、視網(wǎng)膜脫落、黃斑水腫、視網(wǎng)膜黃斑衰退癥、遺傳性黃斑營(yíng)養(yǎng)不良等，臨床上前兩者較普遍[2]。ARMD是老年人致盲最主要的原因，此病的發(fā)病率日益增多，60歲以上人群發(fā)病率達(dá)1/10，成為眼科防盲研究的重點(diǎn)課題。RP是一組以進(jìn)行性光感細(xì)胞及色素上皮功能喪失為共同表現(xiàn)的遺傳性疾病，是遺傳性視覺(jué)損害和失明的最常見(jiàn)原因。目前這類(lèi)疾病在臨床上以支持療法為主,仍無(wú)有效延緩或逆轉(zhuǎn)病程的方法。胚胎干細(xì)胞(ESCs)是從胎兒組織中的原始生殖細(xì)胞或哺乳動(dòng)物囊胚內(nèi)層細(xì)胞群或經(jīng)體外分離，抑制分化培養(yǎng)得到的能無(wú)限增生、自我更新及具備多向分化潛能的細(xì)胞。應(yīng)用具有無(wú)限種子細(xì)胞資源的ESCs誘導(dǎo)分化出的RPE細(xì)胞，進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞移植治療，可補(bǔ)充損傷的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，恢復(fù)視網(wǎng)膜功能，有望為臨床治療視網(wǎng)膜變性疾病帶來(lái)希望。目前對(duì)于ESCs治療視網(wǎng)膜變性疾病的研究較多，培養(yǎng)分化方法不斷創(chuàng)新，本文旨在收集ESCs誘導(dǎo)分化RPE的培養(yǎng)方法，歸納總結(jié)從不同角度作出綜述。胚眼發(fā)育時(shí),細(xì)胞具高度可塑性，易被周?chē)蛩赜绊?，在各種信號(hào)分子的誘導(dǎo)下,激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,使視泡背側(cè)前體細(xì)胞朝著RPE細(xì)胞定向分化[3]，干細(xì)胞向體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化需精準(zhǔn)時(shí)空調(diào)節(jié)，RPE的形成與誘導(dǎo)中重要信號(hào)通路的正確表達(dá)密切相關(guān)[4]。

1細(xì)胞因子誘導(dǎo)法

將可影響干細(xì)胞分化為RPE細(xì)胞的細(xì)胞因子(小分子化合物)加至培養(yǎng)基，在ESCs不同分化階段選擇性激活或抑制特異性通路[5]，顯著縮短分化時(shí)間，提高分化效率，由于無(wú)生物源性可避免種間污染和免疫排斥反應(yīng)[6]。

1.1肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子含肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)的人間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在體外促進(jìn)RPE細(xì)胞分化與RPE細(xì)胞作為細(xì)胞片層的增殖，顯著誘導(dǎo)干細(xì)胞向視神經(jīng)細(xì)胞分化。分化細(xì)胞顯著表達(dá)RPE標(biāo)志物RAX、PAX6、LHX2和SIX3[7]。HGF具有一定誘導(dǎo)作用，但不能使干細(xì)胞徹底分化至RPE，HGF對(duì)于干細(xì)胞早期向視神經(jīng)細(xì)胞或RPE分化起到導(dǎo)向。HGF在體內(nèi)是hESCs-RPE細(xì)胞正常發(fā)育的必要因素，HGF在體外對(duì)hESCs-RPE細(xì)胞的增殖起促進(jìn)作用，對(duì)于分化的促進(jìn)沒(méi)有增殖作用明顯。

1.2激活素A激活素A(Activin A)作為信號(hào)分子,系生長(zhǎng)因子(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成員。在分化的1～7d加入Activin A,可顯著提高h(yuǎn)ESCs分化為RPE的效率，較自發(fā)分化所產(chǎn)生的色素集落的數(shù)目更多且集落更大[8]，在第50d，黑色素灶比率可高達(dá)50.7%。流式分析表明得到的RPE能高表達(dá)RPE標(biāo)記物MITF和RPE65。熒光免疫染色檢測(cè)RPE能表達(dá)早期發(fā)育的OTX2蛋白以及特有BETS1蛋白[9]。采用PCR檢測(cè)RPE標(biāo)記基因,與成熟RPE表達(dá)水平相似[10]，Activin A影響RPE的自分泌和旁分泌過(guò)程,控制胚眼發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞增殖與分化[11]。Activin A還能增強(qiáng)另一種細(xì)胞因子煙酰胺(nicotinamide,NIC)誘導(dǎo)分化RPE的作用[12]。除此之外，又可通過(guò)特定的信號(hào)通路調(diào)節(jié)RPE遷移[13]。

