脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠模型的構(gòu)建及評價*

朱夢夢，王立鑫，封若雨，張澤家，趙天賜，葛少欽△

(1. 河北大學，河北 保定 071002； 2. 徐州礦務(wù)集團總醫(yī)院，江蘇 徐州 221006)

肥胖癥在臨床根據(jù)病因可分為單純性和繼發(fā)性肥胖，其中占95%的單純性肥胖因沒有明顯的原發(fā)病而成為臨床研究的難點[1]。中醫(yī)將單純性肥胖分為脾虛濕阻型、胃熱濕阻型、肝郁氣滯型、脾腎陽虛型、陰虛內(nèi)熱型，其中脾虛濕阻型肥胖在臨床上較常見[2-4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導的雄性肥胖小鼠與正常小鼠比較體質(zhì)量增加明顯，血清中瘦素、胰島素及血脂水平顯著增高，葡萄糖耐量異常，但尚未構(gòu)成糖尿病等代謝性疾病，系單純性肥胖。鑒于目前實驗性肥胖動物模型缺乏證候的關(guān)聯(lián)性資料，為復制出符合中醫(yī)證型的肥胖動物模型，進一步探討中醫(yī)藥治療肥胖的機制等，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，以高脂飲食加水濕墊料因素構(gòu)建脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠模型，依據(jù)中醫(yī)脾虛濕阻證的表征，觀察小鼠是否出現(xiàn)肢體痿軟困重、胸脘脹滿、納差食少、怠惰便溏等現(xiàn)象[5]，并結(jié)合小鼠每日進食量、飲水量、糞便含水量、疲勞乏力等情況為依據(jù)進行篩選及癥狀評分，再以小鼠的血糖血脂水平、脂肪體積、葡萄糖耐量以及胰島素抵抗現(xiàn)象等對脾虛濕阻單純性肥胖小鼠模型進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL / 6 N小鼠3周齡100只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0006。隨機分為正常組和模型組2組，正常組20只，模型組80只。本實驗已通過河北大學實驗動物倫理委員會審查。

1.1.2 試劑與儀器 疲勞轉(zhuǎn)棒儀(成都泰盟科技有限公司)，全自動生化儀(7600-110，日本日立有限公司)，Quantum FX micro-CT(PerkinElmer)，50%葡萄糖注射液(石家莊四藥有限公司，中國)，胰島素注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團有限責任公司，中國)，血糖試紙、血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法及篩選 小鼠在河北大學SPF級實驗動物中心適應性飼養(yǎng)1周后，隨機抽取20只作為正常對照組，采用普通飼料喂養(yǎng)，另80只以高脂飼料喂養(yǎng)3周后，自第4周增加水濕墊料因素(50 g墊料加水100 ml)，共造模10周。造模期間觀察小鼠的生理狀態(tài)并記錄，每周固定時間稱量2組小鼠體質(zhì)量，體質(zhì)量增加>20.0%的可初步判定為肥胖。造模10周后測量小鼠體長和腰圍，根據(jù)公式計算各組小鼠的Lee’s指數(shù)：Lee’s指數(shù)=體質(zhì)量1/3(g)/體長(cm)×103。

生理狀態(tài)記錄：根據(jù)脾虛濕阻證的表征觀察肥胖小鼠是否出現(xiàn)萎靡、倦怠、反應遲純、瞇眼、嗜睡、毛色散亂不潔、小便色黃而少以及大便量少黏膩等現(xiàn)象。

疲勞乏力實驗：將小鼠放在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上，通過疲勞乏力檢測系統(tǒng)，記錄2組小鼠3 min內(nèi)在轉(zhuǎn)棒儀上運動站立的時長，運動站立時長小于正常組1倍標準差者定義為乏力鼠。

每日進食量、飲水量：給小鼠投喂飼料和水的過程中，提前稱量飼料克數(shù)，量取水的體積并做好記錄。每日早晨8∶00量取剩余水的體積，稱取鼠籠食盒中剩余食物量。每日進食量、飲水量明顯小于正常小鼠者，定義為食少納呆鼠。

