訓練犬檢測肺癌的影響因素研究

趙勤濤 熊玉強 蘆 帥 于 毅 毛嘉禾 張建華 葛 崢

為了檢驗吸煙人群的呼出氣體、醫(yī)院環(huán)境氣味和訓練方法對嗅癌犬訓練的影響，本研究以肺腺癌為試驗對象，以患者的呼出氣體為嗅源，選擇3頭2歲的馬里努阿犬作為訓練用犬，采集了36例肺腺癌患者的樣本和108例含有不同干擾氣味的健康人群樣本，分5組分別測試了在無干擾氣味、吸煙氣味和醫(yī)院環(huán)境氣味條件下犬對肺癌氣味反應的特異度和靈敏度，同時測試了在無陽性樣本的情況下，犬的示警反應情況，以及對吸煙氣味和醫(yī)院環(huán)境氣味的反應。結(jié)果表明，在沒有吸煙氣味和特定環(huán)境氣味干擾的情況下，3頭犬對肺腺癌氣味檢測的平均靈敏度和特異度達到了97.2%和99.6%，在吸煙和醫(yī)院環(huán)境氣味條件下，檢測的靈敏度和特異度分別83.3%和97.6%、88.9%和98.4%，A、B、C3組之間差異不顯著，但在空白測試條件下，犬更傾向于對吸煙氣味和醫(yī)院環(huán)境氣味反應。說明犬能識別肺腺癌患者呼出的氣味，吸煙氣味、醫(yī)院環(huán)境氣味和否定式的訓練方法對嗅癌犬的訓練有影響。

一、嗅癌犬的研究背景

近年來，越來越多的試驗證據(jù)表明經(jīng)過訓練的犬可以通過嗅聞癌癥患者的血液、呼出氣體或體液氣味來識別癌癥，并表現(xiàn)出了較高的靈敏度和特異度。使用載體吸附氣味對宮頸癌的研究顯示，犬可以準確識別子宮頸細胞涂片樣本和吸附材料樣本中的癌癥氣味，總體檢測的成功率達到90%以上，使用尿液樣本區(qū)分前列腺癌的靈敏度和特異度均達到91%，使用呼出氣體樣本區(qū)分直腸癌的靈敏度和特異度達到了91%和99%，顯著高于常規(guī)腸鏡檢測的靈敏度。Horvath等人以不同部位的癌癥樣本（卵巢、子宮頸、子宮體及會陰部）和健康人群的樣本為試驗材料，采用雙盲法用一頭經(jīng)過訓練的犬對卵巢癌樣本進行識別，結(jié)果顯示，犬對卵巢癌樣本的靈敏度和特異度分別達到了100%和97.5%，并且該研究暗示不同部位的癌癥有著不同的特殊氣味。使用氣相色譜和質(zhì)譜(GC/MS)對癌癥患者呼出氣體的揮發(fā)性有機物（VOCs）標記篩查的研究也證實不同的癌癥之間有特異度的VOCs。在犬識別肺癌上的研究同樣取得了積極效果，有研究使用分別來源于113個不同人的390個樣本進行檢測，犬檢測的靈敏度和特異度分別達到了95%和98%，使用血液樣本對肺癌的研究也顯示犬識別的靈敏度和特異度達到了96.7%和97.5%。但是在不同的研究結(jié)果之間表現(xiàn)出了較大的差異，Hackner等人采用隨機樣本測試的方法對122個肺癌病人的樣本進行檢測發(fā)現(xiàn)，其陽性預測值和陰性預測值分別是30.9%和84%，Ehmann等人對肺癌的研究也發(fā)現(xiàn)，其總體靈敏度和特異度只有71%和93%，這些數(shù)據(jù)遠低于其他對肺癌研究的結(jié)果。同樣的情況也發(fā)生在了對其他癌癥的研究上。這說明利用犬的嗅覺進行癌癥氣味的特異度識別還存在著諸多干擾因素，比如吸煙、飲食情況、醫(yī)院環(huán)境下特有的氣味等干擾氣味，以及犬種、訓練方法、不同的統(tǒng)計方法等方面是否會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，目前尚未有研究對這些問題進行測試。

為了研究影響嗅癌犬訓練和檢測結(jié)果的因素，本文以肺腺癌患者為研究對象，以患者呼出的氣味為檢測樣本，選擇公安部南昌警犬基地3頭2歲的搜爆犬作為訓練用犬，研究吸煙氣味、醫(yī)院環(huán)境氣味和訓練方法因素對嗅癌犬訓練和對肺癌氣味識別的影響，為嗅癌犬的訓練和研究提供參考。

