超高壓處理對乳清分離蛋白結(jié)構(gòu)及致敏蛋白含量的影響

黨慧杰，鄭遠榮，劉振民*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心， 光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)

乳清分離蛋白(whey protein isolate,WPI)是蛋白含量在90%以上的一種乳清蛋白產(chǎn)品。乳清蛋白是干酪生產(chǎn)的副產(chǎn)物乳清中的主要固形物成分，具有較高的營養(yǎng)價值，被廣泛應(yīng)用到加工食品中。乳清蛋白包含β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)、α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-LA)、牛血清白蛋白等以及其他活性成分。其中β-LG和α-LA在WPI中含量較高，也是牛乳過敏的主要過敏原[1]。已有眾多學(xué)者研究了乳清蛋白改性技術(shù)，來消減乳清蛋白的致敏性。如熱處理、酶水解、輻照以及超高壓等技術(shù)[2-4]。不同加工技術(shù)對乳清蛋白結(jié)構(gòu)的影響不同，通過對乳清蛋白結(jié)構(gòu)的修飾，進而影響其致敏性。其中，乳清蛋白致敏性變化程度取決于加工方法、程度、處理時間等。

超高壓(ultra-high pressure, UHP)作為近年來較為新型的食品加工技術(shù)，有著較為廣泛的應(yīng)用前景。高壓過程可以產(chǎn)生強烈的機械應(yīng)力以及摩擦熱，產(chǎn)生局部高熱[5]，不僅能夠使微生物有效破壞，還可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[6]，并且在食品工業(yè)中易于擴大生產(chǎn)[7]。超高壓處理可以通過改變分子間或者分子疏水相互作用以及靜電作用而導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級、四級結(jié)構(gòu)的可逆或者不可逆的改變[8]，從而使其功能特性發(fā)生變化。龐佳坤等[9]利用傅里葉紅外光譜探究高壓對WPI結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)壓力可以使其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。但是，也有研究表明超高壓處理后乳清蛋白的三級和四級結(jié)構(gòu)改變，而二級結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯的改變[10-11]。蛋白質(zhì)的致敏性與其結(jié)構(gòu)息息相關(guān)[1]，超高壓對蛋白結(jié)構(gòu)的影響又較為復(fù)雜，與壓力大小、保壓時間、溫度以及溶液pH等相關(guān)[12]。已有的研究大多聚焦在超高壓對蛋白結(jié)構(gòu)以及其他理化性質(zhì)的影響上面，如溶解性、抗氧化活性等[9,13]。但是少有研究具體探究超高壓技術(shù)對WPI中致敏蛋白的影響方式和程度。對于超高壓對WPI致敏性影響的程度，十分有必要了解其在微觀和宏觀層面以及后續(xù)的胃腸道消化時，如何通過結(jié)構(gòu)的改變影響致敏性。

因此，本研究的目的是探究超高壓對于WPI結(jié)構(gòu)以及致敏蛋白含量的影響，降低WPI的致敏性。采用不同的超高壓力處理WPI，通過圓二色性光譜、內(nèi)源熒光光譜、巰基含量等的測定來評估超高壓對WPI二級、三級結(jié)構(gòu)的影響，并通過水解度、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-page)以及β-LG和α-LA含量的檢測來考察超高壓對WPI中致敏蛋白含量降解的影響，進而為超高壓技術(shù)應(yīng)用在低致敏性乳粉生產(chǎn)中提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

乳清分離蛋白(WPI,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.9%)，恒天然商貿(mào)(上海)有限公司；Ellmans′s試劑、tris-gly、乙二胺四乙酸，美國Sigma公司；β-乳球蛋白以及α-乳白蛋白檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司。其余試劑均為分析純。FPG7100 型高壓設(shè)備，德國 IKA 公司；SepectraMax M5酶標(biāo)儀，美國 Molecular Devices 公司；SPECORD-205 紫外分光光度計，德國Analytikjena公司；J815圓二色光譜儀，日本JASOC公司；PROTEAN3 電泳儀、Geldoc-XR+凝膠成像儀，美國 Bio-Rad 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超高壓處理

配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的WPI溶液，取適量溶液分裝于特制包裝袋中進行真空包裝，后置于超高壓壓力腔中，進行實驗。壓力條件為100、200、400和600 MPa，保壓時間20 min。以未經(jīng)壓力處理的WPI溶液作為對照。