糞便含水量：每周定期采集2組小鼠3 h內(nèi)的新鮮糞便，稱取糞便濕重，于80 ℃、7h條件下烘干糞便稱重，計算糞便的含水量：糞便含水量=(糞便濕重-糞便干重) /糞便濕重。糞便含水量高于正常小鼠的定義為便溏鼠。

造模篩選指標及癥狀評分：①行為：倦怠 (無0分，有1分)，扎堆(無0分，有1分)，嗜臥(無0分，有1分)，動作緩慢(輕度緩慢1分，重度2分)，動作緩慢判斷指標包括懸空拉尾抵抗力弱(2分)； ②精神狀態(tài)：正常0分，萎靡(1分)，常瞇眼(1分)，反應遲鈍(2分)；③毛發(fā)、耳尾及肛門部：毛發(fā)耳尾肛門均正常0分，毛發(fā)稀疏(1分)，枯黃無光澤 (2分)，耳尾血色淡(1分)；④排便：正常0分，大便稀溏、便軟不成形(1分)或瀉下如水樣(2分)；⑤造模5周后，正常0分，大鼠進食量少(1分)，體質(zhì)量增長緩慢或下降(2分)；⑥體溫下降，數(shù)字式醫(yī)用遠紅外熱成像儀觀察動物遠紅外輻射的溫度變化(一般1分，明顯2分)；⑦舌體胖大質(zhì)淡苔白滑(質(zhì)正常淡紅無苔0分，淡紅有薄苔1分)。

造模組體質(zhì)量增加>20.0%，且篩選指標及癥狀評分≥10分者，定為脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠。

1.2.2 檢測指標

(1)葡萄糖耐量實驗(glucose tolerance test, GTT)：對小鼠禁食不禁水12 h后，依據(jù)每只小鼠體質(zhì)量(4ul/g)腹腔注射濃度50%的葡萄糖溶液，分別于第 0、30、60、90、120分鐘時剪小鼠尾尖的一部分獲得靜脈血，隨即用血糖試紙測量并記錄血糖值。

(2)胰島素抵抗實驗(intraperitoneal insulin tolerance test, ITT)：對小鼠禁食不禁水6 h后，依據(jù)每只小鼠體質(zhì)量(0.75 IU/g)腹腔注射胰島素溶液，分別于第 0、30、60、90、120分鐘剪小鼠尾尖的一部分獲得靜脈血，隨即用血糖試紙測量并記錄血糖值。

(3)小動物CT成像(micro-CT)：實驗采用mirco-CT檢測并計算小鼠皮下、腹部和內(nèi)臟脂肪的分布及總體積。將小鼠進行麻醉但不致死，固定于鼠床上，采用高分辨率模式進行掃描檢測2組小鼠的脂肪分布。將掃描所得的投影數(shù)據(jù)進行重建并導入分析軟件，選取參照點調(diào)整密度區(qū)間，屏幕內(nèi)只留下脂肪密度的部分并染色，然后根據(jù)各個層面進行疊加計算得出總的脂肪體積。

(4)小鼠臟器濕重及臟器系數(shù)：用1%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠，眼球取血之后立即解剖， 迅速摘除肝臟、脂肪等組織，電子天平稱重并記錄數(shù)據(jù)。計算臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=(器官質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%。組織存放于-80 ℃冰箱備用。

(5)血清生化測定：采用全自動生化儀檢測小鼠血清中葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠生理狀態(tài)比較

圖1示，正常組小鼠毛色順滑，比較活躍，反應靈敏；而脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠則出現(xiàn)毛色散亂不潔、萎靡、倦怠、反應遲鈍和抱團現(xiàn)象。

圖1 2組小鼠的生理狀態(tài)圖

2.2 小鼠體質(zhì)量、體長、腰圍及Lee’s指數(shù)比較

表1示，模型組小鼠的體質(zhì)量、體長、腰圍和Lee’s指數(shù)都高于正常組(P<0.01)。

表1 小鼠體質(zhì)量、體長、腰圍及Lee’s指數(shù)比較

2.3 小鼠每日飲食量、飲水量比較

表2示，模型組小鼠的每日飲食量、飲水量都低于正常組(P<0.01)，符合食少納呆的中醫(yī)證型。

表2 2組小鼠每日飲食量、飲水量比較

2.4 小鼠糞便含水量、疲勞乏力比較

表3示，模型組小鼠的糞便含水量高于正常組(P<0. 01)。圖2示，與正常組比較，模型組小鼠的糞便黏膩呈水樣狀，符合便溏的中醫(yī)證型；模型組小鼠在規(guī)定的3 min 內(nèi)，其運動站立時間低于正常組(P<0.01)。