二、材料和方法

（一）試驗材料

1.試驗用犬

本研究從公安部南昌警犬基地選擇3頭2歲的馬里努阿犬作為訓練用犬，分別編號為1號犬、2號犬和3號犬。其中公犬2頭（1號和3號），母犬1頭（2號），1號和2號犬曾進行過3個月的搜爆訓練，3號犬進行過3個月的搜毒訓練。

2.試驗對象

以肺腺癌患者為研究對象，以紗布吸附的人呼出氣體作為犬的嗅源。本試驗共采集36例肺腺癌患者樣本，36例不吸煙的但含有醫(yī)院特定環(huán)境氣味的健康人群樣本，36例不吸煙也不含醫(yī)院環(huán)境氣味的健康人群樣本和36例吸煙但不含醫(yī)院特定環(huán)境氣味健康人群樣本，每例樣本采集3份，共采集144個不同人的432份樣本。因為30歲以下惡性腫瘤的發(fā)病率相對較低，本試驗所采集的健康對照樣本均是30周歲以下的青年人樣本。具體采樣信息見表1。

3.樣本采集方法

將3層紗布塊放入口罩中，把紗布對準口鼻腔戴上口罩5分鐘，5分鐘后取出紗布放入采集瓶中，蓋緊瓶蓋，然后用封口膜封住瓶蓋縫隙，將樣品放入-20℃的冰箱中凍存（見圖1）。采集樣本使用的采集瓶由義烏市龍川玻璃制品有限公司生產(chǎn)；吸附呼出氣體氣味所使用的紗布（規(guī)格7.5×7.5cm）由紹興振德醫(yī)用敷料有限公司生產(chǎn)；比克曼生物提供的無菌采樣袋；口罩使用的是江西國康實業(yè)有限公司生產(chǎn)的單個裝醫(yī)用無菌外科口罩。

（二）試驗方法

1.犬的訓練方法

利用犬的食物動力、捕獵動力和探求反射，采用操作式條件反射和正強化的方法對3頭犬進行訓練，歷時7周，每周訓練7～12次，訓練過程中所使用的對照組樣本均是不吸煙、不含醫(yī)院環(huán)境氣味的健康人的飯前樣本，訓練形式見圖2。

第1周訓練犬對肺癌氣味的興奮性反應，使用8個鑒別罐，其中7個罐子是空的，1個罐子里放入目標物氣味，當犬重嗅目標物后對其進行食物獎勵。

第2周訓練犬對紗布氣味的干擾，使用8個鑒別罐，其中7個罐子里放無人體氣味的紗布，1個罐子里放入目標氣味，讓其從8個罐子里找到目標物氣味并“坐下”示警，然后給予食物獎勵。

第3～4周訓練犬從不同的人體氣味中識別目標氣味，使用8個鑒別罐，其中7個罐子里放入含有不同人的呼出氣味的紗布作為對照組，1個罐子里放入目標氣味，另外使用1個鑒別罐放入和目標物氣味相同的氣味作為嗅源，先讓犬聞嗅源，給予食物獎勵，然后再讓其從8個鑒別罐中找出與嗅源相同的目標氣味。

第5周訓練犬從不同的目標氣味中找到共性的氣味。訓練方式同上，但使用的嗅源氣味與目標氣味是來源于不同的肺腺癌患者，對犬進行分化訓練。

第6～7周的訓練去掉嗅源，直接讓犬進行搜索。使用8個鑒別罐，隨機放置7個對照樣本和1目標樣本，強化犬對肺癌氣味的聯(lián)系。

圖2 犬的訓練方法

2.試驗測試方法

本試驗的測試共分為5組，測試所使用的樣本均是未使用過的新采集的樣本。所有的測試都采用“雙盲法”進行。

A組:使用12個肺癌氣味樣本和36個無特定氣味樣本。

B組:使用12個肺癌氣味樣本和36個吸煙但不含醫(yī)院環(huán)境氣味的樣本。

C組:使用12個肺癌氣味樣本和36個不吸煙但含醫(yī)院環(huán)境氣味的樣本。

A、B、C組測試的目的是測試3頭犬在無特定氣味和吸煙氣味、醫(yī)院環(huán)境氣味干擾的條件下犬對肺腺癌檢測的靈敏度和特異度，測試醫(yī)院環(huán)境氣味和吸煙氣味對嗅癌犬訓練的影響；按照上述犬的訓練方法，每組放8個鑒別罐，其中1個是目標氣味，7個是對照樣本，每組每頭犬分別測試12次。

