臘腸發(fā)酵過程中細菌多樣性評價及其對風味的影響

郭 壯，王玉榮，葛東穎，尚雪嬌，張振東，趙慧君

（湖北文理學院，湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053）

臘腸作為我國傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的典型代表，因其風味獨特、口感醇厚和特有的“臘香味”而深受人們的喜愛[1-2]。傳統(tǒng)臘腸的制作方法一般較為簡便，以豬肉為主要原料，將其絞碎后拌入食鹽、香辛料、白糖和酒等輔料腌制一段時間后灌入腸衣，經(jīng)微生物發(fā)酵制作而成[3]。研究表明，臘腸制品的好壞與臘腸中的細菌構成和動態(tài)變化有著緊密的聯(lián)系[4]。Pasini等[5]發(fā)現(xiàn)以乳酸菌作為發(fā)酵劑時能加速肉制品中生物胺的生成從而促進其成熟，Zhang Yulong等[6]發(fā)現(xiàn)乳酸菌在臘腸的發(fā)酵過程中具有抗氧化活性，且大量研究也表明葡萄球菌[7]、紅曲菌[8]和戊糖乳桿菌[9]對臘腸品質(zhì)的提升具有顯著影響。傳統(tǒng)臘腸通常采用自然發(fā)酵法，其細菌受環(huán)境影響較大。隨著發(fā)酵的進行及環(huán)境的變化其細菌結構也在不斷發(fā)生變化，而不同的細菌構成對臘腸的風味品質(zhì)有極大影響。目前，對于臘腸的研究主要集中在純種發(fā)酵[10]和抗氧化[11]等方面，而少有關于臘腸發(fā)酵過程中風味品質(zhì)和細菌的變化研究，因此研究臘腸發(fā)酵過程中細菌結構和風味的變化就顯得尤為重要。

電子鼻作為一種仿生設備，能夠模仿人類的鼻子，通過傳感電極準確識別食品中特定的風味物質(zhì)，并給出數(shù)字化的評價，其結果具有準確性好、可重復性高和不受主觀影響等優(yōu)點[12]。目前，電子鼻已經(jīng)廣泛應用于蝦膏[13]和魷魚[14]等發(fā)酵食品的風味品質(zhì)評價中。隨著測序技術的發(fā)展和普及，以Illumina MiSeq測序平臺為代表的第2代測序技術具有檢測速度快和通量高等特點，可以全面、客觀、無偏地了解某一微生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結構[15]，因而被廣泛應用于解析環(huán)境樣品中的微生物多樣性[16]。目前，該技術在臘腸[17]和酸奶[18]等發(fā)酵食中應用廣泛。

本研究采集不同時間點的自制臘腸樣品共計9 個，首先采用電子鼻技術對其風味品質(zhì)進行評價，繼而使用MiSeq高通量測序技術對其細菌多樣性進行解析。通過對發(fā)酵過程的動態(tài)監(jiān)測，以期為臘腸的發(fā)酵工藝改良、發(fā)酵劑菌株的篩選和品質(zhì)改良提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五花肉、八角、香葉、桂皮 市售；食鹽 中鹽東興鹽化股份有限公司；白砂糖 上海上棠食品有限公司；白酒 北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠。

DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒德國QIAGEN公司；DNA 1000試劑盒 美國Agilent公司；5×TransStartTMFastPfuBuffer、FastPfuFly DNA Polymerase、dNTPs Mix 北京全式金生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

PEN3電子鼻 德國Airsense公司；ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司；vetiri梯度基因擴增儀 美國AB公司；R920機架式服務器 美國Dell公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；2100芯片生物分析儀 美國Agilent公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 臘腸樣品的制作與取樣