表3 2組小鼠糞便含水量及疲勞乏力比較

圖2 2組小鼠糞便狀態(tài)圖

2.5 2組小鼠脂肪體積以及分布情況

表4示，模型組小鼠腹部、皮下和內(nèi)臟的脂肪總體積高于正常組(P<0.01)。圖3示，2組小鼠的整體脂肪分布，模型組小鼠的皮下、腹部和內(nèi)臟脂肪明顯多于正常組。

注：黃色代表脂肪，白色代表其他組織；A4是由A1、A2、A3合成的正常小鼠脂肪分布立體圖，A1是上切面圖，A2是正切面圖，A3是側(cè)切面圖；B4是由B1、B2、B3合成的模型組小鼠脂肪分布立體圖，B1是上切面圖，B2是正切面圖， B3是側(cè)切面圖

表4 2組小鼠脂肪總體積比較

2.6 2組小鼠不同部位脂肪組織濕重及系數(shù)比較

表5示，模型組小鼠的睪周、腎周和皮下脂肪組織濕重和系數(shù)明顯高于正常組小鼠(P<0.01)。

表5 2組小鼠不同部位脂肪組織濕重及系數(shù)比較

2.7 2組小鼠的葡萄糖耐量結(jié)果

圖4示，2組小鼠的空腹血糖水平均在正常范圍之內(nèi)(7.0～11.5 mmol/L)，但模型組高于正常組(P<0.01)。正常組小鼠的血糖在30 min時升到最高，然后開始下降，2 h內(nèi)基本恢復至之前濃度；而模型組小鼠的血糖水平急劇升高，30 min時升到最高，并在每個檢測時間節(jié)點血糖值都高于正常組(P<0.01)，2 h內(nèi)不能恢復至之前濃度，但也下降到正常范圍之內(nèi)。

圖4 2組小鼠 GTT 實驗中血糖變化比較

2.8 2組小鼠的胰島素抵抗結(jié)果

圖5示，2組小鼠的空腹血糖水平均在正常范圍之內(nèi)(7.0～11.5 mmol/L)，但模型組明顯高于正常組(P<0.01)，正常組小鼠的血糖在60 min時降到最低，然后開始回升，2 h內(nèi)基本恢復至之前濃度；而模型組小鼠的血糖水平在30 min時降到最低，然后開始回升，并在每個檢測的時間節(jié)點血糖值都高于正常組(P<0.01)，2 h內(nèi)不能恢復至之前濃度。

圖5 2組小鼠 ITT實驗中血糖變化比較

2.9 2組小鼠血糖血脂水平比較

表6示，模型組小鼠血糖水平高于正常組(P<0.01)，但其血糖水平仍在正常范圍內(nèi)(7.0～11.5 mmol/L)；模型組小鼠的血脂水平也高于正常組小鼠(P<0.01)。

表6 2組小鼠血糖血脂水平比較

3 討論

依據(jù)中醫(yī)理論，肥胖存在多種中醫(yī)證候，然而中醫(yī)治療肥胖的證候模型仍然面臨辨證與體征測試等多方面困難[6]。成功建立中醫(yī)證候模型關(guān)鍵的步驟就是對模型進行評價，一個完善的模型評價體系是極其重要的，只有模型評價成功，才能更好地進行后續(xù)研究。課題組在參閱分析大量文獻[7-9]的基礎(chǔ)上，決定采用“飲食不節(jié)、水濕勞倦”2種傳統(tǒng)中醫(yī)復合因素，構(gòu)建脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠模型并對其進行評價，為中醫(yī)藥治療肥胖奠定基礎(chǔ)。