1.2.2 圓二色性光譜分析

WPI樣品稀釋至200 μg/mL,加入到石英比色皿(光徑0.1 cm)中，置于圓二色光譜儀上進行檢測。掃描范圍190～250 nm，步長0.5 nm，掃描速度200 nm/min，并用CD Pro軟件擬合乳清蛋白中二級結(jié)構(gòu)的組成與含量[14-15]。

1.2.3 總巰基和表面巰基含量的測定

參考MAFORIMBO等[16]的方法，進行測定。表面巰基含量的測定：取200 μL的WPI樣品和1 mL的Tris-甘氨酸緩沖液(pH 8.0，含4 mmol/L的EDTA)混合，隨后加入20 μL的Ellman′s試劑(4 mg/mL)，室溫(25±2) ℃避光振蕩30 min后測定412 nm處的吸光度值，以僅加Ellman′s試劑為空白對照?？値€基含量的測定和表面巰基含量的測定方法一致，所使用的的緩沖溶液為含有4 mmol/L的EDTA、8 mol/L的尿素，pH 8的tris-gly緩沖溶液。

巰基(SH)含量的計算如公式(1)所示:

(1)

式中：A412，樣品在412 nm處的吸光值；D，樣品的稀釋倍數(shù)；C，WPI的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.4 內(nèi)源熒光光譜檢測

參考GINA等[17]的方法。把樣品稀釋到1 mg/mL，用酶標(biāo)儀進行色氨酸內(nèi)源性熒光分析。激發(fā)波長為280 nm，掃描300～400 nm的發(fā)射光譜。

1.2.5 超高壓對WPI降解情況分析

1.2.5.1 水解度的測定

根據(jù)SPELLMAN等[18]描述的方法，采用鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)法測定樣品的水解度，以L-絲氨酸溶液(0.1 g/L)作為標(biāo)準(zhǔn)品。按照文獻中描述的方法配置OPA溶液，取400 μL待測樣品加入到盛有3 mL OPA溶液的試管中，振蕩混勻5 s，避光反應(yīng)2 min，以去離子水作為空白對照。用紫外分光光度計測量樣品在340 nm處的吸光值。按照公式(2)計算水解度：

(2)

式中：ODsa，測得樣品的吸光度；ODb，測得空白對照的吸光度；ODst，測得標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度；X，樣品重量，g；P，樣品中蛋白質(zhì)的含量；0.1，樣品體積轉(zhuǎn)換成L。

1.2.5.2 SDS-page凝膠電泳

參考CARULLO等[6]的方法，不同壓力條件的WPI樣品(1 mg/mL)分別取樣進行SDS-page凝膠電泳。采用5%濃縮膠，15%分離膠，上樣量為8 μL。電泳初始電壓為100 V，待樣品進入分離膠時，調(diào)整電壓至150 V。樣品涌動至距凝膠底部0.5 cm時停止電泳。

1.2.5.3 β-LG以及α-LA含量的測定

根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法原理[19]測定樣品中β-LG以及α-LA的含量。將樣品稀釋至1 mg/mL,利用β-LG以及α-LA試劑盒檢測樣品中2種蛋白的含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

所有的實驗數(shù)據(jù)均由平行測定3次得到，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用Excel 2010以及SPSS Statistics 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，顯著水平設(shè)置為P<0.05，采用Origin Pro 2017對實驗數(shù)據(jù)進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 UHP對WPI二級結(jié)構(gòu)含量的影響

經(jīng)過圓二色性光譜擬合軟件對圓二色性光譜圖進行分析計算，得到WPI表面蛋白結(jié)構(gòu)隨不同的超高壓變化的情況，如表1所示。和對照組(0.1 MPa)相比，100 MPa組的二級結(jié)構(gòu)變化不明顯?？赡苁钱a(chǎn)生了結(jié)構(gòu)的回復(fù)，有研究顯示，在一定的壓力保壓一段時間后，在很短的時間內(nèi)，會回復(fù)到之前的狀態(tài)[20]。但到了200 MPa及以上，隨著壓力的增加，二級結(jié)構(gòu)含量的變化在P<0.05的水平下，較為顯著。具體表現(xiàn)為α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的顯著減少以及β-折疊和無規(guī)則卷曲的顯著增加，主要的原因可能是超高壓使維持蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵以及靜電作用減弱，導(dǎo)致部分α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為β-折疊結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的部分解體，蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，結(jié)果和MUNIZAGA等[21]和LI等[22]的結(jié)論一致，超高壓處理可以改變WPI的 α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲的含量，改變蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