1.3姜黃素誘導(dǎo)第14d加入姜黃素處理24h，促進(jìn)細(xì)胞增殖并使RPE細(xì)胞中的活性氧減少[14]，誘導(dǎo)第3wk便出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的黑色素細(xì)胞，第5wk可見(jiàn)大量團(tuán)塊色素細(xì)胞。姜黃素法的細(xì)胞色素化的時(shí)間、色素化細(xì)胞的比例和成熟RPE細(xì)胞標(biāo)志物ZO-1、MITF、Pax 6的表達(dá)明顯優(yōu)于空白對(duì)照組[15]。機(jī)制在于姜黃素刺激Wnt/β-catenin信號(hào)通路，使Wnt通路下游靶因子、受體和配體表達(dá)明顯升高。

1.4絲蛋白絲膠絲蛋白絲膠通過(guò)刺激NF-κB信號(hào)通路上調(diào)RPE相關(guān)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物促進(jìn)黑色素生成，可替代血清，顯著降低感染的風(fēng)險(xiǎn)。用含1%絲蛋白絲膠的DMEM培養(yǎng)基分化12d后即可產(chǎn)生色素，細(xì)胞密度與存活率更高，細(xì)胞死亡率更小，全流程中均可觀察到Ⅰ期～Ⅳ期的黑色素體。經(jīng)檢驗(yàn)RPE相關(guān)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RPE65和CRALBP)及相關(guān)蛋白(RPE65和黑色素)水平升高[16]。

2二維和三維誘導(dǎo)分化法

ESCs培養(yǎng)基除去堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，并去除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，ESCs可自發(fā)向RPE細(xì)胞分化，包括二維誘導(dǎo)和三維誘導(dǎo)，其中二維誘導(dǎo)包括連續(xù)貼壁培養(yǎng)和形成擬胚體繼續(xù)貼壁培養(yǎng)[17]。

2.1二維分化法

2.1.1連續(xù)貼壁培養(yǎng)連續(xù)貼壁培養(yǎng)使hESCs在去bFGF培養(yǎng)基自發(fā)分化形成RPE細(xì)胞，人工分離色素繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞逐漸融合擴(kuò)大成肉眼可見(jiàn)色素灶，從去除bFGF算起到色素灶可見(jiàn)需1～8wk[17]。純化hESCs-RPE細(xì)胞有兩種方法：機(jī)械切割法和酶消化分離法，前者是當(dāng)色素灶擴(kuò)大至直徑1mm時(shí)，用25G眼科手術(shù)刀切割色素，消化分離，接種于培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；后者通過(guò)兩步連續(xù)的胰酶消化以分離純化RPE細(xì)胞，將第二次消化的RPE細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)[18-20]。

2.1.2形成擬胚體將hESCs在懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)成擬胚體在無(wú)飼養(yǎng)層基質(zhì)包被的去bFGF的培養(yǎng)基連續(xù)貼壁培養(yǎng)，直至形成色素灶[21-27]。當(dāng)擴(kuò)大到能手動(dòng)分離色素灶時(shí)再于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)需1～3wk，開(kāi)始培養(yǎng)到色素灶肉眼可見(jiàn)需4～8wk[28-32]。

2.2三維分化法hESCs在無(wú)血清或生長(zhǎng)因子降低的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，或在無(wú)血清培養(yǎng)體系中快速聚集成擬胚體，hESCs可以自發(fā)形成連續(xù)的神經(jīng)上皮空泡，繼而形成含色素的RPE細(xì)胞層[33-34]。三維法除可有效誘導(dǎo)hESCs分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞和似胚胎視杯的杯狀構(gòu)造物外，所產(chǎn)生的視杯具有正常的RPE結(jié)構(gòu)。第20d出現(xiàn)色素灶，待其進(jìn)一步擴(kuò)大至能人工分離，用上述純化法將色素灶挑出，連續(xù)貼壁培養(yǎng)。在分化中可觀察到連續(xù)的神經(jīng)上皮樣結(jié)構(gòu)、視杯等。