選取五花肉進行適當修整，絞碎，按原料肉比例添加白砂糖1%、食鹽1.8%、白酒1%、味精0.2%、生抽2%、冰水10%和八角、香葉及桂皮等輔料0.15%與肉攪拌均勻后進行灌腸。臘腸灌制時間為2018年12月14日，灌制好的臘腸置于室外晾曬，遇降雨或降雪則取回室內(nèi)，并于晾曬第1、4、7、10、13、16、19、22、25天時進行采樣，合計9 個樣品。12月中旬至次年1月中旬，湖北省襄陽市每天的平均氣溫約在1～6 ℃之間。

1.3.2 樣品中細菌宏基因組DNA提取

稱取2 g臘腸樣品搗碎后參照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒說明書進行樣品宏基因組DNA提取。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法對宏基因組DNA的質(zhì)量進行檢測[19]。并將檢驗合格的DNA樣本保存于-20 ℃的冰箱中備用。

1.3.3 細菌16S rRNA V3-V4區(qū)聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增和測序

本研究選用細菌16S rRNA V3-V4區(qū)的序列作為目的擴增片段，選用的正、反向引物分別為338F和806R通用引物。以提取的DNA為模板進行PCR擴增，反應體系和條件參照王玉榮等[20]方法。并將DNA樣品的擴增產(chǎn)物使用Illumina MiSeq高通量測序平臺進行測序。

1.3.4 生物信息學分析

根據(jù)Illumina MiSeq高通量測序平臺質(zhì)控規(guī)則對下機序列進行質(zhì)控[20]。本研究使用QIIME（v1.70）平臺對高質(zhì)量的序列進行物種注釋和多樣性分析[21]。主要流程可參照王玉榮等[22]對鲊廣椒細菌多樣性的解析流程。通過GreenGene數(shù)據(jù)庫對高質(zhì)量序列進行同源性比對并構建可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）數(shù)據(jù)矩陣，使用PICRUSt對不同樣本中細菌的基因功能進行預測[23]。

1.3.5 核酸登錄號

本研究所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫，登錄號為mgp90773。

1.3.6 基于電子鼻技術臘腸風味品質(zhì)的評價

參考楊江等[24]方法并進行適當調(diào)整。準確稱取15 g泥狀臘腸樣本于50 mL燒杯中，并用封口膜密封，室溫放置30 min后進行頂空進樣，平行測定3 次。電極響應曲線在50 s后達到平臺期，選用59、60 s和61 s所對應的響應值進行后續(xù)分析。

1.3.7 臘腸水分含量的測定

參考鄒金等[25]方法并進行適當調(diào)整。準確稱取5 g切碎的臘腸樣本于鋁制托盤上，平鋪均勻后選擇鹵素水分測定儀的快速烘干模式進行直接測定。

1.4 多元統(tǒng)計學分析

基于電子鼻測得的數(shù)據(jù)矩陣進行非加權組平均法（unweighted pair-group method witharithmetic means，UPGMA）聚類分析；基于OTU矩陣采用非加權和加權的UniFrac距離主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）和腸型分析對臘腸細菌多樣性進行研究；分別對優(yōu)勢細菌屬（平均相對含量大于1.00%）與風味品質(zhì)評價指標之間的相關性和顯著性進行計算，選取相關系數(shù)絕對值大于0.5、且矯正后P值小于0.05的相關關系，采用Cytoscape軟件進行相關性網(wǎng)絡圖繪制；同時對臘腸樣本中優(yōu)勢細菌屬和代謝通路進行相關性和顯著性分析，并使用熱圖對結果進行可視化。使用R軟件進行相關計算分析，并調(diào)用數(shù)據(jù)包（ggplot2）進行圖形繪制，使用Origin 2017軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵時間臘腸的風味品質(zhì)分析

表 1 不同發(fā)酵時間臘腸風味指標相對強度（n=9）Table 1 Flavor intensity of sausage at different fermentation times (n= 9)