圖1 不同UHP處理的WPI圓二色性光譜圖Fig.1 The circular dichroism spectrum of WPI in different UHP treatments

表1 不同UHP處理的WPI二級結(jié)構(gòu)含量Table 1 Secondary structure contents of WPI in different UHP treatments

2.2 UHP對WPI巰基含量的影響

巰基是蛋白質(zhì)中重要的功能基團之一，具有較高的生物活性，可與二硫鍵在巰基/二硫鍵氧化還原酶的催化下相互轉(zhuǎn)化，對蛋白質(zhì)三維構(gòu)象的穩(wěn)定性起著重要的作用。游離巰基含量的變化可以在一定程度上反映蛋白質(zhì)在外界作用下發(fā)生的去折疊或變性的情況[23-24]。而且，相關(guān)的研究顯示，蛋白質(zhì)的致敏能力與其結(jié)構(gòu)相關(guān)[1,25]。不同的UHP水平對WPI的表面巰基和總巰基的含量影響如圖2所示。與未經(jīng)過壓力處理的樣品相比，100 MPa就能使WPI的巰基含量顯著增加(P<0.05)，這是由于超高壓可以使蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象發(fā)生變化，使折疊的巰基暴露或破壞部分二硫鍵轉(zhuǎn)化為游離巰基。隨著壓力的逐漸增加，巰基含量也呈增加的趨勢，這和前人的研究一致[26]，從圖2也可以看出，超高壓對于表面巰基比總巰基的影響更大。400 MPa處理組，總巰基含量提高了25.92%，表面巰基提高了104.82%。而600 MPa組和400 MPa組對比不顯著，巰基含量的增量出現(xiàn)了減小的趨勢，可能的原因是在過高的壓力下,WPI可能發(fā)生了不可逆的變性，BELLOQUE等[27]的研究也表明了同樣的結(jié)果。

圖2 不同UHP處理的WPI總巰基和表面巰基含量Fig.2 Total and surface sulfhydryl contents of different UHP treatments on WPI

2.3 UHP對WPI內(nèi)源性熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)分子中的色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸能夠發(fā)射熒光，因此這3種氨基酸可以作為內(nèi)源性熒光探針來預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化情況[28-29]。從圖3 可以看出，超高壓處理導(dǎo)致WPI熒光強度以及最大吸收波長位置的變化。對照組和實驗組的最大熒光波長出現(xiàn)在331 nm附近。100、200以及400 MPa處理組熒光強度較對照組弱，隨著壓力的增大，熒光強度逐漸增強。600 MPa使得WPI的熒光強度顯著增強，這說明較高的壓力使得WPI內(nèi)部的疏水基團暴露，造成色氨酸殘基在WPI溶液中的暴露量發(fā)生改變。所有的實驗組均發(fā)生了較為明顯的紅移，這反映了WPI結(jié)構(gòu)中氨基酸側(cè)鏈的變化。YIN等[30]的研究也顯示超高壓處理增加色氨酸殘基在溶劑中的暴露，進而增加紅蕓豆分離蛋白的熒光強度。

圖3 不同UHP處理的WPI內(nèi)源熒光光譜Fig.3 Endogenous fluorescence spectra of WPI in different UHP treatments

2.4 UHP對WPI降解的影響

2.4.1 UHP對WPI水解度的影響

水解度可以作為評估蛋白質(zhì)分子質(zhì)量降解的一個指標(biāo)，蛋白分子質(zhì)量降解得越多，水解度越高[31]。故可以用水解度來評估WPI中致敏蛋白降解的程度。從表2可以看出，不同的壓力水平對WPI水解度的影響不顯著(P<0.05)。這表明超高壓對致敏蛋白的含量降解影響較小。這與CARULLO等[6]的結(jié)論一致，他的研究說明，超高壓處理對蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)影響較小。CHEN等[4]的研究也顯示了同樣的結(jié)果。

表2 不同UHP處理水平WPI的水解度Table 2 Enzymatic hydrolysis of WPI in different UHP treatments