2.3二維誘導(dǎo)法與三維誘導(dǎo)法比較二維的誘導(dǎo)方法不能模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育過(guò)程，但三維誘導(dǎo)經(jīng)歷視杯結(jié)構(gòu)，更接近原代分離的RPE細(xì)胞。二維和三維培養(yǎng)的RPE樣細(xì)胞均可檢出BEST1+、CRALBP+、RPE65+、PDEF+等RPE標(biāo)志物[33-34]，當(dāng)細(xì)胞不斷分化，上述物質(zhì)表達(dá)上調(diào)，但三維培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)均低于同時(shí)期二維培養(yǎng)的表達(dá)水平，并且差距逐漸縮小，說(shuō)明三維誘導(dǎo)的細(xì)胞比二維誘導(dǎo)細(xì)胞更幼稚[35]。三維誘導(dǎo)的RPE與二維相比，色素灶出現(xiàn)晚，色素更少和但壽命更長(zhǎng)。

3共培養(yǎng)法

3.1細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)此技術(shù)是在同一種環(huán)境下，共同培養(yǎng)2種或2種以上的細(xì)胞，因可更好地模擬體內(nèi)環(huán)境，被廣泛應(yīng)用。誘導(dǎo)過(guò)程中，若將ESCs與原代成體視網(wǎng)膜細(xì)胞或胚眙期未成熟的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞共培養(yǎng)，則會(huì)增加分化效率。

3.2細(xì)胞外基質(zhì)與鄰近細(xì)胞影響分化將hESCs于小鼠PA6基質(zhì)細(xì)胞上培養(yǎng)2wk可獲得神經(jīng)前體細(xì)胞[36]，再接種到人布魯赫膜或基質(zhì)膠上進(jìn)行RPE誘導(dǎo)分化。接種前，hESCs表達(dá)高干細(xì)胞標(biāo)志物OCT3/4、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81；在PA6細(xì)胞上培養(yǎng)后，形成色素灶并表達(dá)β-微管蛋白Ⅲ神經(jīng)前體標(biāo)志物；接種在基質(zhì)膠上的神經(jīng)前體細(xì)胞，21d時(shí)高表達(dá)RPE標(biāo)記物ZO-1；接種在布魯赫膜上的神經(jīng)前體細(xì)胞15d出現(xiàn)色素細(xì)胞，高表達(dá)RPE標(biāo)記蛋白。綜上，鄰近細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)能夠沿光感受器或RPE前體細(xì)胞系誘導(dǎo)hESCs，使分化后的前體細(xì)胞群體富集。

3.3人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞影響分化將hESCs-RPE細(xì)胞與人血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)6wk。結(jié)果表明，RPE特異標(biāo)記物ZO-1在單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；共培養(yǎng)對(duì)RPE細(xì)胞的形態(tài)和色素沉著未產(chǎn)生顯著影響，然而誘導(dǎo)分化得到的RPE細(xì)胞在屏障特性以及刷狀緣方面的差異具有細(xì)胞系特異性[37]。

3.4單核細(xì)胞以及血清影響分化將RPE細(xì)胞與不同濃度血清及不同數(shù)量單核細(xì)胞共培養(yǎng)[38-40]。結(jié)果表明單核細(xì)胞和血清均對(duì)RPE細(xì)胞的生長(zhǎng)分化有明顯促進(jìn)作用，二者具有協(xié)同作用。

若共培養(yǎng)的對(duì)象不同，誘導(dǎo)分化的結(jié)果不同。但均能獲得相應(yīng)的RPE細(xì)胞。共培養(yǎng)模擬體內(nèi)視網(wǎng)膜細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，在外部環(huán)境中建立適合細(xì)胞定向分化的條件而影響ESCs分化，但分化效率較低，約為傳統(tǒng)培養(yǎng)的30%。

4生物支架包埋法

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在體外對(duì)視網(wǎng)膜發(fā)育十分重要，RPE外環(huán)境改變?nèi)鏓CM的變化將對(duì)細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生影響。然而生物支架則模擬天然ECM，包裹并支撐活細(xì)胞，具備可加工性、堅(jiān)固性、相容性、可降解性等優(yōu)點(diǎn)，使得RPE細(xì)胞在植入時(shí)較少誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。所以運(yùn)用合適生物材料及細(xì)胞載體支架，模擬RPE細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)育環(huán)境，形成基于視網(wǎng)膜組織工程的治療方案具有良好前景。