使用電子鼻技術對不同時間點臘腸的風味品質(zhì)進行評價。由表1可知，電子鼻的不同類型傳感器電極對臘腸樣品中的風味物質(zhì)均有很好的響應，能夠準確反映臘腸風味品質(zhì)隨著發(fā)酵時間延長而發(fā)生的變化。W1C、W3C和W5C等對芳香類物質(zhì)敏感的電極隨著發(fā)酵時間的延長，其相對強度呈現(xiàn)出了一定的上升趨勢，W2S、W3S和W6S等對烷烴、乙醇和氫氣敏感的電極則呈現(xiàn)出一定的下降趨勢，而其他電極并沒有明顯的變化趨勢。

2.2 不同發(fā)酵時間臘腸中關鍵風味指標的甄別

在使用電子鼻對臘腸風味品質(zhì)進行研究的基礎上，進一步對臘腸樣本進行聚類分析，使用UPGMA聚類分析對其進行劃分，由圖1可知，當距離為15時，不同發(fā)酵時間的臘腸樣品整體上可劃分為2 個明顯的聚類，其中聚類I包括發(fā)酵時間為1、4 d和7 d的臘腸樣品，而聚類II則是由發(fā)酵時間為10、13、16、19、22 d和25 d的臘腸樣品構成。由此可見，當臘腸發(fā)酵到第10天時，其風味品質(zhì)會發(fā)生較大的變化。值得注意的是，臘腸在發(fā)酵的前10 d中，不同時間點之間的距離較大，而發(fā)酵中后期樣品之間的距離較小。由此亦說明，臘腸在發(fā)酵初期時風味變化較大，而隨著時間延長，臘腸樣品的風味也逐漸趨于穩(wěn)定，從而形成臘腸特有的風味。因此推測臘腸初期發(fā)酵的好壞可能直接影響臘腸成品的風味。

圖 1 基于UPGMA聚類分析的不同發(fā)酵時間對臘腸風味品質(zhì)的影響Fig. 1 Effect of fermentation time on flavor quality of sausages evaluated based on UPGMA cluster analysis

以聚類結果為分組依據(jù)，將9 個時間點的臘腸樣品分為兩組進行研究，便于更好地探究臘腸的最優(yōu)發(fā)酵時間。同時，使用Wilcoxon檢驗對不同分組中10 種電極的風味指標相對強度進行分析，結果如圖2所示。

圖 2 隸屬于聚類I和聚類II臘腸樣品典型風味物質(zhì)的比較分析Fig. 2 Comparative analysis of typical flavor substances belonging to cluster I and cluster II of sausage samples

由圖2可知，隸屬于聚類I的臘腸在W1C、W3C、W5C、W2W、W5S和W1W傳感器的風味指標相對強度均低于隸屬于聚類II的臘腸樣品，而在W6S、W3S、W2S和W1S風味指標則呈相反的趨勢。經(jīng)Wilcoxon檢驗發(fā)現(xiàn)，盡管所有風味指標在兩組中均不存在顯著性差異（P＞0.05），但在芳香類物質(zhì)和烴類物質(zhì)的相對強度上卻存在較為明顯的變化趨勢。

2.3 不同發(fā)酵時間臘腸中細菌多樣性解析

在使用電子鼻對臘腸的風味品質(zhì)進行評價的基礎上，使用MiSeq高通量測序技術對臘腸中的細菌多樣性進行解析。不同發(fā)酵時間臘腸樣品中細菌門和屬的比較分析如圖3所示。

圖 3 不同發(fā)酵時間臘腸中細菌門（A）和屬（B）水平的比較分析Fig. 3 Comparative analysis of bacterial community compositions at phylum (A) and genus (B) levels in sausages at different fermentation times

由圖3可知，在門水平上，臘腸中的細菌主要隸屬于11 個門，其中優(yōu)勢細菌門（平均相對含量大于1%）分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），平均相對含量分別為74.10%、21.91%、1.65%和1.39%。在屬水平上，臘腸中共發(fā)現(xiàn)169 個細菌屬，其中優(yōu)勢細菌屬共計9 個，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter），平均相對含量分別為20.57%、19.69%、16.68%、10.49%、9.12%、5.70%、1.76%、1.66%和1.10%。由此可知，臘腸中的細菌主要是由厚壁菌門和變形菌門構成，其平均相對含量為96.00%。值得注意的是，所有優(yōu)勢細菌屬在9 個臘腸樣品中均有出現(xiàn)，其累計平均相對含量為86.77%。