本研究按照常規(guī)喂養(yǎng)高脂飼料構(gòu)建肥胖模型的基礎(chǔ)上加入水濕復合因素，構(gòu)建脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠模型。實驗結(jié)果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)10周后，模型組小鼠體質(zhì)量比正常組平均增長47.06%，若以體質(zhì)量增加20.0%作為肥胖標準，實驗中脾虛濕阻肥胖小鼠已達到肥胖標準。使用疲勞轉(zhuǎn)棒儀檢測小鼠的疲勞乏力情況，結(jié)果顯示脾虛濕阻肥胖小鼠在規(guī)定的3 min 內(nèi)運動站立時間低于正常組2倍以上，表明模型組小鼠出現(xiàn)神疲乏力的情況，亦表明神疲乏力的中醫(yī)證型復制成功。其次，正常組小鼠的每日進食量、飲水量相對穩(wěn)定，而模型組小鼠長時間攝入高脂飲食(高脂飼料富含大量油脂、蛋白質(zhì)、高糖)會導致腸胃吸收功能減弱，飲食量、飲水量明顯低于正常組小鼠，并開始出現(xiàn)不思飲食、食少納呆的癥狀，這與中醫(yī)的脾虛證候類似。在造模過程中時常見到部分小鼠有軟便或者稀便的出現(xiàn)，通過檢測2組小鼠的糞便含水量發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的糞便含水量高于正常組小鼠，符合中醫(yī)脾虛濕阻證型中的大便量少黏膩或溏的現(xiàn)象。經(jīng)對小鼠行為、精神狀態(tài)等進行賦分以及對體質(zhì)量、飲食量、飲水量、糞便含水量和疲勞乏力等比較，結(jié)果顯示造模組小鼠的體質(zhì)量增加>20.0%，且癥狀評分≥10分的脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠造模成功率為81.25%，然后再進一步對模型進行評價。

肥胖常用的評價指標有體質(zhì)量、體脂和血糖血脂等，其中體質(zhì)量為直觀指標，體脂是評價肥胖的最確切指標。使用micro-CT觀察小鼠脂肪分布，計算體內(nèi)脂肪總體積，結(jié)果顯示模型組小鼠的脂肪體積大于正常組。圖3示，模型組小鼠的脂肪分布明顯多于正常組，再結(jié)合模型組小鼠的脂肪組織濕重及系數(shù)大于正常組，能更進一步顯示脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠的體脂含量顯著增高?！端貑枴て娌≌撈吩唬骸胺蛭逦度肟冢赜谖?，脾為之行其精氣”[10]，指出脾的功能是運化津液和水谷精氣，血糖、甘油三酯及總膽固醇等作為體內(nèi)水谷精微的重要組成部分，在脾虛時會出現(xiàn)轉(zhuǎn)化輸布障礙，因此血糖血脂往往作為靶向物質(zhì)進行研究[11-12]?；诖?，本研究通過檢測2組小鼠的血糖血脂水平并對小鼠進行葡萄糖耐量與胰島素抵抗實驗，結(jié)果表明脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠的GLU、TC、TG、HDL、LDL和VLDL水平均高于正常組，并伴隨著葡萄糖耐量異常及胰島素抵抗的現(xiàn)象，這種結(jié)果表明脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠脾的生理功能發(fā)生了異常，其脾運化水谷精微功能發(fā)生障礙，導致無法將其吸收的水谷精微正常轉(zhuǎn)輸?shù)叫姆渭巴ㄟ^肺的宣發(fā)肅降布散濡養(yǎng)全身。

綜上所述，本研究構(gòu)建脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠模型的操作方法簡單，造模條件量化可控，造模周期相對較短，模型基本穩(wěn)定，并且從中醫(yī)證型角度出發(fā)，在單純性肥胖模型復制成功的基礎(chǔ)上篩選出符合脾虛濕阻證的肥胖小鼠并進行了評價，為中醫(yī)藥治療肥胖癥的臨床研究提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)，也為課題組后續(xù)探討中藥方劑治療脾虛濕阻型單純性肥胖小鼠的藥效及作用機制奠定了基礎(chǔ)。但在本研究中所用造模動物較單一，評價體系也尚待完善，今后可以增加胃腸功能、免疫功能、水液代謝功能等功能性指標，進一步評價脾虛濕阻型單純性肥胖動物模型。