4.1海藻酸鹽水凝膠包埋法運(yùn)用不同的水凝膠(0.5%海藻酸鈉、1%海藻酸鈉、明膠水凝膠)包埋hESCs制備擬胚體。證明0.5%和1%海藻酸鈉均能促進(jìn)hESCs向RPE分化，與對(duì)照組相比，含RPE和視囊泡的擬胚體總數(shù)顯著增加。但明膠水凝膠組的擬胚體總數(shù)改變不明顯。所以誘導(dǎo)能力方面，海藻酸鈉優(yōu)于明膠水凝膠[41]。姜黃素/海藻酸鈉凝膠共同包埋與純水凝膠相比，生物相容性好，細(xì)胞生長(zhǎng)能力增強(qiáng)，ECM形成率高，視網(wǎng)膜功能基因上調(diào)，細(xì)胞增殖率比純海藻酸鈉水凝膠法提高28%[42]。綜上，提高效率首選姜黃素/海藻酸鈉凝膠共同包埋法。

4.2纖維蛋白凝膠包埋法纖維蛋白水凝膠作為RPE移植的支撐材料，使RPE保持活性，生成具有特征鵝卵石外觀和深色的單層膜，RPE的mRNA和蛋白標(biāo)記物高表達(dá)。分化后期加入纖溶酶即可迅速降解纖維蛋白支持物，獲得完整的RPE單層。該操作方便并且不良反應(yīng)少[43]。

4.3聚乙二醇/gellan凝膠包埋法gellan凝膠具有良好生物學(xué)性狀但作為物理凝膠太脆弱，故與聚乙二醇結(jié)合起來(lái)，從而具備更好的生物相容性、細(xì)胞粘附性和細(xì)胞生長(zhǎng)能力。結(jié)果表明細(xì)胞在培養(yǎng)全過(guò)程中表現(xiàn)出更強(qiáng)的生長(zhǎng)分化能力，RPE標(biāo)記基因的表達(dá)也受到正向影響，最終促進(jìn)視網(wǎng)膜再生。綜上，聚乙二醇/gellan凝膠可作為視網(wǎng)膜再生的替代物[44]。

5小結(jié)與展望

誘導(dǎo)分化技術(shù)不斷成熟，但如何同時(shí)解決效率、周期、成本的問(wèn)題仍為目前的爭(zhēng)議。自發(fā)誘導(dǎo)法費(fèi)時(shí)長(zhǎng)且耗資源。二維培養(yǎng)法不能模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育過(guò)程，但三維法能在體外使細(xì)胞歷經(jīng)視杯結(jié)構(gòu)發(fā)育過(guò)程，從而得到更接近原代分離RPE細(xì)胞，不過(guò)色素灶出現(xiàn)的更晚并且數(shù)量減少。細(xì)胞因子法直接作用于視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的信號(hào)通路顯著提高分化效率并縮短培養(yǎng)時(shí)間，但步驟繁瑣成本高，培養(yǎng)需要多次手工傳代，致細(xì)胞老化。共培養(yǎng)法模擬體內(nèi)視網(wǎng)膜細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，創(chuàng)造分化環(huán)境影響ESCs的分化，優(yōu)化培養(yǎng)質(zhì)量，但效率則明顯下降。

如今，針對(duì)視網(wǎng)膜變性疾病多是對(duì)癥治療，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)藥物以及營(yíng)養(yǎng)支持用以延緩病程進(jìn)展，治療并發(fā)癥，但無(wú)法修復(fù)已受損的RPE細(xì)胞等，干細(xì)胞移植則將特定功能細(xì)胞整合入視網(wǎng)膜，重建患者視功能，隨著干細(xì)胞分化培養(yǎng)及移植治療的新策略不斷涌現(xiàn)，該方法取得的成果給廣大患者帶來(lái)了重見(jiàn)光明的希望。但目前的研究仍存在許多爭(zhēng)議待解決，分化的具體流程能否做到在保證質(zhì)量與效率的條件下精確至以天為時(shí)間單位指導(dǎo)操作步驟；是否需要精確標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估細(xì)胞功能及免疫排斥問(wèn)題；胚胎干細(xì)胞源自胚胎，相關(guān)治療時(shí)必然會(huì)涉及道德、倫理甚至政治問(wèn)題；不同干細(xì)胞系來(lái)源的視網(wǎng)膜細(xì)胞存在基因組或表觀遺傳學(xué)差異,導(dǎo)致干細(xì)胞源性RPE細(xì)胞移植的長(zhǎng)久有效安全性尚需進(jìn)一步研究。