圖 4 基于OTU矩陣的非加權（A）和加權（B）UniFrac距離PCoA及腸型分析（C）Fig. 4 PCoA of unweighted (A) and weighted (B) UniFrac distance based on OTU matrix and classification of sausages with different fermentation times (C)

進一步對樣品間的細菌群落結構進行解析，結果如圖4所示。不同發(fā)酵時間臘腸在空間排布上存在明顯的分布規(guī)律。如圖4A所示，前5 個時間點的臘腸全部分布在坐標空間的左側，而后4 個時間點的臘腸則全部位于空間右側，且前后時間點的樣品也呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢。由圖4B可知，前3 個時間點的臘腸樣品均分布在Y軸下端，發(fā)酵10 d和13 d的臘腸分布在空間右上角，而后4 個時間點的臘腸則全部集中在右上角。而通過圖4C結果發(fā)現(xiàn)，其與聚類分析和PCoA結果一致。

2.4 臘腸發(fā)酵過程中關鍵細菌的甄別

圖 5 臘腸優(yōu)勢細菌屬和風味指標相關性的網(wǎng)絡圖Fig. 5 Network diagram for the correlation between dominant bacteria and flavor indexes of sausages

進一步使用相關性分析對臘腸中優(yōu)勢細菌屬和風味品質(zhì)之間的關系進行探究，同時對臘腸發(fā)酵過程中的關鍵細菌進行甄別。由圖5可知，有4 個優(yōu)勢細菌屬與4 個風味指標之間存在顯著相關（r＞0.5，P＜0.05）。乳桿菌屬對臘腸風味形成有著較大的作用。研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬與W1S、W2S和W3S之間顯著正相關，葡萄球菌屬與W1S之間顯著負相關，而魏斯氏菌屬和環(huán)絲菌屬與W2W之間存在顯著負相關。發(fā)酵時間對部分優(yōu)勢細菌和水分含量具有明顯的影響，結果如圖6所示。

圖 6 發(fā)酵時間對部分優(yōu)勢細菌和水分含量的影響Fig. 6 Effect of fermentation time on some dominant bacteria and water content

由圖6可知，放線菌門、乳桿菌屬、葡萄球菌屬、節(jié)桿菌屬、水分含量和F/P（Firmicutes/Proteobacteria）隨著發(fā)酵時間的延長均呈現(xiàn)規(guī)律性的變化。乳桿菌屬和水分含量隨著時間延長逐漸下降，葡萄球菌屬呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，而節(jié)桿菌屬、放線菌門和F/P則呈現(xiàn)出上升-下降-上升的變化規(guī)律。經(jīng)Wilcoxon檢驗發(fā)現(xiàn)，以聚類結果為分組依據(jù)，除葡萄球菌屬外均存在顯著性差異（P＜0.05）。值得注意的是，盡管葡萄球菌屬并不存在顯著差異，但其在13 d以后的相對含量迅速增加。

圖 7 差異代謝通路相對豐度的箱型圖（A）和差異代謝通路與優(yōu)勢細菌屬之間的相關性熱圖（B）Fig. 7 Box diagram showing the relative abundances of differential metabolic pathways (A) and correlation heat map between differential metabolic pathways and dominant bacteria (B)

基于PICRUSt軟件進行基因預測，并依據(jù)KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋，結果如圖7所示。通過與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，共注釋到5 類一級功能層，分別為細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝和生物系統(tǒng)。其中與代謝和生物系統(tǒng)相關的代謝通路占比最多，分別為65.02%和15.25%。由圖7A可知，注釋到的223 個代謝通路中有9 條通路在兩組之間存在差異。而與代謝相關的差異代謝通路有6 條，其中光合作用、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、氟苯甲酸鹽降解、淀粉和蔗糖代謝等功能在發(fā)酵前期較為活躍，而卟啉與葉綠素代謝、丙酸代謝等功能在發(fā)酵后期較為活躍。由圖7B可知，葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬、發(fā)光桿菌屬、魏斯氏菌屬和乳桿菌屬均與多條代謝通路存在顯著相關。