2.4.2 UHP對WPI電泳特性的影響

經(jīng)過不同的UHP處理的WPI電泳圖譜如圖4所示，所有樣品分子質(zhì)量大都分布在14.4和18.4 kDa處，這是由于WPI的主要成分β-LG(約占WPI的50%)的分子質(zhì)量為18.3 kDa，α-La(約占WPI的25%)的分子質(zhì)量為14.2 kDa。此外還可見含量較少的牛血清白蛋白分布在66.2 kDa附近。從電泳圖中可以看出,處理組和對照組的條帶并無明顯差異，600 MPa以內(nèi)的超高壓水平對WPI的分子質(zhì)量的影響較小，未引起WPI的降解。

2.4.3 WPI中β-LG以及α-LA含量降解情況

β-LG和α-LA約占乳清蛋白的75%，是牛乳中主要的致敏成分，特別是β-LG，研究顯示大約有80%的牛乳過敏和β-LG相關(guān)[32]。故而利用ELISA原理，來具體檢測WPI中2種標(biāo)志性過敏蛋白β-LG以及α-LA的含量，其含量如表3所示。不同的超高壓水平對β-LG影響不同，400 MPa處理的時候還呈現(xiàn)了顯著增加。其原因可能是β-LG的結(jié)構(gòu)較為緊密，呈現(xiàn)球狀的結(jié)構(gòu)，400 MPa的壓力可以使WPI結(jié)構(gòu)打開，藏在結(jié)構(gòu)內(nèi)部的β-LG蛋白出現(xiàn)了一定程度的暴露，故而呈現(xiàn)增加的現(xiàn)象。壓力對α-LA含量的影響更大。其含量隨著壓力的增大呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能原因是α-LA在WPI中大多分布在外部，超高壓能夠顯著破壞α-LA中的二硫鍵等非共價鍵，從而造成α-LA含量的減少。

M-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-WPI；2-100 MPa，20 min；3-200 MPa，20 min；4-400 MPa，20 min；2-600 MPa，20 min圖4 不同UHP處理的WPI的SDS-page電泳圖譜Fig.4 SDS-page electrophoresis of different UHP treatments on WPI

表3 不同UHP處理水平WPI的β-LG和α-LA含量Table 3 Content of β-LG and α-LA in WPI under different UHP treatments

3 結(jié)論與討論

通過不同的超高壓力處理WPI，考察超高壓對WPI的結(jié)構(gòu)和標(biāo)志性致敏蛋白含量的影響。相比于對照組，100 MPa及以上的壓力可以使WPI的表面巰基和總巰基含量顯著上升(P<0.05)，而到400 MPa后和更高的壓力相比差異不顯著(P>0.05)，這表明，一定的壓力可以使WPI的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而增加了巰基的暴露量。內(nèi)源性熒光檢測的結(jié)果也表示了同樣的結(jié)論，超高壓處理組的熒光強度發(fā)生顯著變化，這表明，超高壓處理造成了WPI中色氨酸殘基的變化。而對于WPI的二級結(jié)構(gòu)，本研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理對WPI的二級結(jié)構(gòu)影響較為顯著，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化為β-折疊和無規(guī)則卷曲，蛋白的結(jié)構(gòu)變松散。超高壓處理對WPI的水解度以及電泳圖譜的影響較小，說明超高壓并不能顯著改變WPI的一級結(jié)構(gòu)及含量。但是對于β-LG以及α-LA的含量進行分析卻發(fā)現(xiàn)，超高壓可以顯著影響到這2種致敏蛋白的含量，具體來說是在400 MPa時，β-LG出現(xiàn)最大程度的暴露，而α-LA的含量卻是隨著壓力的增大呈現(xiàn)顯著減少的趨勢，其原因可能是超高壓對于WPI結(jié)構(gòu)一定程度的破壞造成的。故由上述可得出的結(jié)論為，超高壓對WPI的一級結(jié)構(gòu)影響較為輕微，但可以顯著改變二級和三級結(jié)構(gòu)，進而對β-LG和α-LA的致敏性造成影響。但是，對其中致敏蛋白的總量影響較小，而且在致敏蛋白的致敏性影響方面，還造成了β-LG含量增大的現(xiàn)象。因此若想通過單純的超高壓技術(shù)處理WPI不能降低WPI的致敏性。但通過此技術(shù)作為前處理，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)打開，繼而采用酶解技術(shù)處理WPI，則能提高酶解的作用效果，從而有利于生產(chǎn)低致敏性的乳制品。