為了進一步測試兩種干擾氣味和空白訓練對嗅癌犬的訓練的具體影響，本文設計了D、E兩組測試，以吸煙氣味或含有醫(yī)院環(huán)境氣味的健康樣本作為目標物，無特定氣味的樣本作為對照，每組分為6次測試，每次測試有7個對照樣本和1個目標樣本組成。

D組:使用6個吸煙但不含醫(yī)院環(huán)境氣味的樣本和36個無特定氣味樣本。

E組:使用6個不吸煙但含醫(yī)院環(huán)境氣味的樣本和36個無特定氣味樣本。

（三）數(shù)據(jù)處理方法

為了評估犬的嗅覺檢測肺癌氣味的能力，使用Excel程序文件計算了檢測的靈敏度和特異度。同時，為了確定3頭犬在不同條件下對肺癌檢測結(jié)果的統(tǒng)計學差異，采用獨立樣本t檢驗計算統(tǒng)計學顯著性(P-value)。

靈敏度=檢測陽性數(shù)/（檢測陽性數(shù)+假陰性數(shù)）×100%；

特異度=檢測陰性數(shù)/（檢測陰性數(shù)+假陽性數(shù)）×100%。

三、結(jié)果

由表2和表3的結(jié)果顯示，A組犬檢測肺癌陽性的表現(xiàn)最好，靈敏度和特異度平均值分別達到了97.2%和99.6%，C組次之，分別達到88.9%和98.4% ，B組分別達到83.3%和97.6%，總和靈敏度達到89.8%，特異度達到98.5%。差異性顯著性分析顯示，A、B、C三組之間檢測的平均特異度和靈敏度差異不顯著。同時從表2結(jié)果可以看出，三組測試中犬檢測的靈敏度和特異度均高于概率值，說明犬有能力識別肺癌氣味。

表2 3頭犬在不同條件下的檢測結(jié)果

通過D組和E組的試驗發(fā)現(xiàn)，在空白測試的情況下犬會產(chǎn)生示警反應，在兩種氣味干擾的情況下，犬示警的次數(shù)分別為11次和9次，示警的比例分別是61.1%和50%。犬對吸煙氣味和醫(yī)院環(huán)境氣味示警反應總次數(shù)分別為9次和8次，示警反應的比率分別為50%和44.4%，均高于概率值。同時，吸煙氣味和醫(yī)院環(huán)境氣味示警的次數(shù)占總示警次數(shù)的比率分別為81.8%和88.9%。這一結(jié)果說明吸煙氣味和醫(yī)院環(huán)境氣味對嗅癌犬的訓練會產(chǎn)生影響。同時結(jié)果暗示進行空白訓練的必要性。

表3 空白測試條件下犬的示警反應情況

四、討論

（一）經(jīng)過訓練的犬可以通過特異度識別肺腺癌氣味

近年來，越來越多的試驗證據(jù)表明經(jīng)過訓練的犬可以通過嗅聞癌癥患者的血液、呼出氣體或體液氣味來識別癌癥，并取得了積極效果。Rudnicka等人使用呼出氣體作為嗅源對肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，犬對肺癌患者氣味識別的靈敏度和特異度分別為86%和72%，高于使用色譜法（GC-MS）檢測的靈敏度和特異度。本研究使用36個不同患者的呼出氣體樣本，經(jīng)過108次測試，結(jié)果顯示犬對肺腺癌檢測的靈敏度和特異度分別為89.8%和98.5%，說明肺腺癌患者的呼出氣體中含有獨特的氣味，經(jīng)過訓練的犬可以特異度識別這種肺腺癌氣味。這一結(jié)論得到了來自GC-MS對呼出氣體分析的支持，對呼出氣體標記物的研究認為不同的癌癥有著不同的代謝物，肺癌患者的癌細胞代謝出的揮發(fā)性有機物（VOCs）使呼出氣體有著獨特的氣味，Phillips博士等人根據(jù)呼出氣體成分在色譜儀上峰值分布區(qū)域所占的比例不同，發(fā)現(xiàn)22種VOCs在肺癌和非肺癌之間存在差別，即使在I期肺癌也有較高的靈敏性和特異度，分別為66.7%和100%。Wang使用23種VOCs標記物從對照組中區(qū)分肺癌患者的靈敏度和特異度是96.5%和97.5%，這充分說明肺癌的代謝有其獨特的氣味。