3 討論與結論

近年來，隨著仿生設備的發(fā)展和普及，電子鼻因可以對食品中不同類型的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行客觀、準確的數(shù)字化分析而使其在食品風味研究中得到了廣泛應用。本研究采用電子鼻技術對不同發(fā)酵時間臘腸的風味進行了評價。結果發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵的進行，芳香類物質(zhì)的相對強度逐漸上升，而烷烴、乙醇和氫氣等的相對強度逐漸降低。研究發(fā)現(xiàn)[26]，細菌可以代謝產(chǎn)生多種芳香類物質(zhì)，賦予發(fā)酵食品特殊的芳香味，從而形成臘腸特有的芳香氣。通過對臘腸進行聚類分析發(fā)現(xiàn)臘腸依據(jù)其風味指標可明顯分為兩個聚類，且前3 個時間點之間的距離較大，后6 個時間點之間的距離較小。由此說明，在第10天時臘腸的風味品質(zhì)發(fā)生了較大變化。研究認為，臘腸風味形成的時間主要是發(fā)酵初期，并在第10天左右逐漸趨于穩(wěn)定。

在使用電子鼻技術對臘腸中風味品質(zhì)進行評價的基礎上，采用MiSeq高通量測序技術對不同發(fā)酵時間臘腸中細菌多樣性進行解析，結果發(fā)現(xiàn)臘腸中細菌主要由厚壁菌門和變形菌門構成，而在屬水平上主要是由乳桿菌屬、葡萄球菌屬和魏斯氏菌屬等構成。乳桿菌屬是發(fā)酵食品中常見的發(fā)酵菌種，對發(fā)酵過程中揮發(fā)性和非揮發(fā)性風味化合物的代謝有重要的作用，是影響發(fā)酵制品風味的關鍵因素[27-28]；葡萄球菌屬可以促進臘腸的成熟，從而縮短臘腸的制作時間[29]；而魏斯氏菌屬同樣可以縮短發(fā)酵制品的制作時間和提升其風味品質(zhì)[30]。在發(fā)酵過程中，乳酸菌發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸和各種代謝產(chǎn)物，從而使臘腸逐漸成熟完成發(fā)酵過程。對臘腸中細菌的整體結構進行研究，PCoA和腸型分析結果顯示不同發(fā)酵時間臘腸樣品在空間排布上和基于臘腸風味指標的聚類結果相近。由此說明臘腸樣品中的細菌影響臘腸風味品質(zhì)的形成。

此外，本研究通過將優(yōu)勢細菌屬和風味指標進行關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬、葡萄球菌屬和魏斯氏菌屬均與風味指標之間存在顯著相關。由此說明，乳酸菌對臘腸特有風味的形成有重要作用。通過PICRUSt軟件對臘腸中細菌功能進行預測發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵前期淀粉、蔗糖、氟苯甲酸鹽、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝等功能更為活躍，且與乳酸菌之間呈顯著相關。隨著發(fā)酵的開始，乳酸菌大量消耗碳水化合物（淀粉和蔗糖）生成乳酸和各種代謝產(chǎn)物為臘腸風味品質(zhì)的形成奠定基礎。綜上所述，不同發(fā)酵時間臘腸中細菌主要以乳酸菌為主，各種乳酸菌含量的變化也影響臘腸的發(fā)酵成熟和特殊風味的形成。而以細菌和風味指標作為考察依據(jù)反映發(fā)酵時間對臘腸品質(zhì)的影響時，發(fā)酵時間控制在10 d左右，所得的臘腸品質(zhì)較好。