（二）吸煙氣味和醫(yī)院環(huán)境氣味對犬檢測肺癌準確性的影響

影響嗅癌犬訓練的干擾氣味因素很多，其中吸煙氣味和醫(yī)院環(huán)境氣味被認為是最重要的兩個因素。有研究通過對比混雜吸煙氣味后犬檢測癌癥的靈敏度和特異度發(fā)現(xiàn)，吸煙氣味對犬檢測的靈敏度和特異度沒有顯著影響。而本研究通過對比在無干擾氣味和另外兩種干擾氣味存在的條件下犬嗅診肺癌的準確性發(fā)現(xiàn)，雖然在干擾氣味存在的條件，犬檢測的靈敏度沒有顯著差異，但是在空白測試過程中，犬更傾向于對吸煙氣味和醫(yī)院環(huán)境氣味兩種干擾氣味產(chǎn)生示警反應，說明這兩種氣味對嗅癌犬的訓練有負面影響，這一結(jié)果與Walczak的研究結(jié)果一致。產(chǎn)生這種差異可能是因為肺癌患者中吸煙的優(yōu)勢比高于不吸煙人群，在嗅癌犬的訓練過程中，吸煙氣味獲得了更多的正強化機會。

由于犬訓練過程中使用的目標氣味樣本大多來自腫瘤醫(yī)院的癌癥確診患者，因此醫(yī)院環(huán)境中所特有的消毒液和醫(yī)藥的氣味被認為是一種潛在的干擾氣味。有研究表明，在醫(yī)院外面采集患者的呼出氣體可以顯著降低犬示警的優(yōu)勢比，在醫(yī)院外采集樣本犬檢測的準確性更高，而在醫(yī)院內(nèi)采集樣本時犬更容易出現(xiàn)假示警。本研究通過對比犬在無氣味干擾和在醫(yī)院氣味干擾條件下犬檢測的準確性發(fā)現(xiàn)，醫(yī)院氣味對犬檢測的靈敏度和特異度雖然沒有顯著影響，但表3的結(jié)果暗示，犬可能將醫(yī)院環(huán)境氣味和肺癌氣味作為一個整體的混合氣味進行記憶，從而使醫(yī)院氣味對訓練過程產(chǎn)生干擾。因此在嗅癌犬的訓練過程中，需要采取必要措施防范醫(yī)院環(huán)境氣味對犬的干擾。

（三）訓練方法對檢測結(jié)果的影響

不同的訓練方法可能對犬檢測肺癌的靈敏度和特異度有顯著影響。通過表2可以看出，吸煙氣味對犬檢測肺癌的靈敏度和特異度沒有顯著影響，但表3的結(jié)果表明，在沒有目標物存在的情況下，犬可能會對熟悉的氣味產(chǎn)生反應，甚至對醫(yī)院環(huán)境氣味反應的靈敏度達到了100%。這一結(jié)果暗示否定式訓練在嗅癌犬訓練過程中的必要性，即在一組測試中沒有目標氣味樣本，犬不能對其中任何一個樣本反應。一次訓練中必有1個目標氣味樣本的“強迫示警”的訓練方法，會造成檢測結(jié)果的靈敏度高于正常值，以及假陽性率的升高。因為在正常的肺癌檢測過程中，即使是對經(jīng)過其他醫(yī)學方法檢測過的可疑樣本進行復檢，癌癥患者的比例依然很低，甚至在一組檢測中沒有癌癥樣本，而“強迫示警”的方法會使犬在找不到目標物的情況下對其他樣本產(chǎn)生示警反應，導致假陽性率的升高，這一結(jié)果與Hackner等人對肺癌的研究結(jié)果一致。除此之外，樣本呈線性設計的訓練方法同樣會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。在一次訓練中，犬對樣本的反應會呈現(xiàn)以下幾種狀態(tài)：對目標樣本的正確指示、對對照樣本的假示警以及對不確定樣本的猶豫狀態(tài)。當一組線性排列的8個樣本中，如果是隨機陽性樣本（陽性樣本數(shù)0～8個）設計，犬對每個樣本產(chǎn)生示警反應的概率均為50%，若是確定只有1個陽性樣本，犬對陽性樣本示警的概率則為20%。在“強迫示警”的條件下，呈線性排列的一組樣本，隨著犬逐步排除對照樣本，犬對后面的樣本反應的概率逐步提高，造成假示警的概率升高。

五、小結(jié)

本研究結(jié)果表明，肺腺癌患者的呼出氣體中含有獨特的氣味，經(jīng)過訓練的犬可以特異度識別這種肺腺癌氣味，同時吸煙氣味、醫(yī)院環(huán)境氣味和訓練方法均會對嗅癌犬的訓練產(chǎn)生影響。在后期嗅癌犬的訓練過程中，需要采取措施排除干擾氣味對檢測結(jié)果的影響，完善訓練方法，以期獲得更好的結(jié)果。